卵清蛋白-阿拉伯膠聚電解質復合物納米顆粒的制備與表征

邵家起，李康昱，肖軍霞，仇宏偉

(1. 青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島 266109；2. 青島農業(yè)大學學報編輯部，山東青島 266109)

在一定條件下，兩種帶相反電荷的聚電解質之間相互作用能夠形成聚電解質復合物。聚電解質相互作用所形成的復合物沉淀可以顯著提高物質的黏性與界面彈性，但因相互作用過程中通常還伴有疏水相互作用、氫鍵、范德華力等非共價相互作用力，導致反應過程復雜，并受pH值、溫度、混合比例、離子強度等諸多因素影響[1]。據報道，聚電解質復合物在微囊化、Pickering乳液制備、可食性薄膜制備和藥物靶向遞送等方面均有廣泛應用[2-3]。在這些報道中，與傳統(tǒng)的復凝聚法制備微膠囊的方式相比，用聚電解質復合物制備Pickering乳液可以更好地解決常規(guī)乳化劑乳化能力低的問題。特別是近幾年，蛋白質-多糖復合物作為最具潛力的有機Pickering乳液穩(wěn)定劑得到越來越多人的關注[4]。卵清蛋白-海藻酸鈉復合物、殼聚糖-阿拉伯膠復合物、乳清分離蛋白-果膠復合物已被證明具備穩(wěn)定Pickering乳液的能力[5-7]，蛋白質-多糖復合物的穩(wěn)定性、流變學性質、內部結構等因素對Pickering乳液的穩(wěn)定性起著關鍵作用。

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)是雞蛋清的主要蛋白成分，約占雞蛋清質量的65%，分子量44.5 kDa，等電點約4.5，是一種由386個氨基酸組成的球狀蛋白[8]。由于OVA來源廣泛，是食品工業(yè)中常用的一種乳化劑。阿拉伯膠(gum arabic，GA)提取于金合歡樹的滲出物，帶負電荷，是一種呈中性或微酸性且混有鈣、鎂、鉀等陽離子的支鏈雜多糖，具有較高的水溶性、較低的黏度，在水中的溶解度可達50%[9]。由于GA具有乳化、增稠、粘合、起泡等功能性質，常被用于煉乳、口香糖、冰淇淋、糖漿等食品配方中。

聚電解質相互作用是兩種帶相反電荷聚電解質在靜電相互作用下發(fā)生相分離而產生沉淀的現(xiàn)象。目前已有關于OVA-GA聚電解質相互作用的報道：Niu等[10]首先觀察到OVA與GA在一定條件下共存時可以形成可溶性復合物，也可發(fā)生相分離并生成不可溶性復合物；隨后，他所在團隊發(fā)現(xiàn)在總生物聚合物濃度為6 g/L、pH=7.0時，OVA與GA間的靜電相互作用對復合物穩(wěn)定的常規(guī)乳液的pH穩(wěn)定性不利[11]。但目前關于利用OVA和GA的相互作用制備聚電解質復合物納米顆粒并用來穩(wěn)定Pickering乳液的研究暫未見報道。

為探究OVA-GA聚電解質復合物納米顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的能力，本文研究了OVA與GA質量比、溫度、離子強度、靜置時間等條件對OVA與GA相互作用的影響，確定形成OVA-GA聚電解質復合物的最適條件，觀察復合物靜置不同時間后的外觀和濁度變化，通過檢測復合物粒徑和ζ電勢來評價復合物的穩(wěn)定性，利用光學法微流變儀研究復合物的黏彈性，以探討復合物的界面性質。本文研究結果可為OVA-GA聚電解質復合物納米顆粒應用于穩(wěn)定O/W型Pickering乳液提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

OVA，生物試劑，購自上海瑞永生物科技有限公司；GA，生物試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司；紫蘇籽油，食品級試劑，購自河南家豐植物油有限公司；其他試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

UV-2000紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；Nano ZS90馬爾文動態(tài)光散射儀，英國馬爾文儀器有限公司；DSA100光學接觸角測定儀，德國KRüSS公司；Rheolaser Master光學法微流變儀，法國Formulaction儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 OVA-GA復合物制備條件的優(yōu)化

