中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的研究進展

姚倩 張小慧 胡耀嘉 金建君 劉淑媚 張燕 綜述 席亞明 審校

作者單位：蘭州大學第一臨床醫(yī)學院，蘭州大學第一醫(yī)院血液科（蘭州市730000）

中性粒細胞是免疫系統(tǒng)中抵御病原體的第一道防線，也是對內(nèi)源性刺激物作出的第一反應者，除吞噬和脫顆粒作用外，中性粒細胞激活后形成一種特殊的結(jié)構(gòu)-中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。正常情況下，NETs 作為宿主的防御機制；NETs 過度激活時，在非感染性疾病中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如自身免疫性疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化，血管炎等[1]。該研究還報道，NETs 還與惡性腫瘤進展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)，發(fā)揮抗腫瘤或促腫瘤活性，也可將NETs 作為一種有用的預后生物標志物及潛在的治療靶點。

1 NETs的結(jié)構(gòu)及形成

2004年，由Brinkmann 等[2]提出，當病原體入侵時，中性粒細胞激活后形成一種特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)—NETs。該結(jié)構(gòu)主要由DNA 為骨架，多種活性蛋白鑲嵌其中，包括組蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-9、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶 G（cathepsin G，CG）等[2-3]。在電鏡下，NETs 是一種超微網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其骨架直徑為15～17 nm，周圍包繞的顆粒蛋白直徑約為50 nm。該骨架能捕獲病原體，而活性蛋白則殺滅病原體[4]。

NETs 可由多種物質(zhì)如佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、細菌、真菌、活化的血小板等刺激產(chǎn)生，此過程稱為NETosis，且認為是一種特殊的死亡程序，與中性粒細胞的凋亡及壞死不同[5]。NETosis 主要有兩種形式：1）是細胞溶解性，較為緩慢，需3～4 h，表現(xiàn)為中性粒細胞受刺激后，其細胞核經(jīng)過變形、染色質(zhì)疏松化導致核分裂、細胞膜破裂，NETs 隨之釋放到細胞外[5]；2）認為NETs 可自發(fā)性的產(chǎn)生，獨特且迅速，中性粒細胞則可通過囊泡運輸?shù)男问椒置诤巳旧|(zhì)，同時通過脫顆粒將顆粒蛋白釋放到胞外，釋放的可核染色質(zhì)和顆粒蛋白在胞外聚集，而中性粒細胞雖無核，但仍保持著細胞膜的完整性，并持續(xù)發(fā)揮吞噬病原微生物的作用[6]。

NETs的形成與活性氧（reactive oxygen species,ROS）和肽?；彼崦搧啺访?（peptidylarginine deimnase 4,PAD4）的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。中性粒細胞受到 PMA 刺激后活化，通過NADPH 氧化產(chǎn)生ROS，使得中性粒細胞核膜破裂，從而釋放出多種NETs的組成成分[7]。同時，細胞內(nèi)的NE和MPO 向細胞核遷移，促進染色質(zhì)的解螺旋；而PAD4 則催化組蛋白瓜氨酸化[8]，進一步使得染色質(zhì)解螺旋；最后疏松化的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的各種蛋白相融合，然后釋放到細胞外，形成特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即NETs[9]。受刺激的中性粒細胞中NADPH 氧化酶能產(chǎn)生殺死微生物所需的活性氧，以及在完整中性粒細胞終止其功能后誘導殺菌NETs的形成。在慢性肉芽腫病患者NADPH 氧化酶缺陷，無生成ROS的能力，故無法形成NETs[10]。

