外周組織活檢病理在帕金森病診斷中的應(yīng)用

朱嘯巍 鐘 平 欒興華

1）安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院，安徽 宿州 234000 2）上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海 200233

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見(jiàn)于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)平衡障礙為主要特征，也可出現(xiàn)睡眠障礙、嗅覺(jué)障礙、自主神經(jīng)功能障礙、認(rèn)知和精神障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀。由英國(guó)醫(yī)師PARKINSON 于1817 年首先報(bào)道并系統(tǒng)描述［1］。PD主要的病理特征是在殘留的神經(jīng)元胞漿內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體（Lewy bodies），其中α-突觸核蛋白（α-synuclein）是形成路易小體的重要成分，分布于大腦、脊髓、頜下腺、腸神經(jīng)、皮膚等［2］。

α-synuclein是一種小分子胞內(nèi)蛋白，由140個(gè)氨基酸組成，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在生理?xiàng)l件下可調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)，并且通過(guò)囊泡運(yùn)輸影響突觸前的信號(hào)和膜運(yùn)輸，其錯(cuò)誤折疊和聚集可在PD 發(fā)病過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。已有大量的臨床和臨床前證據(jù)證實(shí)錯(cuò)誤折疊的α-synuclein 參與了PD 的發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的α-synuclein 沉積形成路易小體，導(dǎo)致PD的發(fā)生，α-synuclein在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦干、前腦、錐體外系和大腦皮質(zhì)區(qū)域先后沉積［3-4］。α-synuclein寡聚體對(duì)許多細(xì)胞過(guò)程有明顯的損害作用，包括細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、神經(jīng)炎癥和突觸傳遞等。影響α-synuclein 聚集的因素包括環(huán)境、點(diǎn)突變、C末端截?cái)嗪头g后修飾，如泛素化、磷酸化、硝化和氧化［4］。神經(jīng)功能影像學(xué)對(duì)于PD的早期診斷及鑒別缺乏特異性及靈敏性，且PD的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，所以無(wú)法簡(jiǎn)單的用單一影像學(xué)生物標(biāo)志物對(duì)PD患者的病理性α-synuclein進(jìn)行評(píng)估［5-6］。近年來(lái)，人們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)以外的組織中也發(fā)現(xiàn)了α-synuclein 異常沉積，可能先于中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)［7］。外周活檢為尋找準(zhǔn)確可靠的PD早期生物標(biāo)志物及臨床前診斷提供了新的選擇，但外周組織α-synuclein 沉積能否反映大腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性程度尚不確定，由于既往研究條件和方法不一致，如尸檢或活檢取材、選擇部位、組織大小、制備過(guò)程、染色技術(shù)和所用抗體等，報(bào)道的外周α-synuclein檢測(cè)敏感性和特異性也存在很大差異［2，8］。本綜述基于活檢病理，聚焦于皮膚、嗅黏膜或嗅球、胃腸道組織、周圍神經(jīng)等臨床易獲得的組織，評(píng)估其對(duì)PD 病理診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值（表1）。

1 皮膚病理

皮膚組織結(jié)構(gòu)豐富，且皮膚活檢取材方便、創(chuàng)傷小。淺層活檢（3～4 mm）可觀察表皮神經(jīng)纖維，深層活檢（6～8 mm）則能提供足夠的真皮組織來(lái)評(píng)估汗液、皮脂腺、毛囊和小血管。最近研究表明，PD發(fā)病時(shí)涉及自主神經(jīng)系統(tǒng)，皮膚組織中自主神經(jīng)纖維會(huì)出現(xiàn)病理α-synuclein 沉積，沉積程度與自主神經(jīng)功能障礙、臨床癥狀嚴(yán)重程度正相關(guān)，這可能部分解釋PD 患者自主神經(jīng)功能障礙，也有助于PD 的早期診斷和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展［9-10］。

通過(guò)多種抗體免疫組織化學(xué)染色（immunohisto?chemistry，IHC）可以分析皮膚神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)完整性，檢測(cè)PD患者α-synuclein沉積［11］。其中，最常用的是蛋白基因產(chǎn)物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5），又稱泛素羧基末端水解酶-1（ubiquitin C-terminalhydrolase；OCH-L1），廣泛性表達(dá)在所有中樞和周圍神經(jīng)纖維上，可作為一種神經(jīng)軸突標(biāo)記物，抗PGP9.5 抗體可以與有髓及無(wú)髄神經(jīng)纖維相結(jié)合。染色后用明視野顯微鏡或間接免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察可定量PD 患者的表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度（In?traepidermal nerve fiber density，IENFD），這是診斷小纖維神經(jīng)病變的金標(biāo)準(zhǔn)［12］。多項(xiàng)研究表明，PD患者的IENFD 顯著降低［13-14］，約有56.9%的PD 患者存在小纖維神經(jīng)病變［15］。

