產(chǎn)褐藻膠裂解酶弧菌HB161653的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

葛東振，鮑時翔，高 榮，武慧宇，朱 軍，黃惠琴*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

褐藻膠是褐藻重要的結(jié)構(gòu)成分，作為細胞壁及細胞間質(zhì)的填充物質(zhì)，占褐藻干質(zhì)量的40%左右[1-3]。褐藻膠寡糖是褐藻膠降解后形成的聚合度在2～20的低分子物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、日化、飼料和農(nóng)業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用[4-6]。

降解褐藻膠的方法主要有物理法、化學(xué)法和酶解法。酶解法具有底物專一、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，可以定向制備褐藻膠寡糖，相較于物理、化學(xué)法是一種理想且環(huán)保的方法[7-9]。褐藻膠裂解酶通過β消除機制斷裂褐藻膠分子間的1,4-糖苷鍵催化褐藻膠降解，并在非還原端形成不飽和雙鍵，該雙鍵在波長235 nm處具有強烈吸收峰[10-12]。褐藻膠裂解酶不僅可以降解褐藻膠、定向制備褐藻膠寡糖，而且可以制備海藻原生質(zhì)體、發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、降解生物膜等，可應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、制藥及能源等方面[13-15]。海洋細菌是獲取褐藻膠裂解酶的重要途徑，如假單胞菌（Pseudomonassp.）QD03[16]、固氮菌（Azotobacter vinelandii）[17]、黃桿菌（Flavobacteriumsp.）LXA[18]、交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）CY24[19]、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.）A1[20]、弧菌（Vibriosp.）QY102等。本課題組從海南省瓊海市海域采集到的腐爛馬尾藻中分離出菌株HB161653，經(jīng)分子鑒定可能為弧菌屬（Vibriosp.）新的分類單元，且具有較好的產(chǎn)褐藻膠裂解酶活性。本研究對該菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期為褐藻膠裂解酶的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

弧菌（Vibriosp.HB161653）：由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（2216E瓊脂培養(yǎng)基）、種子培養(yǎng)基（2216E液體培養(yǎng)基）：青島海博生物科技有限公司。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基[21]：海藻酸鈉5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 20 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH值為7.0±0.2。

1.1.3 試劑

可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖（均為分析純）、蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；海藻酸鈉（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；尿素、硫酸銨、NaCl、K2HPO4、MgSO4（均分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8AD型電熱恒溫水槽、GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；UV-1600型可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

將保存的弧菌HB161653劃線于活化培養(yǎng)基，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。從活化平板上挑取單菌落接種于50 mL種子培養(yǎng)基，28℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h，制得種子液。

1.3.2 產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)基優(yōu)化

固定初始發(fā)酵條件為接種量1.0%、裝液量50mL/250mL，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min收集上清液。以褐藻膠裂解酶活力為考察指標(biāo)，分別考察碳源（添加量均為5 g/L可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、海藻酸鈉）、最佳碳源添加量（2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L），氮源（添加量均為5 g/L蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸銨）、最佳氮源添加量（2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L），NaCl添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、K2HPO4添加量（0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L）和MgSO4添加量（0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25g/L、0.30 g/L）對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進一步以海藻酸鈉（A）、蛋白胨（B）、NaCl（C）、K2HPO4（D）和MgSO4（E）添加量為考察因素，設(shè)計L27（35）正交試驗，正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 弧菌HB161653產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of alginate lyase production medium composition of Vibrio sp.HB161653 g/L

1.3.3 產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)發(fā)酵條件優(yōu)化

在優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別考察培養(yǎng)基初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、發(fā)酵溫度（22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃）對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)酶周期的測定

在優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵，定期取樣測定褐藻膠裂解酶活力和發(fā)酵液菌體生物量。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，以褐藻膠裂解酶活力、菌體生物量為縱坐標(biāo)，確定弧菌HB161653的發(fā)酵周期。

