通絡(luò)解毒湯對糖尿病腎病大鼠抗氧化通路的作用機(jī)制

魏華娟，趙然然,李世媛,多慧玲,霍浩然

(1.石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊050003)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是一種常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年全球約有4.22億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2040年將增至6億，其中約30%發(fā)展為DN[1]。DN 的主要特征性變化包括腎小球基底膜增厚、進(jìn)行性腎功能不全和持續(xù)性蛋白尿，其發(fā)生發(fā)展與糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥、高血糖誘導(dǎo)的晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)生成等多種因素有關(guān)[2-3]。胡雅國等[4]發(fā)現(xiàn)，高血糖可促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生并提高大鼠氧化應(yīng)激水平，加重腎損傷。轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶1(Heme oxygenase-1，HO-1)通路是一條經(jīng)典的抗氧化通路，與 DN的發(fā)展關(guān)系密切[5]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常通過控制血糖與血壓、運(yùn)動(dòng)、透析等方式抑制DN的發(fā)展，但治療效果欠佳，DN導(dǎo)致終末期腎病的比例仍然很高。

中醫(yī)有記載DN的文獻(xiàn)，可追溯到漢代。經(jīng)過長期的實(shí)踐，醫(yī)者對DN的發(fā)展有了更深入的認(rèn)識，并提出了其發(fā)病機(jī)制的演變。在中醫(yī)的反復(fù)實(shí)踐中，以“一陽”理論作為中國古代哲學(xué)，闡明了以陰陽平衡為代表的人體健康。中醫(yī)專家推測，DN的病位在腎，與肝脾功能失調(diào)密切相關(guān)，本病的性質(zhì)是本虛標(biāo)實(shí)，濕、血瘀、痰三者并存，使病情遷延難愈。中醫(yī)藥在防治糖尿病并發(fā)癥方面具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢[6]。本項(xiàng)目于前期研究中觀察到，通絡(luò)解毒湯治療原生性系膜增生性腎小球腎炎的療效較好，為進(jìn)一步觀察通絡(luò)解毒湯對DN的作用機(jī)制，本研究通過構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，以不同劑量通絡(luò)解毒湯灌胃，旨在從分子水平闡述該方藥對DN的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級雄性SD大鼠[合格證號SCXX(滬)2013-0016]40只，平均體重(200±20)g,購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有大鼠均飼養(yǎng)于石家莊市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～24 °C，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由獲取標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物和水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：通絡(luò)解毒湯由石家莊市中醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一制備，符合中華人民共和國藥典要求。通絡(luò)解毒湯組成：黃芪20 g，僵蠶、地龍、烏梢蛇各10 g，丹參、紅花、金銀花、土茯苓各15 g，大黃6 g，常規(guī)煎煮濃縮后備用。BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號062521211026，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，鏈脲佐菌素(批號S0130，美國Sigma公司)，SIRT1一抗(批號AB189494，Abcam公司)，HO-1一抗(批號MD4719，北京MDL公司)，Nrf2一抗(批號0072280202，美國Abclonal公司)，血肌酐(Serum creatinine，Scr)試劑盒(批號C011-1-1，南京建成生物工程研究所)，尿氮素(Blood urea nitrogen，BUN)試劑盒(批號C013-2-1，南京建成生物工程研究所)，HE染色套裝(批號G1003，中國 Servicebio公司)。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號BIO-Rod450，美國貝爾公司)，高速低溫離心機(jī)(型號CR22GⅡ，日立公司)，熒光定量Real-time PCR儀(型號CFX，美國Bio-Rad公司)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(型號Gel Doc XR+，美國Bio-Rad公司)，熒光成像掃描儀(型號Licor Odyssey，上海Gene公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、建模及給藥：雄性SD大鼠40只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、通絡(luò)解毒湯低劑量組、通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組，每組8只。對照組大鼠喂食普通食物(3.51 kcal/g)，其他大鼠喂食高脂食物(4.43 kcal/g)，持續(xù)4周。所有大鼠禁食12 h后，于大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg(用0.1 mol/L的pH 4.3檸檬酸鈉溶液稀釋至1%)，在30 min內(nèi)完成注射。同時(shí)，對照組大鼠注射相應(yīng)體積的檸檬酸鈉溶液。72 h后，采集大鼠尾靜脈血，用 Accu Chek 血糖儀測量血漿葡萄糖濃度，若血糖水平≥16.7 mmol/L，則視為糖尿病大鼠造模成功。4 周后收集所有糖尿病大鼠尿液，若 24 h 尿蛋白>30 mg，則視為DN大鼠造模成功。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]換算人-大鼠的通絡(luò)解毒湯口服標(biāo)準(zhǔn)劑量為 18.13 g/(kg·d)。在本實(shí)驗(yàn)中，通絡(luò)解毒湯低劑量組每只大鼠的灌胃劑量為18.13 g/(kg·d)；通絡(luò)解毒湯中劑量組每只大鼠的灌胃劑量為36.26 g/(kg·d)；通絡(luò)解毒湯高劑量組每只大鼠的灌胃劑量為72.52 g/(kg·d)。灌胃12周后嚴(yán)格記錄大鼠體重、飲水量、進(jìn)食量、空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。