早期PD 患者皮膚活檢與前期尸檢的腦組織中磷酸化α-synuclein 在結(jié)構(gòu)上相似，且與天然α-synu?clein 相比，磷酸化α-synuclein 在PD 患者皮膚組織檢出中具有更高的特異性和敏感性［16］。此外，真皮自主神經(jīng)纖維內(nèi)的α-synuclein在區(qū)分PD與其他非典型PD 方面也同樣具有很高的敏感性和特異性。磷酸化α-synuclein 可表達(dá)在真皮的汗腺、自主神經(jīng)末梢、靠近豎毛肌或血管的神經(jīng)叢中等［17-18］。通過(guò)IHC 在真皮神經(jīng)纖維中定量檢測(cè)磷酸化α-synuclein 可作為最理想的外周組織病理學(xué)標(biāo)志物，更適用于臨床應(yīng)用中，磷酸化α-synuclein 的檢出率與切片厚度或取材部位相關(guān)，活檢取材部位建議優(yōu)先選擇頸部（第7頸椎旁2 cm，陽(yáng)性率66.7%）和下肢遠(yuǎn)端（外踝上方10 cm，陽(yáng)性率42.2%）［19-20］。

2 嗅黏膜/嗅球病理

嗅覺(jué)減退是PD 常見(jiàn)的非運(yùn)動(dòng)性癥狀，且α-synuclein 存在于嗅黏膜和嗅球，嗅黏膜活檢不會(huì)影響嗅覺(jué)，通過(guò)嗅黏膜組織的α-synuclein 病理觀察，可能有助于PD的早期診斷，而嗅球的組織學(xué)檢查僅限于尸檢。

BEACH 等［21］在58 例PD 尸 檢 嗅 球 中 發(fā) 現(xiàn)α-synuclein免疫組化染色的敏感性達(dá)95%，特異性達(dá)91%，認(rèn)為嗅球α-synuclein 能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)大腦區(qū)域α-synuclein 的存在，但該研究結(jié)果的敏感性和特異性如此之高有待驗(yàn)證。嗅覺(jué)細(xì)胞的α-synuclein 檢出率遠(yuǎn)低于嗅覺(jué)神經(jīng)纖維束，嗅黏膜活檢尚不能幫助診斷，其臨床應(yīng)用性仍值得商榷。嗅覺(jué)功能障礙與腦脊液中α-synuclein 水平升高有關(guān)，因此，與組織學(xué)活檢相比，嗅覺(jué)評(píng)價(jià)如嗅探棒法（Sniffin’Sticks test）似乎是一種更快速、安全的方法［22-24］。

3 消化道病理

在過(guò)去的10 a 里，人們對(duì)PD 患者胃腸系統(tǒng)功能障礙的認(rèn)識(shí)有了顯著提高。近來(lái)研究提示PD 病理可能始于腸道，提出“腦腸學(xué)說(shuō)”，通過(guò)尸檢和活檢研究，證實(shí)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外α-synuclein 的存在［25-28］。唾液腺、胃、十二指腸等都存在α-synuclein沉積，其中食道和唾液腺是濃度最高的區(qū)域，直腸的濃度最低［25］。α-synuclein 通過(guò)胃腸道“轉(zhuǎn)移”到腦組織的途徑包括腸道菌群的影響、迷走神經(jīng)節(jié)前軸突逆行、朊病毒傳播等，涉及免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和直接神經(jīng)調(diào)節(jié)等機(jī)制［26］。

3.1 唾液腺病理

3.1.1 頜下腺病理：頜下腺穿刺活檢可靠、安全，可以獲得足夠的腺實(shí)質(zhì)和神經(jīng)結(jié)構(gòu)來(lái)評(píng)估α-synuclein的病理，經(jīng)皮穿刺頜下腺活檢（特別是超聲引導(dǎo)下）對(duì)PD 診斷具有較高的特異性，可鑒別早期和晚期PD 患者，是提高PD 臨床診斷準(zhǔn)確性的可行方法之一［29-31］。然而因取材方法限制，盡管在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行活檢，也只有50%活檢者能夠獲取到頜下腺組織。

3.1.2 小唾液腺病理：小唾液腺活檢表淺、微創(chuàng)、容易獲得，與頜下腺活檢相比，并發(fā)癥少，更易被患者接受。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)唇腺中的α-synuclein異常聚集與腦內(nèi)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體-正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（dopamine transporter positron emission tomography，DAT-PET）有很好的一致性，但仍需大樣本活檢來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證［32-33］。在PD 早期，小唾液腺活檢中能夠發(fā)現(xiàn)硝化α-synuclein（Nitrated alpha-synuclein），這也有望作為PD診斷的生物標(biāo)志物之一［34］。相對(duì)于小唾液腺活檢，唾液腺活檢雖取材方便，但α-synuclein 敏感性僅為67%。因此，與頜下腺和唾液腺活檢相比，皮膚活檢可能更容易進(jìn)行、有更好的耐受性，并有更大的機(jī)會(huì)檢測(cè)到α-synuclein［35］。

