穴位埋線干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠代謝組學(xué)機(jī)制研究

石 娜，張楚穹，歐陽鋼

(1.臨沂市人民醫(yī)院，山東 臨沂 276003；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬淮安市中醫(yī)院，江蘇 淮安 223001； 3.江蘇省老年病醫(yī)院，江蘇 南京 210024)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Post-menopausal osteoporosis，PMOP)在絕經(jīng)后女性的發(fā)病率大約為25%～50%，多發(fā)生在55～70歲或絕經(jīng)后5～10年內(nèi)，以60～65歲為發(fā)病高峰期[1]?；颊呖沙霈F(xiàn)全身乏力、骨痛等癥狀，且易發(fā)生骨折[2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前西醫(yī)治療本病的方法主要是應(yīng)用激素替代療法，但這種治療方法不良反應(yīng)多，且有致癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。穴位埋線對(duì)PMOP的防治有確切的療效，治療機(jī)制多集中于提高骨密度、提高雌激素水平及改善骨代謝生化指標(biāo)等方面[4-6]，而對(duì)信號(hào)通路及分子層面的研究較少。代謝組學(xué)是一門定量測量生物樣品中所有代謝產(chǎn)物組成及其在內(nèi)外刺激[7]下動(dòng)態(tài)變化的科學(xué)，代謝產(chǎn)物水平的高低與機(jī)體發(fā)育、生理和病理狀態(tài)有關(guān)[8]。筆者擬使用代謝組學(xué)觀察與PMOP相關(guān)的代謝產(chǎn)物及代謝通路，并初步探討穴位埋線治療PMOP的靶代謝產(chǎn)物及代謝通路，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性3月齡SD大鼠32只，體質(zhì)量180～200 g，未曾交配，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(浙)：2014-0001]。在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(屏障環(huán)境)喂養(yǎng)，環(huán)境溫度21～25 ℃，濕度40%～60%，光照時(shí)間每日12 h，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食飲水。動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案通過南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查(No.201812A023)。

1.2 造模與分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為A空白組、B假手術(shù)組、C模型組及D埋線組，每組各8只。用3 %戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，局部去毛，取背側(cè)改良切口，切口位于最下肋下緣一橫指，腰椎旁開一個(gè)半橫指位置，二者交點(diǎn)為切口中心，縱行切開0.8～1 cm，于深部脂肪層中可發(fā)現(xiàn)粉紅色卵巢，在子宮角處結(jié)扎后切除卵巢。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，逐層縫合。為防止抗菌藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，術(shù)后不予注射或局部應(yīng)用任何抗菌藥物。大鼠術(shù)后自由攝食、飲水。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 空白組、假手術(shù)組及模型組 正常喂養(yǎng)，不做任何處理。

1.3.2 埋線組 選取大鼠“腎俞”“后三里”進(jìn)行埋線干預(yù)。按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]大鼠常用針灸穴位中的定位方法選取“腎俞”“后三里”?！澳I俞”：第2腰椎下兩旁；“后三里”：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨頭下約5 mm處。用7號(hào)埋線針(高冠牌，生產(chǎn)許可證：蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0244號(hào))，3/0的長約5 mm膠原蛋白線(龍騰生物公司，生產(chǎn)許可證：贛食藥監(jiān)械生產(chǎn)許可證：20160099)進(jìn)行埋線。由助手幫忙固定住大鼠，并將穴位局部皮膚繃緊，術(shù)者右手持針，斜面端朝上，使針尖快速刺透皮膚，刺入到穴位肌肉層時(shí)放置膠原蛋白線，然后將埋線針退出，當(dāng)針體退到皮下時(shí)快速出針并按壓針孔，保證線體置于穴位下的肌肉內(nèi)，皮膚外面不能露出線頭。每次選取單側(cè)“腎俞”“后三里”埋線，雙側(cè)穴位交替，每周埋線1次，連續(xù)治療12周。