1.3.5 測定方法

生物量測定：采用分光光度法，細菌生物量以波長600 nm處的吸光度值表示。

褐藻膠裂解酶活性測定：采用紫外吸收法[22]。取1.8 mL底物（3.0 g海藻酸鈉溶于1 L 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）），40 ℃預(yù)熱5 min，加入0.2 mL待測樣品于40 ℃溫浴10 min，以滅活酶液為對照，測定反應(yīng)體系在波長235 nm處的紫外吸收值。在上述酶活性測定方法下，波長235 nm處紫外吸收值每分鐘增加0.1的酶量為酶的一個活力單位，U。試驗中將最高的酶活性定義為100%，其余條件下的酶活力與最高酶活的比值為相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 弧菌HB161653產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同的碳源及最適碳源添加量對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，以葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖為唯一碳源時菌株產(chǎn)酶能力較弱，以海藻酸鈉為唯一碳源時酶活最高。因此，選擇海藻酸鈉作為弧菌HB161653生長的唯一碳源。

圖1 不同碳源對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

由圖2可知，海藻酸鈉添加量較低時酶活隨著海藻酸鈉含量增加而提高，當(dāng)海藻酸鈉添加量為5 g/L時，菌株產(chǎn)酶能力最強；繼續(xù)增加海藻酸鈉添加量，菌株的產(chǎn)酶能力出現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于海藻酸鈉添加量較低時，不能滿足菌體正常生長代謝所需導(dǎo)致產(chǎn)酶能力較低；添加量較大時發(fā)酵液黏度高，不利于氧氣融合和細胞生長。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的海藻酸鈉添加量為5 g/L。

圖2 不同海藻酸鈉添加量對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of different sodium alginate addition on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

2.1.2 不同的氮源及最適氮源添加量對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，幾種氮源都可以被菌株HB161653利用，以蛋白胨作為唯一氮源時，菌株的產(chǎn)酶能力最強，酵母粉、硫酸銨次之，尿素最差。因此，選擇蛋白胨作為弧菌HB161653生長的唯一氮源。

圖3 不同的氮源對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

由圖4可知，菌株的產(chǎn)酶能力隨著蛋白胨添加量的增加而增加，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0 g/L時達到最大值，之后出現(xiàn)下降趨勢，蛋白胨添加量過高或太低時都會影響褐藻膠裂解酶的積累。這可能是由于蛋白胨添加量較低時，不能滿足菌體正常生長代謝所需；含量較高時也不利于產(chǎn)酶。因此，選擇蛋白胨最佳添加量為10 g/L。

圖4 不同蛋白胨添加量對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different peptone addition on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

2.1.3 金屬離子對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，當(dāng)NaCl添加量為25 g/L時產(chǎn)酶量達到最大值，這與海洋中的鹽濃度較為接近。當(dāng)NaCl添加量＜25 g/L時，產(chǎn)酶能力呈上升趨勢，當(dāng)NaCl添加量＞25 g/L時產(chǎn)酶能力逐漸下降。因此，選擇最佳NaCl添加量為25 g/L。

圖5 不同NaCl添加量對弧菌HB161653產(chǎn)酶影響Fig.5 Effect of different NaCl addition on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

研究表明，K2HPO4、MgSO4對菌株產(chǎn)酶有促進作用[23]。因而，進一步考察K2HPO4添加量和MgSO4添加量對菌株產(chǎn)酶的影響。由圖6可知，當(dāng)K2HPO4添加量達到0.2 g/L時菌株的產(chǎn)酶能力最強，當(dāng)K2HPO4添加量＞0.2 g/L時，該菌的產(chǎn)酶能力呈逐漸下降趨勢；當(dāng)MgSO4添加量達到0.15 g/L時該菌株的產(chǎn)酶能力最強，當(dāng)MgSO4添加量＞0.15 g/L時，該菌的產(chǎn)酶能力呈逐漸下降趨勢。因此，最佳K2HPO4及MgSO4添加量分別為0.2 g/L、0.15 g/L。

