生物標(biāo)志物在肺癌早篩早診應(yīng)用中的研究現(xiàn)狀

李輝輝，孫小單，趙沛妍，張爽，程穎

0 引言

最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球約有220.7萬肺癌新發(fā)病例，約有179.6萬肺癌死亡病例[1]。肺癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，早期臨床癥狀通常不明顯，待出現(xiàn)特異性表現(xiàn)時，已錯失治療黃金時期[2]。因此，全球各大醫(yī)療研究機構(gòu)均將肺癌早期篩查作為肺癌防治的重點，并在相關(guān)研究中取得了突破性進(jìn)展。其中，影像學(xué)檢查中低劑量螺旋CT（low-dose computed tomography,LDCT）的篩查價值已被著名的國家肺癌篩查試驗（national lung screening trial,NLST）[3]證實。隨著LDCT在國內(nèi)外的廣泛應(yīng)用，很多問題逐漸突顯出來，包括高危人群的定義標(biāo)準(zhǔn)不一、假陽性率過高、過度診斷及成本效益問題等?，F(xiàn)在，我們迫切需要開發(fā)新的篩查方式來解決LDCT存在的問題，從肺癌發(fā)病機制上著手開展研究，將目光放在生物標(biāo)志物上。近年來“液態(tài)活檢”技術(shù)作為一種非侵入性檢查方式逐漸受到關(guān)注，其在肺癌早篩早診中顯示出了一定的潛力[4]。因此，尋找適合肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物是我們未來需要努力的方向。

1 生物標(biāo)志物用于肺癌早期診斷的研究

1.1 腫瘤標(biāo)志物

腫瘤標(biāo)志物在肺癌的診斷與鑒別診斷中占據(jù)重要地位。據(jù)現(xiàn)有研究表明[5]，肺癌發(fā)病與進(jìn)展過程中，癌胚抗原（CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、胃泌素釋放肽前體（ProGRP）和鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）等為肺癌相對高特異性的腫瘤標(biāo)志物。一項在中國人群中進(jìn)行的以腫瘤標(biāo)志物為研究對象的大規(guī)模多中心研究，成功開發(fā)了肺癌風(fēng)險模型，該模型在肺癌早期診斷中顯示出了很好的預(yù)測效能，并且這些新模型適用于中國高危人群[6]。最新研究顯示[7]，聯(lián)合檢測以上五種腫瘤標(biāo)志物，可彌補單一標(biāo)志物檢測敏感度相對不足的缺點，進(jìn)一步提高了肺癌診斷效能，但早期患者的陽性率（35.29%）明顯低于晚期患者（76.34%）。雖然多項研究都證實了傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物可以輔助診斷肺癌，但對于肺癌早期診斷陽性率較低。

1.2 肺癌相關(guān)自身抗體

肺癌相關(guān)自身抗體的檢測也是當(dāng)前肺癌早期診斷的研究熱點之一。有研究發(fā)現(xiàn)[8]肺癌自身抗體組合在肺癌高危人群中檢測具有高特異性，但敏感度相對較低，這種抗體組合被稱為EarlyCDTLung。為評估EarlyCDT-Lung對肺癌早期診斷的能力，進(jìn)行了一項大規(guī)模前瞻性篩查研究[9]，結(jié)果表明，在偶發(fā)肺結(jié)節(jié)的患者中，使用EarlyCDT-Lung作為輔助手段診斷肺癌與單獨通過CT監(jiān)測此類結(jié)節(jié)相比可獲得更好的成本效益。而最近有研究[10]對EarlyCDT-Lung檢查在高危人群中的價值作了進(jìn)一步的探討，發(fā)現(xiàn)其檢測肺癌的敏感度僅為33%，此研究結(jié)果提示EarlyCDT-Lung檢測尚不可以作為肺癌篩查標(biāo)準(zhǔn)的一部分，暫不適合應(yīng)用在肺癌早期篩查中。7種肺癌自身抗體（7-AAB）是最近研究的熱點，有研究前瞻性的驗證了其對肺癌診斷的價值，特異性為90.2%，陽性預(yù)測值為92.7%，并且根據(jù)7-AAB結(jié)果構(gòu)建了肺癌風(fēng)險預(yù)測諾模圖，該預(yù)測模型在肺癌的診斷中顯示出了巨大的潛力[11]。