2 NETs 與彌漫性大B細胞淋巴瘤的關(guān)系

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見的侵襲性惡性淋巴瘤，具有很強異質(zhì)性，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，發(fā)病率隨年齡的增長而增加，DLBCL 對免疫化療敏感，可治愈。但仍有超過30%的患者在一線免疫化療后出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)為難治性[11]。有研究表明，無論是在動物模型中還是癌癥患者中，NETs 都參與了腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移；此外，NETs 還可以捕捉循環(huán)中的癌細胞，喚醒處于休眠狀態(tài)的癌細胞，導致腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。Nie 等[12]研究證明，NETs在DLBCL 中亦有相同作用，能促進DLBCL 細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，影響DLBCL的預后[1]。

2.1 NETs 促進DLBCL 增殖、轉(zhuǎn)移

NETs 中的多種組分（MMP-9、NE、DNA 骨架等）與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。在肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等小鼠模型組織中，NETs呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，而在這些疾病中，中性粒細胞釋放NETs的能力較強[13]。與之類似，在晚期DLBCL患者中，NETs 水平也是升高狀態(tài)[12]。Mondal 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9 不僅能降解和重塑細胞外基質(zhì)，促進傷口愈合及血管生成，還能促進惡性腫瘤的增殖、擴散及轉(zhuǎn)移。MMP-9 能通過刺激血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）激活血管，促進血管生成，從而導致胰腺癌的轉(zhuǎn)移。Demers 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠Lewis 肺癌模型中，敲除PAD4 能抑制NETs的形成，而敲除PAD4的小鼠腫瘤生長較對照組緩慢。Miller-Ocuin 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NETs 來源的胞外DNA 亦能激活胰腺星狀細胞，促進胰腺腫瘤的增殖。

Nie 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，用與PMA 相匹配的中性粒細胞培養(yǎng)液處理人和小鼠的DLBCL 細胞系，96 h 后，人與小鼠的DLBCL 細胞系的腫瘤發(fā)生了增殖，當用DNaseI 降解NETs 后，人與小鼠的DLBCL 細胞系腫瘤增殖減緩；而NE 抑制劑，通過阻止NE 核轉(zhuǎn)位和染色質(zhì)解縮來抑制NETosis[12，17]可獲得同樣的結(jié)果。該模型中，一定量的PMA 能有效的誘導增殖誘導配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）的分泌，該配體則由中性粒細胞分泌，并能有效的誘導腫瘤細胞的增殖[12]。該結(jié)果提示，NETs 則可在體外獨立促進DLBCL的增殖和遷移。與此同時，該研究還發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤來源的IL-8 及其小鼠同系物都能夠誘導NETs，且通過激活Toll 樣受體9（Toll-like receptors 9，TLR9）及TLR9 依賴的下游通路（NFkB、MAPK/p38和STAT3）促進腫瘤進展[12，18]。在培養(yǎng)體系中加入DNase I、TLR9 拮抗劑后，該通路明顯受限；同時TLR9 表達下降，使得腫瘤生長緩慢，而基因敲除TLR9 也可抑制DLBCL的生長和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[12]。該研究還發(fā)現(xiàn)，IL-8 還可以與G 蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體CXCR1和CXCR2 結(jié)合，與CXCR2 結(jié)合更緊密，導致NETs 進一步釋放，體內(nèi)抑制劑CXCR2 則可減少NETs的形成，從而導致腫瘤生長變得緩慢。

2.2 NETs 促進自身免疫向淋巴瘤轉(zhuǎn)化

血液循環(huán)系統(tǒng)中NETs的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，NETs 清除延遲會對自身免疫產(chǎn)生影響。在某些情況下，循環(huán)中NETs的持續(xù)存在，能被TLR9 識別并呈現(xiàn)給B 細胞，導致NETs 被激活為一種免疫反應[19]。而淋巴瘤起源于自身免疫、感染或炎癥等背景下，免疫系統(tǒng)的失調(diào)是自身免疫和淋巴增生性疾病的一個常見原因。有研究發(fā)現(xiàn)，當基質(zhì)細胞蛋白過度表達，與Fas 突變相關(guān)的自身免疫在缺少富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC）時能向淋巴瘤轉(zhuǎn)變，而SPARC的缺失使NETs 與CD5+B 細胞發(fā)生異常相互作用，使得CD5+B 細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，促進淋巴瘤的發(fā)生[20]。