分別稱取一定量OVA和GA粉末溶解于去離子水中，室溫磁力攪拌8 h至完全溶解，配制1 g/L的OVA溶液和GA溶液。作者前期的研究表明，OVA與GA形成復合物的最適pH值為3.5，因此，混合前使用0.1 mol/L HCl溶液分別調節(jié)OVA溶液和GA溶液的pH值至3.5。參考Zhang等[12]的方法，將OVA與GA溶液按一定體積混合，使兩者的質量比分別達到4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3或1∶4，添加一定濃度的NaCl溶液，使NaCl濃度分別達到0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L，然后在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃或80 ℃不同溫度下反應20 min，即得OVA-GA聚電解質復合物。用數碼相機拍攝反應體系的外觀，用紫外可見分光光度計測定復合物溶液在波長600 nm處吸光值(OD600值)。

1.2.2 OVA-GA聚電解質復合物的表征

1.2.2.1 穩(wěn)定性的測定

將在最適條件下制備的OVA-GA聚電解質復合物懸浮液靜置0 min、1 min、3 min、5 min、10 min，觀察外觀，測定OD600值，并使用馬爾文動態(tài)光散射儀測定復合物的粒徑和ζ電勢。

1.2.2.2 黏彈性的測定

取4 mL在最適條件下新制備的OVA-GA聚電解質復合物溶液，排凈氣泡，添加到光學法微流變儀樣品瓶后立即放入樣品室中。設定測量時間700 s，測量溫度25 ℃，測量模式Gelation。利用軟件Rheolaser Master 1.4.0.0計算復合物溶液彈性指數和宏觀黏度指數。

1.2.2.3 三相接觸角的測定

參考Wang等[13]的方法并稍作修改。將OVA-GA聚電解質復合物溶液在25 ℃以6 000 r/min轉速離心10 min，取沉淀凍干。使用紅外壓片機將凍干粉末壓制成厚度1 mm、直徑10 mm的光滑薄片后，浸入盛有紫蘇籽油的方形透明玻璃器皿中。使用高精度注射器將2 μL去離子水滴加在薄片表面，平衡后，使用高速攝像機拍攝液滴圖像，并利用LaPlace-Young方程擬合液滴輪廓，計算三相接觸角。

1.2.2.4 界面張力的測定

使用光學接觸角測量儀，采用懸滴法測定OVA-GA聚電解質復合物溶液與紫蘇籽油之間的界面張力。當1滴OVA-GA聚電解質復合物溶液從注射器尖端浸入到方形透明玻璃器皿上的紫蘇籽油中時，形成油水界面?；谳S對稱液滴形狀分析，采用LaPlace-Young方程擬合并計算界面張力。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次，數據以“平均值±標準誤差”形式表示。利用軟件SPSS Statistics 25的單因素方差分析法評估平均值之間的差異，P<0.05表示存在顯著性差異。利用軟件Origin 2019和軟件Visio 2019進行圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 OVA與GA質量比對OVA-GA復合物形成的影響

由圖1可知，OVA與GA質量比對兩者混合溶液的分散狀態(tài)有重要影響。OVA與GA質量比分別為4∶1、3∶1、2∶1時，OVA-GA復合物溶液在靜置后逐漸由渾濁變?yōu)槌吻澹o置20 min時，樣品瓶底部出現(xiàn)大量有較高黏度的沉淀。OVA與GA質量比為3∶2時，反應體系有部分沉淀生成，濁度仍然較高，說明還有大量的復合物處于懸浮狀態(tài)。OVA與GA質量比為1∶1或2∶3時，反應體系穩(wěn)定，復合物顆粒處于懸浮狀態(tài)，這與Niu等[10]的研究結果一致。由圖1還可以看出，隨著反應體系中GA占比的升高，溶液濁度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在OVA與GA質量比為3∶2時溶液濁度升至最大，而在OVA與GA質量比為1∶2、1∶3、1∶4時溶液濁度幾乎降為0。溶液濁度的變化與復合物外觀的變化相對應，這說明當體系中的GA達到飽和后，過量的GA抑制了OVA與GA相互作用，這與豌豆分離蛋白-殼聚糖復合物溶液的濁度隨殼聚糖濃度的升高而降低的趨勢一致[14]。因此，選擇OVA與GA質量比為1∶1和3∶2的體系進行后續(xù)研究。