1.3 外泌體

近年來關(guān)于外泌體作為新型潛在標(biāo)志物診斷早期腫瘤的研究越來越多。外泌體作為遺傳物質(zhì)的載體，可以實時監(jiān)測腫瘤動態(tài)變化，在肺癌診斷和治療方面均有很好的價值[12]。外泌體通過參與肺癌的多種生物學(xué)過程，影響著腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，從而參與肺癌的形成和進(jìn)展。因此，外泌體相關(guān)研究在推進(jìn)肺癌早期篩查進(jìn)展中具有重要意義[13]。

1.3.1 肺癌相關(guān)的外泌體miRNA miRNA是一類短鏈非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄水平對基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，因此，其可能在肺癌發(fā)病過程中扮演著重要作用[14]。為證明miRNA對肺癌診斷的能力，Jin等[15]應(yīng)用miRNA測序方法對46例Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者和42名健康者進(jìn)行外泌體miRNA圖譜分析，發(fā)現(xiàn)miRNA可以區(qū)分鱗癌和腺癌，其中miR-181b-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p、miR-361-5p是肺腺癌特異性標(biāo)志物，而miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b是肺鱗癌特異性標(biāo)志物。該研究證實了外泌體miRNA在肺癌診斷方面的價值。Kanaoka等[16]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-451a在NSCLC患者中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，在肺癌分期中顯示出了顯著相關(guān)性。另外，有研究報道[17]，miR-660-5p在NSCLS患者血漿中的水平顯著升高，并且miR-660-5p可能通過下調(diào)KLF9促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展，該研究僅證實了KLF9一個靶點，還需要進(jìn)一步研究miR-660-5p發(fā)揮作用的其他機制。Huang等[18]分析從臨床血清標(biāo)本中提取的外泌體發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外泌體miR-34c-3p的水平較健康者明顯降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)低水平miR-34c-3p通過上調(diào)整合素α2β1促進(jìn)NSCLC的侵襲和遷移。因此，外泌體miR-34c-3p參與了NSCLC的發(fā)展，可以作為肺癌早期診斷的標(biāo)志物。Liu等[19]利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-216B能區(qū)分NSCLC患者和正常者，敏感度和特異性分別為86.7%和75.0%，結(jié)果明顯優(yōu)于腫瘤標(biāo)志物（CEA、CYFRA21-1、SCCA），與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測特異性和敏感度均有提高，并且miR-216B低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等密切相關(guān)，該研究證實了外泌體miR-216B可作為NSCLC患者總生存期的獨立預(yù)測因子。最近有研究評估m(xù)iRNA的敏感度和特異性，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-10b、miR-150和miR-223可以作為NSCLC診斷的良好生物標(biāo)志物，而miR-205是診斷鱗狀細(xì)胞癌的特異性生物標(biāo)志物[20]。