2.3 NETs 與DLCBL 預后

Nie 等[12]分析了233例DLBCL 患者，對其腫瘤組織進行免疫熒光染色，通過單因素、多因素分析，發(fā)現(xiàn)晚期DLBCL 患者NETs 水平比早期DLCBL 患者水平高，而高水平NETs 與較差的總生存率（overall survival，OS）和無進展生存率（progression-free survival，PFS）有關(guān)，是OS 與PFS的獨立預測因子；即NETs 水平越高，提示DLBCL 患者預后越差。血漿中游離的DNA（cell-free DNA,cfDNA）主要來源于NETs，由激活的中性粒細胞釋放出來。研究表明，cf-DNA的含量在腫瘤患者中較高，可由正常細胞或凋亡的腫瘤細胞釋放，也可由壞死的腫瘤細胞釋放或腫瘤細胞主動分泌[21]。研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測cfDNA，能對DLBCL 進行實時的監(jiān)測，也能快速檢測DLBCL 對常規(guī)治療的耐藥性；同時，cfDNA 高負荷提示DLBCL的不良預后，能為評估腫瘤負擔、確定基因突變特征及基因分類提供新的來源[21-22]。而cfDNA 作為NETs的標志物，通過有效的檢測方法識別NETs，將有助于腫瘤的早期篩查、治療檢測及預后的判斷。

目前，國際預后指數(shù)（international prognostic index，IPI）、美國國家癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network IPI，NCCN-IPI）、正電子發(fā)射斷層掃描/計算機斷層掃描（PET/CT）技術(shù)、循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）、cfDNA 等用于評價淋巴瘤的預后，對患者結(jié)果的準確預測將有助于個體化治療。然而，傳統(tǒng)的風險化分層和個體化治療選擇方法是有限的。如IPI和NCCN-IPI 作為DLBCL 中廣泛的預后因素模型，在臨床上共同的缺點是無法識別生存率較低的患者[23]。此外，PET / CT 技術(shù)掃描代謝成像會出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果，而對于低代謝活性的淋巴瘤，PET/CT 很難檢測出來[24]。ctDNA 則主要用于評價微小病灶殘留（minimal residual disease，MRD）[25]，但ctDNA 已被證實是侵襲性淋巴瘤預后的獨立指標，廣泛適用于DLBCL和潛在的其他淋巴瘤患者，有助于個體化治療[26-27]。Kurtz 等[27]研究表明，治療前的ctDNA 水平和分子反應，無論是在診斷還是復發(fā)，都是DLBCL的獨立預后標志物，有可能指導未來的個性化風險導向治療。而cfDNA 目前作為一線治療期間的預后生物標志物能補充IPI、PET/CT 等的不足，也可能有助于DLBCL的診斷[22，28]。此外，腫瘤來源的cfDNA 與致癌病毒一樣，進入脆弱器官的細胞，能將其轉(zhuǎn)化并形成轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，cfDNA 作為腫瘤轉(zhuǎn)化的媒介和NETs的主要成分，在腫瘤中發(fā)揮重要作用[29]?？傊?，NETs 既能反映DLBCL的預后，還有望成為DLBCL的預后生物標志物。

3 結(jié)語與展望

近年來，NETs 已成為研究熱點，值得關(guān)注的是其在惡性腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預后等方面的作用。NETs可促進DLBCL的增殖與轉(zhuǎn)移，且預后差。在DLBCL 動物模型中，已初步證明，使用DNase I、NEI 或阻斷CXCR2 或TLR9 能抑制DLBCL的進展。因此，深入探究NETs 及其抑制劑在DLBCL 中的作用，但NETs 能否成為DLBCL 潛在的治療新靶點及預后生物標記物，仍需大量前瞻性研究進行驗證。