肉用發(fā)酵菌株的篩選及其在低鹽發(fā)酵香腸中的應(yīng)用

楊 貝，張香美 *，盧 涵，文 港，康 晶，張秀華

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061；2.保定味群食品科技股份有限公司，河北 保定 071000）

鹽是生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的基本成分之一，具有增強(qiáng)風(fēng)味、改善質(zhì)地以及抑制不良微生物生長(zhǎng)等作用[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中食鹽的添加量為2%～3%，在香腸發(fā)酵過程中由于水分減少，成品中食鹽的含量能達(dá)到6%[2]。有研究表明，食鹽攝入過多會(huì)導(dǎo)致高血壓、心血管等慢性疾病[3]。直接減少食鹽的添加是最簡(jiǎn)單有效的辦法，但是會(huì)出現(xiàn)咸味缺失、風(fēng)味改變以及質(zhì)構(gòu)變差等問題，食鹽含量的降低也給原料自身攜帶的微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件，對(duì)產(chǎn)品的安全性也有一定的影響[4]。

近年來，發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于發(fā)酵香腸生產(chǎn)中，不同發(fā)酵劑對(duì)香腸發(fā)酵的影響不同[5-6]。低鹽發(fā)酵香腸研究的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是產(chǎn)品的風(fēng)味問題，有研究表明，具有脂肪分解和蛋白質(zhì)分解活性的發(fā)酵劑有助于香腸中風(fēng)味的形成[7]。王曼等[8]篩選出兩株具有蛋白酶和脂肪酶活性的葡萄球菌（Staphylococcus），可用于鲊肉粉發(fā)酵；CHEN X等[9]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）CMRC6具有較好的蛋白水解活性，將其應(yīng)用到干發(fā)酵香腸中加速了香腸成熟過程總蛋白的水解，提高了風(fēng)味化合物的含量。另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是安全問題，乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生酸類物質(zhì)和抗菌化合物來防止產(chǎn)品腐敗和致病微生物的生長(zhǎng)[10]。SIRINE B S等[11]將植物乳桿菌TN8和嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus）MA18添加到牛肉腸中有利于產(chǎn)品色澤的產(chǎn)生，還能降低產(chǎn)品中腸桿菌數(shù)量；ZHANG Y等[6]將能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)細(xì)菌素的乳酸桿菌LPL-1加入到低鹽香腸中進(jìn)行發(fā)酵，減少了細(xì)菌群落多樣性，并在發(fā)酵過程中抑制了腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)。目前，解決低鹽產(chǎn)品的安全性和風(fēng)味問題有著極為重要的意義，篩選適用于低鹽發(fā)酵香腸的優(yōu)良菌株，在保證產(chǎn)品安全的同時(shí)改善其感官特性，是開發(fā)低鹽發(fā)酵香腸的關(guān)鍵點(diǎn)。

本研究旨在通過篩選具有蛋白酶、脂肪酶活性和抑菌活性的肉用發(fā)酵菌株，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并將其應(yīng)用到食鹽添加量為1%的發(fā)酵香腸中，探究其在低鹽發(fā)酵香腸中應(yīng)用的可行性，以期為篩選具有優(yōu)良性狀的低鹽發(fā)酵劑提供參考，為低鹽發(fā)酵香腸的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

豬后臀肉：石家莊北國(guó)超市；一耕一耘鹽漬豬腸衣：河北河清腸衣有限公司；乳酸菌菌株S2-4、S2-38、BR-12、P-5、C-10、葡萄球菌菌株XP-7、N-4、H-1、Pb-9、YJ3：上海市、廣東省、湖南省、金華市等不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵香腸、臘肉制品中分離并保存菌種；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：生工生物工程（上海）股份有限公司；MRS液體培養(yǎng)基：山東拓普生物工程有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑

TIANGEN細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；氧化鎂（分析純）：天津市河?xùn)|區(qū)紅顏試劑廠；硼酸（分析純）：天津奧普升化工有限公司；鹽酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15型離心機(jī)：美國(guó)SIGMA公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀：海能儀器有限公司；FE28型pH計(jì)：梅特勒-托利多（上海）有限公司；CM-700d/600d分光測(cè)色計(jì)：日本柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；Veriti96型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；CT3型質(zhì)構(gòu)儀：博勒飛（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉用發(fā)酵劑的篩選