1.3.2 肺癌相關(guān)的外泌體蛋白質(zhì) 除miRNA外，外泌體內(nèi)還含有豐富的蛋白質(zhì)。外泌體蛋白攜帶腫瘤特異分子，可以在肺癌發(fā)病早期發(fā)現(xiàn)[21]。有研究[22]對比分析了外泌體蛋白圖譜，發(fā)現(xiàn)有三種外泌體蛋白（CD151、CD171和Tetraspan8）是鑒別肺癌患者與正常者的生物標(biāo)志物，其中CD151、Tetraspan8在肺鱗癌中高度表達(dá)，而CD151可作為小細(xì)胞肺癌特異的蛋白標(biāo)志物。該研究展示了外泌體蛋白作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景，未來還需要進(jìn)一步優(yōu)化外泌體標(biāo)志物模型來驗證外泌體蛋白診斷肺癌的能力。Gao等[23]用ELISA法檢測103例NSCLC患者和29名健康對照者外泌體中TIM-3和Galectin-9的含量，發(fā)現(xiàn)它們在NSCLC患者中高表達(dá)，并且與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等預(yù)后因素呈明顯相關(guān)性。為進(jìn)一步研究外泌體蛋白在肺癌發(fā)生過程中的作用，有研究[24]分析了肺癌來源的外泌體TRIM59蛋白，發(fā)現(xiàn)其通過激活巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌進(jìn)展，癌細(xì)胞與激活的巨噬細(xì)胞相互作用導(dǎo)致NLRP3炎性反應(yīng)體活性失調(diào)，從而驅(qū)動腫瘤的進(jìn)展。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA及外泌體蛋白參與肺癌的發(fā)病過程，有望成為肺癌早期診斷最有前途的液體活檢標(biāo)志物[25]。目前外泌體的分類較多，關(guān)于其研究結(jié)果重疊太少，肺癌特異性外泌體還需要大樣本臨床研究進(jìn)一步探討。

1.4 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）是存在于循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，其來源于腫瘤病灶脫落，可作為肺癌診斷的一種指標(biāo)[26]。在一項研究中[27]，將CTCs分為上皮型（E-）、間葉型（M-）和上皮-間葉型（E&M-）CTC，18例Ⅰ期肺腺癌中有17例可檢測到CTC，其中E-CTCs檢出5例，M-CTCs檢出10例，E&M-CTCs檢出14例，另外20名健康對照組中未發(fā)現(xiàn)CTC，該研究提示早期肺腺癌患者中可檢測到CTCs。Lv等[28]通過檢測NSCLC患者中CTC，發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期與CTC計數(shù)增高顯著相關(guān)，表明通過CTC檢測有利于評估肺癌的發(fā)展情況。Li等[29]采用負(fù)富集-熒光原位雜交（NE-FISH）方法檢測肺癌患者的CTC，結(jié)果顯示，CTC診斷肺癌的敏感度和特異性分別為68.39%和100%，但該研究沒有發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)與肺癌的病理特征有明顯相關(guān)性，之后該研究又聯(lián)合了腫瘤標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的敏感度為78.69%，這提示我們CTC與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可能是未來的發(fā)展方向。一項前瞻性多中心隊列研究的結(jié)果否定了CTC檢測在肺癌早期篩查的價值，該研究應(yīng)用ISET技術(shù)測試CTC診斷肺癌的能力，發(fā)現(xiàn)即使是在肺癌高危人群中，CTC檢測的敏感度也很低[30]。該研究結(jié)果雖然不如預(yù)期的那樣理想，但是并不代表CTC檢測在肺癌早期診斷中沒有可能性，未來我們還應(yīng)使用不同的檢測方法來進(jìn)一步驗證和評估CTC對于肺癌早期診斷的價值。