1.4 標(biāo)本收集

收集標(biāo)本前1天晚上8點(diǎn)開始禁食，不禁水。第2天使用3 %戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)將大鼠進(jìn)行腹部麻醉后，置于無菌操作臺(tái)上，腹主動(dòng)脈取血后離心血清，置于-20 ℃冰箱保存。戴一次性無菌手套，用無菌鑷子收集大鼠腸管糞便，-80 ℃低溫冰箱保存。大鼠放血致死后，剝離大鼠右側(cè)股骨及脛骨，徹底去除肌肉及肌腱等組織，用生理鹽水紗布包裹后放入EP管中，置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 主要儀器和試劑

1.5.1 儀器 MEDIX90雙能X線骨密度檢測儀(法國奧斯托公司);雷勃爾離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司);Thermo QE質(zhì)譜儀、Thermo Vanquish UHPLC液相色譜、Thermo Hyperil Gold column色譜柱、Thermo ST16R低溫離心機(jī)和RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)。

1.5.2 試劑 戊巴比妥鈉(德國默克公司,中國上海分裝);甲醇、甲酸等(美國Thermo公司);ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 骨密度的檢測 將大鼠離體股骨和脛骨自冰箱中取出，室溫下靜置30 min后，使用MEDIX90雙能X線骨密度檢測儀進(jìn)行骨密度檢測，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出骨密度值。

1.6.2 血液指標(biāo)的檢測 使用酶聯(lián)免疫法測定雌激素含量。按照說明書設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。分別設(shè)定空白孔和待測樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，不能觸及孔壁，輕輕晃勻，除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，用封板膜封板后放至37 ℃溫育60 min；揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每個(gè)孔內(nèi)加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，最后拍干；每個(gè)孔內(nèi)先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；每個(gè)孔內(nèi)加終止液50 μL，終止反應(yīng)；在加終止液后15 min以內(nèi)測定，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

權(quán)頭真上火，不就結(jié)個(gè)婚嗎，怎么弄得跟電視劇似的，今天他想，明天她不想，還有完嗎：“你是現(xiàn)在不想，還是就想跟他吹了？”

1.6.3 代謝組學(xué) (1)樣本處理：①取100 mg大鼠糞便經(jīng)液氮研磨后置于EP管中；②加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋震蕩；③冰浴下靜置5 min；④4 ℃ 15 000 rpm離心10 min；⑤取上清加質(zhì)譜級(jí)水將甲醇含量稀釋至60 %；⑥稀釋后的溶液置于帶有0.22 μm濾膜的離心管中；⑦4 ℃ 15 000 rpm離心10 min；⑧收集濾液，進(jìn)行LC-MS分析。從每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中取等體積樣本混合均勻作為QC樣本；Blank樣本為含有0.1%甲酸的60%甲醇溶液，處理過程與實(shí)驗(yàn)樣本相同。(2)色譜條件：色譜柱：Hyperil gold column(C18)；柱溫：40 ℃，流速：0.2 mL/min。正模式：流動(dòng)相A：0.1%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇。負(fù)模式：流動(dòng)相A：5 mM醋酸銨，pH 9.0；流動(dòng)相B：甲醇。(3)質(zhì)譜條件：掃描范圍選擇m/z 70～1050；ESI源：Spray Voltage：3.2 kV；Sheath gas flow rate：35 arb；Aux Gas flow rate：10 arb；Capillary Temp：320 ℃。Polarity：positive；negative；MS/MS二級(jí)掃描為data-dependent scans。(4)代謝物的鑒定：①將下機(jī)數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入CD搜庫軟件中，進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡單篩選；②對(duì)不同樣品根據(jù)保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 ppm進(jìn)行峰對(duì)齊；③設(shè)置信息：質(zhì)量偏差5 ppm、信號(hào)強(qiáng)度偏差30 %、信噪比3和最小信號(hào)強(qiáng)度100 000；④進(jìn)行峰提取，對(duì)峰面積進(jìn)行定量，整合目標(biāo)離子；⑤通過分子離子峰與碎片離子預(yù)測物質(zhì)分子式；⑥與mzCloud和Chemspider數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，用Blank樣本去除背景離子；⑦歸化定量結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組骨密度、雌激素比較