1.2.2 腎功能和組織學(xué)檢測：灌胃12周后，采用2.5 ml/kg的2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，下腔靜脈取血，收集血清，放入-80℃保存，采用ELISA試劑盒檢測BUN、Scr水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作。隨后，摘除大鼠雙腎并記錄腎重，將腎組織切片并用4%甲醛固定24 h，按照常規(guī)方案脫水并包埋在石蠟中。石蠟包埋后，4 μm 厚的切片在室溫下用蘇木精染色 3 min，在光學(xué)顯微鏡下用伊紅染色 60 s。

1.2.3 Western blotting法檢測SIRT1、Nrf2和HO-1的表達(dá)：使用核提取試劑盒從腎組織中提取細(xì)胞質(zhì)、核蛋白。Western blotting法檢測SIRT1、Nrf2和HO-1的表達(dá)。GAPDH用作細(xì)胞質(zhì)蛋白的內(nèi)部上樣對照。Lamin B用作核蛋白的內(nèi)部上樣對照。蛋白質(zhì)含量由BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定。通過在SDS/PAGE上電泳分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下用適當(dāng)?shù)囊豢?1∶1000稀釋抗SIRT1和抗HO-1抗體，1∶500稀釋抗Nrf2抗體)孵育過夜，分別用合適的二抗在室溫下孵育1 h。通過使用Odyssey熒光成像掃描儀檢測免疫復(fù)合物，并使用Odyssey軟件v3.0.29成像分析系統(tǒng)對條帶密度進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s法；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠12周后體重、飲水量、進(jìn)食量比較 見表1。4周后，模型組、通絡(luò)解毒湯低劑量組、通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組大鼠均出現(xiàn)明顯的糖尿病特征，包括高血糖、多飲、多食和體重減輕。通絡(luò)解毒湯灌胃12周后，與模型組大鼠比較，通絡(luò)解毒湯低劑量組、通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組大鼠的體重顯著升高，飲水量、進(jìn)食量降低；通絡(luò)解毒湯高劑量組飲水量、進(jìn)食量均低于通絡(luò)解毒湯低劑量組，且飲水量少于通絡(luò)解毒湯中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠12周后體重、飲水量、進(jìn)食量比較

2.2 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)比較 見圖1。對照組大鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管排列致密，腎小球毛細(xì)血管分界，輪廓完整清晰，黑色箭頭所指為腎小球系膜區(qū)增生。模型組大鼠腎小管病理改變包括腎小管上皮細(xì)胞腫脹、刷狀緣缺失、間質(zhì)擴(kuò)張、腎小管間出血、空泡變性、腎小管壞死、管型形成等。與模型組比較，通絡(luò)解毒湯低劑量組、通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組大鼠腎小球、腎小管、腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)排列較整齊，腎小球系膜區(qū)增生、腎小球體積增大等情況均有改善。

A：對照組；B：模型組；C：通絡(luò)解毒湯低劑量組；D：通絡(luò)解毒湯中劑量組；E：通絡(luò)解毒湯高劑量組

2.3 各組大鼠FBG、Scr、BUN水平比較 見表2。與模型組大鼠比較，通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組大鼠的FBG、Scr、BUN水平均低；通絡(luò)解毒湯高劑量組大鼠的FBG、Scr、BUN水平均低于通絡(luò)解毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠FBG、Scr、BUN水平比較

2.4 各組大鼠SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，通絡(luò)解毒湯低劑量組、通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均升高(圖2)。

A：對照組；B：模型組；C：通絡(luò)解毒湯低劑量組；D：通絡(luò)解毒湯中劑量組；E：通絡(luò)解毒湯高劑量組

3 討 論

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)與中醫(yī)“消渴”相同，最早的病因病機(jī)記載可追溯到《內(nèi)經(jīng)》?！鹅`樞》記載：“人五臟虛弱，易患消渴?！?先天稟賦不足是導(dǎo)致糖尿病的重要內(nèi)因。《素問》記載：“常食甘美肥膩之物，易生內(nèi)熱。”甜味易引起腹脹，影響脾胃功能，則濕熱上溢。飲食不規(guī)律、腸胃內(nèi)熱、陰傷為主要病機(jī)，“消渴”根據(jù)病位、病機(jī)、癥狀的不同分為多種證型，其中腎陰不足證對應(yīng)于DN?！妒?jì)總錄》記載：“本病的病因是精血不足，腎陰不足。”患者經(jīng)?？是箫嬎@些水被輸送到膀胱，導(dǎo)致大量尿液，其他癥狀還有小腿肌肉萎縮、關(guān)節(jié)疼痛，故本病又稱“小腎”。DN的中醫(yī)病機(jī)以本虛(脾腎)、虛實(shí)(血瘀、水濕、痰濁)為主，病理為痰瘀互結(jié)。早期病變?yōu)闅怅巸蓚?、肝而腎虛，血瘀阻隔，則陰虛引起陽虛，脾腎不足，造成水潴留，溢于皮膚[8]。此階段水滯聚，因腎陽衰。由于潮濕的毒素會攻擊胃和心臟，因此出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，脾虛是DN的關(guān)鍵病因，腎氣虧虛是DN的病根，血瘀參與DN的整個(gè)病程。