3.2 胃腸道病理α-synuclein 在PD 癥狀出現(xiàn)前就已經(jīng)存在于胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)中，但α-synuclein 表達(dá)改變與PD發(fā)生關(guān)系尚不清楚，胃腸道黏膜活檢可以作為PD 早期診斷的潛在工具［36-37］，但尚存在爭(zhēng)議。早期胃腸道α-synuclein 檢測(cè)研究報(bào)告的高靈敏度和特異性，并沒(méi)有在隨后的研究中被重復(fù)驗(yàn)證。通過(guò)IHC 檢測(cè)胃腸道α-synuclein 沉積的診斷價(jià)值仍舊有限。

為了進(jìn)一步研究胃腸道α-synuclein的表達(dá)對(duì)PD的診斷價(jià)值，RUFFMANN 等［38］用了三種技術(shù)來(lái)檢測(cè)α-synuclein 的不同構(gòu)象：免疫組織化學(xué)法，用總α-synuclein、磷酸化α-synuclein 和寡聚α-synuclein 抗體標(biāo)記；α-synuclein 鄰近連接技術(shù)（α-synuclein proximity ligation assay，AS-PLA）特異性檢測(cè)寡聚α-synuclein；石蠟包埋組織印跡法（paraffin-embedded tissue blot，PET-blot）檢 測(cè) 纖 維 型 和 突 觸 型α-synuclein，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種檢測(cè)方法的一致性低，均不能將PD患者與正常對(duì)照區(qū)分開(kāi)來(lái)。另有研究顯示活檢標(biāo)本磷酸化α-synuclein 免疫染色陽(yáng)性率低（結(jié)腸、直腸陽(yáng)性率低于胃），與手術(shù)標(biāo)本不一致［39］。腸內(nèi)磷酸化α-synuclein 沉積物的存在與腸段受損程度及PD自主神經(jīng)功能障礙無(wú)關(guān)［40］。所以，通過(guò)胃腸道活檢檢測(cè)α-synuclein變異構(gòu)象的方法似乎也不可靠。

4 周圍神經(jīng)病理

研究［41］顯示30%～85%的PD 患者存在疼痛、麻木、感覺(jué)異常等感覺(jué)神經(jīng)病變癥狀。有研究在PD患者腓腸神經(jīng)的雪旺氏細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)磷酸化α-synuclein沉積陽(yáng)性率高達(dá)100%，其敏感性和特異性都非常高，并在沒(méi)有臨床感覺(jué)異常PD患者中的腓腸神經(jīng)中也發(fā)現(xiàn)了豐富的磷酸化α-synuclein 表達(dá)。在腓腸神經(jīng)中，磷酸化α-synuclein 沉積可能來(lái)源于雪旺氏細(xì)胞，發(fā)生于PD 臨床前期，與中樞神經(jīng)的多巴胺神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的α-synuclein 沉積類型相似［42］。因此，對(duì)于PD 早期患者，可以通過(guò)腓腸神經(jīng)磷酸化α-synuclein 檢測(cè)協(xié)助診斷。然而由于缺乏其他類型的神經(jīng)退行性疾病作為對(duì)照，腓腸神經(jīng)活檢對(duì)PD鑒別診斷特異性還有待充分驗(yàn)證，并且腓腸神經(jīng)活檢為有創(chuàng)操作，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)造成腓腸神經(jīng)分布區(qū)的感覺(jué)異常，很難作為PD常規(guī)篩查或早期診斷方法。

5 總結(jié)

PD 的明確診斷依靠病理上發(fā)現(xiàn)路易小體的形成和黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元缺失，并有PD臨床癥狀，但這一金標(biāo)準(zhǔn)僅在患者死亡后方能確定，功能影像并不能替代傳統(tǒng)病理對(duì)α-synuclein 沉積程度的評(píng)判。目前，PD 的診斷依賴于某些臨床特征的出現(xiàn)，缺乏有效的輔助檢查方法及生物標(biāo)志物，近年來(lái)人們?cè)谕庵芙M織中發(fā)現(xiàn)α-synuclein 病理性沉積，外周病理學(xué)檢查對(duì)尋找準(zhǔn)確可靠的PD 早期生物標(biāo)志物及臨床前診斷可提供一定的依據(jù)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色皮膚真皮組織自主神經(jīng)中的磷酸化α-synuclein，有助于帕金森的早期診斷，更適用于臨床應(yīng)用。嗅黏膜、嗅球、胃腸道的診斷性具有爭(zhēng)議。頜下腺活檢可能是提高PD 臨床診斷準(zhǔn)確性的可行方法。腓腸神經(jīng)雖然陽(yáng)性率、特異性及敏感性高，但神經(jīng)活檢是有創(chuàng)檢查，且對(duì)于沒(méi)有感覺(jué)障礙的PD患者很難接受該檢查，不能常規(guī)開(kāi)展。臨床工作及研究中，需要根據(jù)PD患者的病程和受累的組織以及耐受性，采取適當(dāng)?shù)幕顧z部位，進(jìn)行α-synuclein或磷酸化α-synuclein免疫組織化學(xué)染色來(lái)觀察異常沉積，協(xié)助PD的診斷和評(píng)估。