表1中可見，經(jīng)干預(yù)12周后，模型組大鼠股骨、脛骨骨密度較空白組及假手術(shù)組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，埋線組與模型組比較，骨密度出現(xiàn)一定水平的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組血清雌激素水平與空白組及假手術(shù)組比較明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；埋線組與模型組對(duì)比雌激素水平出現(xiàn)一定水平的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組骨密度及雌激素對(duì)比

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

對(duì)干預(yù)后鑒定到的糞便代謝物進(jìn)行功能和分類注釋，經(jīng)HMDB(Human Metabolome Database)分析，發(fā)現(xiàn)糞便脂質(zhì)、有機(jī)酸、糖類和多酮類化合物、有機(jī)氧化合物、苯型化合物、核苷、核苷酸、生物堿及其衍生品等物質(zhì)含量較高。與脂質(zhì)圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)糞便代謝物中所含的脂質(zhì)主要包括脂肪酸(FA)、聚酮類(PK)、甘油酯(GL)、甘油磷脂(GP)及固醇脂(ST)等。

圖1～4 PLS-DA得分散點(diǎn)圖中，橫縱坐標(biāo)分別代表樣本在第一、第二主成分上的得分。R2Y表示模型的解釋率，Q2Y用于評(píng)價(jià)PLS-DA模型的預(yù)測能力，上述4圖中可見R2Y均>Q2Y，表示模型建立良好。圖1～4中，可見在正負(fù)離子模式下，干預(yù)后CD兩組樣本主成分的得分較BD兩組更為接近。說明模型組與埋線組大鼠去卵巢后代謝物的種類及數(shù)量發(fā)生了的變化，埋線可干預(yù)這一過程。采用PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度值、差異倍數(shù)并結(jié)合T-test的P值可以找到不同組別之間的差異代謝物。

圖5在負(fù)離子模式下，DBC 3組之間共有的差異代謝物有48個(gè)，埋線組與假手術(shù)組之間共有184個(gè)差異代謝物，其中顯著上調(diào)的代謝物有28個(gè)，下調(diào)的有156個(gè)；埋線組與模型組共有136個(gè)差異代謝物，其中顯著上調(diào)的代謝物有7個(gè)，下調(diào)的有129個(gè)。圖6在正離子模式下，DBC 3組之間共有的差異代謝物有12個(gè)，埋線組與假手術(shù)組之間有94個(gè)差異代謝物，其中顯著上調(diào)的代謝物有68個(gè)，下調(diào)的有26個(gè)；埋線組與模型組之間有58個(gè)差異代謝物，其中顯著上調(diào)的代謝物有8個(gè)，下調(diào)的有50個(gè)?？梢姛o論是正離子模式還是負(fù)離子模式下，DB兩組之間共有的差異代謝物數(shù)量都高于DC兩組，說明大鼠去卵巢是干預(yù)代謝物變化的主要原因，埋線可對(duì)代謝物的變化有一定影響。

對(duì)檢測到的差異代謝物繼續(xù)進(jìn)行KEGG富集分析，可以確定不同組之間的差異代謝物行使的主要生物學(xué)功能。在KEGG富集氣泡圖中，X坐標(biāo)為X/Y(對(duì)應(yīng)代謝途徑中不同代謝產(chǎn)物的數(shù)量/該代謝途徑中所識(shí)別出的代謝產(chǎn)物總數(shù))。值越高說明不同代謝物在途徑中的富集程度越高。點(diǎn)的顏色表示超幾何檢驗(yàn)的P值，值越小，檢驗(yàn)越可靠，統(tǒng)計(jì)意義越顯著。點(diǎn)的大小表示對(duì)應(yīng)通路中差異代謝物的數(shù)量，點(diǎn)越大表示通路中差異代謝物越多。

圖7正離子模式下，DB兩組之間差異代謝物富集的KEGG通路主要包括類固醇激素生物合成、皮質(zhì)醇合成與分泌及庫欣綜合征，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，色氨酸代謝、卵巢類固醇生成、醛固酮合成與分泌、卟啉與葉綠素代謝、刺激神經(jīng)的配體與受體相互作用和膽汁分泌等KEGG通路中也有一定富集(P>0.05)。D組與B組相比，糞便孕烯醇酮、色氨酸和膽紅素等差異代謝物顯著上調(diào)，而尿皮質(zhì)醇、黃尿酸和3-hydroxy-5-pregnan-20-one則出現(xiàn)下調(diào)。