DM患者常處于高凝狀態(tài)，長期高凝狀態(tài)是腎功能受損的重要原因，DM 患者血栓形成的發(fā)生率較高。當(dāng) DN 出現(xiàn)蛋白尿時(shí)，血漿中凝血因子的活性較高，因此DN的發(fā)生是因糖尿病病程長，導(dǎo)致脾腎兩虛，水濕不能運(yùn)化，造成上溢，患者常有“瘀血”癥狀，如高脂血癥、高黏血癥、微循環(huán)障礙等，因此治療應(yīng)以健脾補(bǔ)腎、益腎活血化瘀為主[9]。本研究所用的通絡(luò)解毒湯是臨床上長期治療DN的經(jīng)驗(yàn)方，由蟲類通絡(luò)藥、活血化瘀藥、解毒藥組成，以清熱解毒、祛瘀通絡(luò)為組方原則。方中僵蠶、地龍、烏梢蛇性喜走竄，入絡(luò)搜剔；丹參、紅花活血通脈，發(fā)揮活血化瘀、涼血之功，助僵蠶、地龍、烏梢蛇溝通腎絡(luò)；金銀花清熱解毒，斷毒邪生成之源；土茯苓清熱除濕，大黃通腑祛瘀，二者滌瑕蕩穢，泄?jié)峤舛荆痼w內(nèi)積聚之毒分走前后二陰；黃芪益氣扶正，既可助通絡(luò)藥逐瘀，暢通腎絡(luò)，又防止通絡(luò)解毒藥損傷正氣，為君藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪中的兩種主要異黃酮、花萼甙、花萼甙-7-O-β-D-葡萄糖苷，可抑制HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞早期增殖和AGEs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示這兩種異黃酮具有預(yù)防DN進(jìn)展的作用[10-11]。此外，黃芪中的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅰ，在糖尿病模型中具有抗氧化、抗炎作用，這些化學(xué)物質(zhì)可以預(yù)防和恢復(fù)與氧化應(yīng)激相關(guān)的腎組織損傷。黃芪甲苷還可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增加足細(xì)胞完整性，是減少蛋白尿的治療靶點(diǎn)。本研究通過觀察各組大鼠腎組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，三組給藥大鼠腎損傷情況有所改善，通絡(luò)解毒湯中劑量組和通絡(luò)解毒湯高劑量組大鼠的FBG、Scr、BUN水平均高于對照組、模型組，說明通絡(luò)解毒湯在一定程度上能降低血糖，減輕腎損傷，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖，保護(hù)腎功能的作用，體現(xiàn)多靶點(diǎn)復(fù)合調(diào)節(jié)特點(diǎn)。

SIRT1是一種去乙?；?，可通過去乙?；罨湎掠蔚腜GC-1α、p53等多種蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、氧化應(yīng)激、能量穩(wěn)態(tài)過程[12-13]。Nrf2是抗氧化防御系統(tǒng)中的主要調(diào)節(jié)因子之一，可減少氧化應(yīng)激、炎癥刺激、細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡[14]。Nrf2的下游信號分子包括HO-1、醌氧化還原酶1和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基。由位于啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子區(qū)域的順式調(diào)節(jié) DNA 序列編碼的抗氧化反應(yīng)元件介導(dǎo) Nrf2對下游分子的調(diào)節(jié)[15-16]。細(xì)胞損傷后，Nrf2 易位至細(xì)胞核并促進(jìn) HO-1 的表達(dá)[17-19]。SIRT1也可以促進(jìn) Nrf2 的激活，增加其核積累、DNA 結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性，以及上調(diào) HO-1 的表達(dá)[20-22]。大量研究表明，Nrf2 信號通路在 DN 發(fā)展中的重要性，NRF2 激活成為 DN 預(yù)防的潛在策略[23-25]。本研究中，通絡(luò)解毒湯低劑量組、通絡(luò)解毒湯中劑量組、通絡(luò)解毒湯高劑量組SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均升高，這可能與通絡(luò)解毒湯上調(diào) SIRT1 表達(dá)，激活 Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)，該方藥能增強(qiáng)糖尿病腎病大鼠抗氧化應(yīng)激損傷能力。

綜上，通絡(luò)解毒湯通過上調(diào)SIRT1表達(dá)，激活 Nrf2/HO-1信號通路，減輕糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腎功能。