圖1 OVA與GA質量比對OVA-GA復合物外觀(A)和

2.2 溫度對OVA-GA復合物形成的影響

OVA與GA質量比為3∶2和1∶1時，溫度對OVA-GA聚電解質復合物的影響結果見圖2。溫度從25 ℃升至50 ℃，2個質量比條件下制備的OVA-GA聚電解質復合物的外觀與溶液濁度均沒有顯著變化，但隨著溫度的進一步升高，復合物溶液的濁度均略有升高。Zhang等[12]在研究OVA和高甲氧基果膠的相互作用時也觀察到類似現(xiàn)象：25 ℃和35 ℃ 2個溫度條件下，OVA-高甲氧基果膠復合物溶液的濁度差異不顯著，但隨著溫度繼續(xù)升高，差異顯著增加，75 ℃時濁度達到最大。除靜電相互作用之外，OVA與GA之間還有疏水相互作用、范德華力和氫鍵等。通常疏水相互作用需要較高的溫度，因此，溫度升高到80 ℃時OVA-GA復合物溶液濁度增加，可能是因為OVA與GA之間的疏水相互作用增強。此外，高溫會引起OVA熱變性：Zou等[15]的研究結果顯示，OVA在60 ℃時開始變性，變性溫度為81.92 ℃。熱變性會引起蛋白質折疊結構的改變以及疏水基團的暴露，從而降低OVA的溶解度[16]，這也可能影響復合物溶液的濁度。綜上所述，考慮到高溫下OVA蛋白可能發(fā)生變性，后續(xù)試驗選擇在25 ℃條件下進行。

圖2 溫度對OVA-GA復合物外觀(A)和

2.3 離子強度對OVA-GA復合物形成的影響

由圖3可知，OVA與GA質量比為3∶2和1∶1時，隨著NaCl濃度的增加，復合物溶液外觀逐漸澄清，濁度減小，這是因為體系中的鹽離子對蛋白質和多糖分子上的電荷產生屏蔽作用，明顯影響了聚電解質復合物的形成[17]。這一結果可證實靜電相互作用是OVA和GA之間的主要作用。此外，該結果還與Ru等[18]在牛血清白蛋白-果膠復合物體系中觀察到的結果一致：在與帶負電荷的果膠相互作用時，隨著鹽離子濃度的增加，牛血清白蛋白攜帶的正電荷越多，它與果膠形成復合物的趨勢就越弱。綜上所述，鹽離子的存在能抑制OVA和GA之間的相互作用，后續(xù)試驗不再添加NaCl。

圖3 離子強度對OVA-GA復合物外觀(A)和

2.4 OVA-GA復合物的貯藏穩(wěn)定性分析

圖4為靜置0～20 min，OVA-GA聚電解質復合物溶液的外觀、濁度、粒徑、ζ電勢的變化結果。由圖4A、圖4B可知，隨著靜置時間的延長，OVA與GA質量比為3∶2的復合物溶液濁度呈逐漸下降趨勢，靜置10 min時穩(wěn)定。這與孫燕婷等[19]的研究結果一致。由圖4C、圖4D可知，隨著靜置時間的延長，OVA與GA質量比為3∶2的復合物粒徑逐漸增大，ζ電勢的絕對值逐漸減小。這說明復合物正在不斷聚集，且在靜置10 min后達到飽和。而OVA與GA質量比為1∶1的復合物溶液外觀、濁度、粒徑和ζ電勢在靜置20 min內均沒有顯著性變化，說明OVA與GA質量比為1∶1時體系較為穩(wěn)定。這是因為OVA與GA質量比為1∶1時，體系的ζ電勢絕對值較高，粒子間的靜電斥力較大，不易發(fā)生聚集。另外，OVA與GA質量比為1∶1時，聚電解質相互作用程度較低，體系中生成的OVA-GA復合物較少。根據圖4C，OVA與GA質量比為1∶1的復合物粒徑為367 nm，遠低于質量比為3∶2的復合物粒徑(1 067 nm)，而粒徑較小的復合物可以增加顆粒在油水界面吸附的比表面積，穩(wěn)定Pickering乳液的能力更強[20]。