圖8負(fù)離子模式下，DB兩組之間差異代謝物顯著富集的KEGG通路包括糖酵解/糖異生、磷酸戊糖通路和維生素B6代謝通路，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，果糖和甘露糖代謝、磷酸肌醇代謝、硫胺素代謝及半乳糖代謝、半乳糖代謝等通路也出現(xiàn)富集，但這些通路富集結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組與B組相比，糞便3-磷酸甘油醛、熊果苷、D-核酮糖-5-磷酸鹽、NPC、前列腺素G2、胞嘧啶核苷、7α-25-二羥基膽固醇和二高-γ-亞麻酸鹽等差異代謝物出現(xiàn)下調(diào)。

圖9正離子模式下，DC兩組之間差異代謝物富集的KEGG通路包括色氨酸代謝和類固醇激素生物合成，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組與C組相比，無上調(diào)的差異代謝物，糞便黃尿酸和苯膽堿酮出現(xiàn)下調(diào)。圖10負(fù)離子模式下，DC兩組之間差異代謝物顯著富集的KEGG通路主要包括血小板活化、亞油酸代謝和5-羥色胺能突觸等，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而花生四烯酸代謝、α亞麻酸代謝、丙酸鹽代謝、視黃醇代謝、硫中繼系統(tǒng)、AMPK信號(hào)通路、壞死性凋亡、血管平滑肌收縮、Fcγ-R介導(dǎo)的吞噬作用、長時(shí)程抑制、GnRH信號(hào)通路、卵巢類固醇生成和不飽和脂肪酸的生物合成等通路也出現(xiàn)富集，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組與C組相比，糞便花生四烯酸、前列腺素G2、二高γ亞麻酸、丁二酸、維生素A、腺苷甲硫氨酸和黃連素等差異代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)。

3 討論

絕經(jīng)后卵巢功能下降和雌激素水平降低是引起PMOP[10]的主要原因。雌激素水平降低可刺激炎癥因子的釋放，從而增加破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[11]。此外，雌激素水平的下降還會(huì)降低骨對(duì)機(jī)械刺激的敏感性，導(dǎo)致類似[12]廢用性骨丟失的病理改變。

穴位埋線是一種集穴位封閉、針刺、刺血和組織治療[13]等多種療效于一體的復(fù)合治療方法。膠原蛋白線在體內(nèi)被軟化、分解和吸收的過程對(duì)穴位起了緩慢的“長效針感”效應(yīng)[14]，也有學(xué)者認(rèn)為其是一種局部炎癥反應(yīng)刺激效應(yīng)[15]。這種刺激可促進(jìn)肌肉合成代謝，降低分解代謝，使肌蛋白、糖類合成增高而乳酸和肌酸分解代謝降低[16]，還可以在大腦皮層功能區(qū)建立新的興奮點(diǎn)，從而調(diào)整神經(jīng)-內(nèi)分泌和胃腸系統(tǒng)，加速新陳代謝[16-17]。有研究表明穴位埋線可明顯改善PMOP患者的臨床癥狀，調(diào)節(jié)激素水平，增加骨密度[18-20]。這與本研究中埋線組大鼠的血清雌激素水平及骨密度均較模型組明顯升高相符，說明埋線對(duì)PMOP有明確的治療作用。

代謝組學(xué)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種能夠全面、快速和簡捷地反映體內(nèi)代謝總體變化的技術(shù)手段，它注重人體內(nèi)部的有機(jī)聯(lián)系以及人體與外在環(huán)境的統(tǒng)一，強(qiáng)調(diào)用動(dòng)態(tài)觀點(diǎn)來研究生物體，從而達(dá)到了解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況的目的[21]。PMOP作為一種代謝性疾病，必然會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)的代謝物類型和濃度及代謝通路的改變[22-24]。