1.5 循環(huán)游離DNA與循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)游離DNA（circulating free DNA,cfDNA）存在于外周血中，來源于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞），其中把來自腫瘤細(xì)胞的cfDNA稱之為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）[31]。近年來，ctDNA及cfDNA檢測在腫瘤的診斷方面受到了廣泛的關(guān)注，有望為肺癌早期診斷提供可靠的方向[32]。一項前瞻性研究中使用DELFI技術(shù)對365例肺癌高危人群進(jìn)行cfDNA的基因測序，發(fā)現(xiàn)被診斷為肺癌的患者中檢測出大量cfDNA片段突變，之后又在385例非癌癥患者和46例肺癌患者中驗證了該技術(shù)的有效性[33]。另外，還有被開發(fā)出來的新技術(shù)是GRAIL，該技術(shù)通過檢測cfDNA中突變位點或甲基化譜作為陽性信號，其中甲基化譜具有更高的敏感度。GRAIL研究團隊進(jìn)一步探討了cfDNA甲基化信號與多種癌癥預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)布了循環(huán)游離基因組圖譜（circulating cell-free genome）最新數(shù)據(jù)，結(jié)果表明泛癌種早篩（multi-cancer early detection,MCED）沒有檢測出的癌癥比檢測出的癌癥預(yù)后更好[34]。除了泛癌篩查分析的液態(tài)活檢技術(shù)，針對肺癌的基因測序分析方法不斷被開發(fā)出來。有研究采用靶向測序方法檢測58例早期NSCLC患者的血液和腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)在EGFR、KRAS、PIK3CA和TP53中存在ctDNA和組織DNA（tissue DNA,tDNA）的驅(qū)動突變，該研究證實ctDNA突變在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮著不可忽視的作用，并展示了ctDNA檢測在NSCLC診斷中的潛在應(yīng)用價值[35]。之后有研究[36]分析了早期NSCLC患者ctDNA檢測與組織學(xué)類型的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)肺鱗狀細(xì)胞癌ctDNA突變檢出率明顯高于肺腺癌，提示ctDNA檢測與早期NSCLC的組織學(xué)亞型和基因突變相關(guān)，其對早期NSCLC的臨床診斷和組織學(xué)分型具有潛在的優(yōu)勢。這些發(fā)現(xiàn)還需要大樣本前瞻性的研究來驗證。隨著ctDNA檢測技術(shù)的不斷開發(fā)和應(yīng)用，ctDNA的診斷率有了更大的提高[37]。有研究開發(fā)出來一項超敏感的ctDNA分析技術(shù)—CAPP Seq，該技術(shù)可識別95%以上的腫瘤突變，應(yīng)用該技術(shù)分析NSCLC患者的ctDNA，發(fā)現(xiàn)Ⅰ期患者敏感度為50%，Ⅱ～Ⅳ期患者的敏感度為100%，檢測特異性為96%，并且錯誤率可降至0.02%[38]。為進(jìn)一步提高早期患者ctDNA檢測的敏感度，在此成果的基礎(chǔ)上，Chabon等[39]對CAPP Seq進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步開發(fā)了基于NGS和機器學(xué)習(xí)的Lung-CLiP（lung cancer likelihood in plasma）的檢測技術(shù)，為肺癌的早篩早診提供了更敏感的檢測方法，但該方法還需要前瞻性試驗來驗證。ctDNA檢測技術(shù)的進(jìn)步為肺癌早期診斷提供了可能，并且Lung-CLiP檢測技術(shù)有望成為ctDNA檢測的一種新手段，未來該檢測技術(shù)與LDCT結(jié)合可能會進(jìn)一步提高肺癌篩查能力。

1.6 DNA甲基化

近年來隨著對DNA甲基化的深入研究，其已成為用于肺癌早期診斷和預(yù)測治療的新型生物標(biāo)志物。SHOX2甲基化從2010年就開始作為生物標(biāo)志物被國內(nèi)外研究，研究發(fā)現(xiàn)[40]SHOX2基因在許多惡性腫瘤中都異常表達(dá)，并且在肺癌的癌組織中高度甲基化。為進(jìn)一步探討SHOX2甲基化對肺癌診斷的價值，多次研究[41-42]發(fā)現(xiàn)SHOX2和RASSF1A基因在肺癌的進(jìn)展中扮演著重要的角色，并且聯(lián)合檢測可以明顯提高肺癌的診斷效果。DNA甲基化檢測在肺癌早期診斷中發(fā)揮著巨大的潛力，其價值值得我們探討，因此，越來越多的研究者開始開展此類研究，Liu等[43]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿和尿液中CDO1、Tac1、HOXA9和SOX17基因甲基化的檢出率高于對照組，進(jìn)一步提示DNA甲基化水平可以為肺癌的早期診斷提供參考。另外，有研究發(fā)現(xiàn)[44]，DNA甲基化水平升高可促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并提出構(gòu)建基因甲基化模型用于肺癌早期診斷的可能性。為了驗證甲基化模型的價值，基于肺癌患者抑癌基因（FHIT、CDK10、P16、MGMT、RASSF1A、APC、EGFR、DAPK）啟動子CpG島甲基化篩查模型被構(gòu)建出來，發(fā)現(xiàn)以上基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平升高可促進(jìn)肺癌的發(fā)生，該模型可用于肺癌高危人群的早期篩查[45]。綜上，我們已在肺癌患者中發(fā)現(xiàn)多種異常的基因甲基化，并且基于抑癌基因甲基化篩查模型的出現(xiàn)，預(yù)示著DNA甲基化檢測在肺癌早期診斷中具有巨大優(yōu)勢，但未來我們?nèi)孕枭钊胩剿?，找出針對肺癌早期診斷特異的甲基化標(biāo)志物，使甲基化檢測為肺癌早期診斷提供全新的依據(jù)。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在肺癌診斷的應(yīng)用