圖4 靜置時間對OVA-GA復合物外觀(A)、濁度(B)、粒徑(C)、ζ電勢(D)的影響

2.5 黏彈性分析

與傳統(tǒng)的剪切流變學技術相比，光學法微流變技術可以在保持膠體體系靜止狀態(tài)時，通過測量復合物彈性指數和宏觀黏度指數來表征和量化復合物的微觀彈性和表觀黏度[21]。根據OVA與GA質量比為1∶1和3∶2時復合物彈性指數和宏觀黏度指數的測量結果(圖5)可知，復合物的彈性指數遠高于OVA或GA的彈性指數，表明OVA與GA之間的相互作用有助于提高復合物的微觀彈性。Li等[22]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。此外，相較于質量比為3∶2的OVA-GA聚電解質復合物，質量比為1∶1的復合物具有更高的彈性指數，說明復合物具有更突出的固體屬性。這種現(xiàn)象可能與復合物的組成和結構有關：多糖占比較大時，顆粒表面會形成較厚的界面層，阻止復合物顆粒聚集。這有助于復合物穩(wěn)定Pickering乳液并形成更致密的彈性界面。

由圖5還可以看出，OVA-GA聚電解質復合物溶液的黏度高于OVA或GA溶液的黏度。這是因為OVA與GA的相互作用形成一種具有凝膠性質的網狀結構[21]。另外，OVA與GA質量比為3∶2的OVA-GA聚電解質復合物的黏度更高，而且隨著時間的延長，復合物黏度還會進一步升高，這是因為OVA與GA質量比為3∶2時，體系的相互作用較強，且這種相互作用能使復合物發(fā)生聚集，形成更加致密的凝膠網絡。

圖5 彈性指數(A)和宏觀黏度指數(B)

2.6 三相接觸角分析

三相接觸角可以反映固體顆粒的親水性和疏水性，三相接觸角接近90°，表明固體顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的能力較強。由圖6可知，OVA與GA質量比為1∶1和3∶2的復合物三相接觸角均小于90°，說明復合物具有穩(wěn)定O/W型Pickering乳液的能力。其中質量比為1∶1的復合物接觸角(81.3°)遠大于質量比為3∶2的復合物，說明質量比為1∶1的復合物穩(wěn)定Pickering乳液的能力更強。另外，OVA與GA質量比為1∶1的復合物的三相接觸角大于杏仁膠-乳清蛋白復合物的(58°)[23]，大于乳清蛋白-低甲氧基果膠復合物的(59.8°)[24]，大于花生多糖-蛋白質復合物的(65.1°)[25]。因此，質量比為1∶1的OVA-GA聚電解質復合物具有穩(wěn)定Pickering乳液的潛力。

A. OVA；B. GA；C. OVA與GA質量比1∶1；D. OVA與GA質量比3∶2。

2.7 界面張力分析

OVA-GA復合物溶液與油相之間的界面張力可以反映復合物制備Pickering乳液的穩(wěn)定性。根據不可逆吸附理論，固體顆粒分散體系與油滴之間的界面張力越大，形成的Pickering乳液破乳所需的解析能越大，即Pickering乳液越穩(wěn)定[26]。由圖7可知，與OVA溶液或GA溶液相比，OVA-GA復合物溶液與油滴之間的界面張力較大，說明固體顆粒的形成加劇了油滴的收縮。OVA與GA的質量比對體系與油滴之間的界面張力有顯著影響，質量比為1∶1時復合物溶液與油滴之間的界面張力更大，這進一步說明OVA與GA質量比為1∶1的復合物更適合作為Pickering乳液的乳化劑，這與Zhou等[27]的結論一致，即玉米醇溶蛋白和果膠之間的相互作用影響玉米醇溶蛋白-果膠復合物顆粒在界面的吸附行為和界面結構的形成。

A. OVA；B. GA；C. OVA與GA質量比1∶1；D. OVA與GA質量比3∶2。

3 結論

探究了OVA與GA相互作用規(guī)律，并對制備的OVA-GA聚電解質復合物納米顆粒的穩(wěn)定性、黏彈性和界面性質進行了表征。結果表明，OVA與GA的靜電相互作用有效提高了OVA或GA的黏彈性和乳化能力。OVA與GA質量比為3∶2的體系具有更強的相互作用，而OVA與GA質量比為1∶1時能形成聚電解質復合物納米顆粒，具備更高的彈性和更大的界面張力，三相接觸角接近90°，能構成更穩(wěn)定的OVA-GA體系，穩(wěn)定Pickering乳液的能力更強。因此，OVA-GA聚電解質復合物納米顆粒是一種有潛力的Pickering乳液穩(wěn)定劑，研究結果為開發(fā)新型食品基料、拓展OVA的應用領域開辟了新途徑。