圖6 不同K2HPO4、MgSO4添加量對弧菌HB161653產(chǎn)酶影響Fig.6 Effect of different K2HPO4 and MgSO4 addition on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

2.2 弧菌HB161653產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗

由表2可以看出，各因素對菌株產(chǎn)酶的影響大小為海藻酸鈉＞K2HPO4＞MgSO4＞NaCl＞蛋白胨添加量，菌株HB161653產(chǎn)褐藻膠裂解酶的最適組合為A2B1C2D3E1，即發(fā)酵培養(yǎng)基組成為海藻酸鈉5 g/L、蛋白胨7.5 g/L、NaCl 25 g/L、K2HPO40.2 g/L、MgSO40.1 g/L。在此條件下測得的酶活力為26.02 U/mL。

表2 弧菌HB161653產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of alginate lyase production medium composition of Vibrio sp.HB161653

2.3 弧菌HB161653產(chǎn)褐藻膠裂解酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 接種量對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，弧菌HB161653的產(chǎn)酶能力隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量為1.5%時褐藻膠裂解酶活力最高。接種量超過1.5%，褐藻膠裂解酶活力逐漸下降，可能是由于菌株此時大量繁殖，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，導(dǎo)致菌株的產(chǎn)酶量下降。因此，確定最佳接種量為1.5%。

圖7 接種量對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響

pH值影響著細胞膜的穩(wěn)定性，進而影響細菌的產(chǎn)酶能力[24]。由圖8可知，培養(yǎng)基初始pH值為5.0～9.0時，酶活先升高后降低。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，酶活最高，中性的環(huán)境有利于該弧菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶。因此，確定最佳培養(yǎng)基初始pH值為7.0。

圖8 培養(yǎng)基初始pH值對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of medium initial pH on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

2.3.3 發(fā)酵溫度對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響

溫度對細菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的能力起至關(guān)重要的作用，在合適的溫度下才能保證菌株產(chǎn)酶的順利進行[25-26]。由圖9可知，發(fā)酵溫度為28 ℃時產(chǎn)酶最高，發(fā)酵溫度高于28 ℃時，酶活出現(xiàn)大幅度下降。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖9 發(fā)酵溫度對弧菌HB161653產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on enzyme production by Vibrio sp.HB161653

2.3.4 弧菌HB161653生長及產(chǎn)酶曲線測定

由圖10可知，在發(fā)酵初期（8～14 h），菌體處于對數(shù)生長期，消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分進行生長繁殖，發(fā)酵時間為14 h時，菌體生物量達到最大值；發(fā)酵時間＞14 h之后，菌體的生物量隨著時間的延長逐漸下降。在發(fā)酵時間為8～12 h時，菌體的產(chǎn)酶能力隨著發(fā)酵的進行呈快速上升趨勢，在發(fā)酵時間為12 h時，褐藻膠裂解酶活力達到最高（42.1 U/mL），較優(yōu)化前（26.0 U/mL）提高了62%。因此，最佳發(fā)酵時間為12 h。

圖10 弧菌HB161653的生長及產(chǎn)酶曲線Fig.10 Growth and enzyme production curves of Vibrio sp.HB161653

3 結(jié)論

培養(yǎng)基為細菌的生長與繁殖提供必備的營養(yǎng)物質(zhì)。本試驗通過單因素和正交試驗對弧菌HB161653的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為海藻酸鈉5 g/L，蛋白胨7.5 g/L，NaCl 25 g/L，K2HPO40.2 g/L，MgSO40.1 g/L；最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH 7.0，接種量1.5%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵周期12 h。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行產(chǎn)酶試驗，褐藻膠裂解酶活力可達42.1 U/mL，較優(yōu)化前（26.0 U/mL）提高了62%。本研究對產(chǎn)褐藻膠裂解酶弧菌HB161653的發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件進行研究，以期為褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)以及工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。