筆者發(fā)現(xiàn)，大鼠去卵巢后糞便脂質(zhì)、有機(jī)酸、糖類和多酮類等化合物含量較多，這與文獻(xiàn)報(bào)道的高血糖、高血脂等糖脂代謝紊亂會(huì)對(duì)骨密度產(chǎn)生負(fù)面影響[25]相符。

研究表明[26-28]，類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成通路與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)，雌激素及雄激素水平的降低均會(huì)增加罹患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。孕烯醇酮是大多數(shù)類固醇激素的主要前體，已被認(rèn)為是一種新的抗骨質(zhì)疏松劑。SUN X等[29]應(yīng)用孕烯醇酮治療卵巢切除術(shù)引起的骨丟失，證明孕烯醇酮可預(yù)防卵巢切除引起的骨質(zhì)疏松癥。庫欣綜合征等疾病會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)醇增多，增多的皮質(zhì)醇會(huì)促進(jìn)蛋白分解，從而使骨基質(zhì)減少，影響鈣的沉著，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。FERRAF等[30]發(fā)現(xiàn)庫欣綜合征患者骨髓肥厚，認(rèn)為這可能是高皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨骼脆弱的標(biāo)志。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，埋線組大鼠與假手術(shù)組相比，主要在類固醇激素生物合成、皮質(zhì)醇合成與分泌、庫欣綜合征、糖酵解和糖異生、磷酸戊糖途徑及維生素B6代謝等通路發(fā)生了顯著變化，說明去卵巢大鼠之所以發(fā)生骨質(zhì)疏松與以上通路密切相關(guān)。糞便中孕烯醇酮、色氨酸和膽紅素等物質(zhì)含量顯著上調(diào)，而尿皮質(zhì)醇、黃尿酸、3-hydroxy-5-pregnan-20-one、3-磷酸甘油醛及5-磷酸核酮糖等則出現(xiàn)下調(diào)。這些代謝物主要通過參與上述代謝通路，導(dǎo)致了PMOP的發(fā)生。

埋線組與模型組相比，發(fā)生顯著變化的通路主要包括色氨酸代謝、類固醇激素生物合成、血小板活化、亞油酸代謝和5-羥色胺能突觸等，證明這是通過埋線干預(yù)PMOP的主要通路，其主要代謝產(chǎn)物包括花生四烯酸和前列腺素。游離的花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶途徑可被催化成前列腺素和血栓素，經(jīng)脂氧合酶途徑可被催化成白三烯和脂氧素[31]。前列腺素和白三烯作為重要的炎性介質(zhì)，可誘導(dǎo)激活炎癥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NF-KВ等，從而刺激破骨細(xì)胞分化形成，對(duì)骨代謝和骨折愈合產(chǎn)生副作用[32]。另外，花生四烯酸還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞膜上RANKL表達(dá)，通過與破骨細(xì)胞上RANK的結(jié)合而促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟、分化和激活，還可通過抑制OPG分泌而增加破骨細(xì)胞作用[33]?？梢?，花生四烯酸通過多種途徑直接或間接地影響骨代謝，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

本研究中，埋線組大鼠糞便中的花生四烯酸、前列腺素G2等代謝物含量較模型組均出現(xiàn)顯著下調(diào)，可見穴位埋線可通過降低花生四烯酸及前列腺素等物質(zhì)的含量以減少或抑制炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。

綜上所述，穴位埋線可顯著提高去卵巢大鼠的雌激素水平及骨密度，這種作用可能主要通過干預(yù)色氨酸代謝、類固醇激素生物合成、血小板活化、亞油酸代謝和5-羥色胺能突觸等通路來實(shí)現(xiàn)。穴位埋線可有效糾正去卵巢大鼠的激素代謝紊亂、糖脂代謝紊亂及色氨酸代謝紊亂等情況，并可通過降低花生四烯酸及前列腺素的含量以減少或抑制炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。因而，筆者認(rèn)為穴位埋線可通過干預(yù)多條代謝通路、多種途徑對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥起到預(yù)防及治療作用，這為臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。而穴位埋線治療PMOP的最佳時(shí)間間隔及療程如何，則需要繼續(xù)深入研究。