近年來代謝組學(xué)輔助診斷肺癌已成為研究的熱點，有研究[46]通過使用核磁共振氫譜（1H NMR）評價代謝組學(xué)在肺癌診斷的潛力，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清樣本中表現(xiàn)出特殊的代謝組學(xué)特征，并且早期和晚期代謝組學(xué)特征有顯著差異，這一研究結(jié)果提示通過代謝組學(xué)特征可能有助于區(qū)分NSCLC患者和健康者。為證明代謝組學(xué)是一種很有前途的肺癌診斷技術(shù)，另有研究[47]采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）檢測肺癌患者和對照組的代謝物濃度，分析發(fā)現(xiàn)14種代謝產(chǎn)物（其中包括6種多胺途徑的代謝物）可以正確區(qū)分肺癌患者和健康者。這一研究結(jié)果肯定了代謝組學(xué)在肺癌診斷中的潛在價值。近年來，肺癌在非吸煙女性中的發(fā)病率逐漸上升，為揭示非吸煙女性NSCLC患者血清學(xué)代謝特征，有研究[48]采用假靶向氣相色譜-質(zhì)譜法分析非吸煙女性代謝譜發(fā)現(xiàn)，NSCLC非吸煙患者中共有51條代謝途徑發(fā)生明顯改變，并定義了三種代謝物（半胱氨酸、絲氨酸和單油酰甘油）可作為診斷NSCLC的生物標(biāo)志物組合。這一發(fā)現(xiàn)可能為非吸煙女性肺癌患者的發(fā)病機制提供了線索。為驗證代謝組學(xué)在癌癥高危人群中的診斷價值，有研究[49]分析了參與肺癌篩查研究者的血清代謝組譜，觀察到癌癥患者血清中脂質(zhì)水平降低，特別是膽固醇酯，結(jié)果顯示基于代謝組學(xué)的生物標(biāo)志物既可用于篩選肺癌高危人群，也可用于鑒別良、惡性結(jié)節(jié)，但血清代謝物具有很大的異質(zhì)性。因此，基于代謝組學(xué)的生物標(biāo)志物用于肺癌的早期診斷還需要考慮可能影響血清代謝物水平的其他因素。以上研究都提示了代謝組學(xué)在肺癌早期診斷的潛力，此技術(shù)從代謝水平揭示了肺癌發(fā)生發(fā)展的過程，但由于個體的差異性以及機體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，還沒有找到肺癌特異性表達(dá)的代謝產(chǎn)物，并且現(xiàn)有研究都是小規(guī)模研究，未來我們需擴大研究力度，使代謝組學(xué)技術(shù)成為肺癌早期診斷的新方法。

3 小結(jié)及展望

綜上所述，液態(tài)活檢技術(shù)可以作為肺癌早期診斷的一種輔助手段，這一檢測技術(shù)可改善LDCT篩查肺癌存在的過度診斷和假陽性率過高等問題，并且聯(lián)合檢測可提高肺癌診斷的敏感度和特異性。目前多數(shù)新型生物標(biāo)志物尚處在研究階段，臨床應(yīng)用方面還未發(fā)展成熟。因此，未來我們還應(yīng)從基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)尋找特異生物標(biāo)志物建立肺癌早診模型，使液態(tài)活檢技術(shù)為肺癌篩查和早期診斷提供可靠依據(jù)。隨著新檢測技術(shù)的不斷開發(fā)，生物標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌早期診斷將成為可能。