（1）肉用發(fā)酵菌株的篩選

參照陳亞杰[12]的方法對(duì)10株菌株的溶血能力、血漿凝固酶、耐熱核酸酶、過氧化氫酶、產(chǎn)黏、產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)氨、產(chǎn)氣、氨基酸脫羧酶、蛋白酶、脂肪酶活性進(jìn)行檢測(cè)。

（2）發(fā)酵菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵菌株的抑菌活性。將活化好的葡萄球菌H-1接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)16 h；將活化好的乳酸菌BR-12接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。發(fā)酵液在4 ℃條件下經(jīng)8000r/min離心5min，取上清液備用。將指示菌（105CFU/mL）涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)平板表面均勻放置兩個(gè)牛津杯，向牛津杯中加入150 μL菌株上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.2 肉用發(fā)酵菌株的鑒定

按照TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒步驟提取細(xì)菌基因組，以其為模板，乳酸菌利用引物L(fēng)pw57（5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及Lpw205（5'-CTTGTTACGACTTCACCC-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，葡萄球菌利用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列，PCR擴(kuò)增體系及條件參照陳亞杰[12]的方法。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并回收目的片段，連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。重組子經(jīng)PCR鑒定正確后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的基因序列，利用MEGA5.05軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3.3 菌株間拮抗實(shí)驗(yàn)

將篩選得到的兩株菌株以十字交叉接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察交叉接種部位是否有菌生長(zhǎng)。

1.3.4 低鹽發(fā)酵香腸的制作工藝

原料肉→絞碎→添加調(diào)料→添加發(fā)酵劑→灌腸→發(fā)酵→成品

操作要點(diǎn)：將瘦肉、肥肉分開絞碎，根據(jù)質(zhì)量比7∶3混合。調(diào)料添加量以肉質(zhì)量計(jì)算，添加白砂糖1.5%、食鹽1%、味精0.3%、淀粉0.4%，攪拌均勻。添加發(fā)酵劑攪拌均勻后灌入天然豬腸衣，37 ℃發(fā)酵72 h得到發(fā)酵香腸成品。

發(fā)酵劑的制備：將活化好的植物乳桿菌BR-12以1%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)14 h；將活化好的木糖葡萄球菌H-1以1%（V/V）的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h。8 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體，用等體積無菌生理鹽水洗滌兩次后，使用無菌生理鹽水重懸菌體，調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL。根據(jù)前期發(fā)酵香腸感官實(shí)驗(yàn)，選擇菌株BR-12和H-1以2∶1和1∶5的復(fù)配比例復(fù)配發(fā)酵制備發(fā)酵香腸。乳酸菌BR-12添加量為107CFU/g，葡萄球菌H-1按比例調(diào)整添加。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組及取樣

CK1組（1%食鹽添加量，低鹽空白對(duì)照組）；CK2組（3%食鹽添加量，高鹽空白對(duì)照組）；A組（1%食鹽添加量，菌株BR-12∶H-1=2∶1）；B組（1%食鹽添加量，菌株BR-12∶H-1=1∶5）。每24 h采集樣品進(jìn)行pH值測(cè)定及腸桿菌數(shù)測(cè)定，每組平行測(cè)定3次；發(fā)酵72 h的成品樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及色差、質(zhì)構(gòu)、揮發(fā)性鹽基氮項(xiàng)目的檢測(cè)，每組平行測(cè)定3次。

1.3.6 發(fā)酵香腸的感官評(píng)價(jià)

參照國(guó)標(biāo)GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》[13]對(duì)發(fā)酵香腸進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)小組由10名專業(yè)人員組成，小組成員對(duì)所有樣品的顏色、氣味、組織狀態(tài)及滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵香腸的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of fermented sausage

1.3.7 發(fā)酵香腸理化指標(biāo)的檢測(cè)

pH值：使用pH計(jì)測(cè)定[14]；色差值：參照王寧寧等[2]的方法測(cè)定；質(zhì)構(gòu)：參照葉翠[15]的方法測(cè)定；揮發(fā)性鹽基氮含量：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[16]測(cè)定。

1.3.8 發(fā)酵香腸中腸桿菌數(shù)的檢測(cè)

參照國(guó)標(biāo)GB/T 4789.41—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)c桿菌科檢驗(yàn)》[17]進(jìn)行腸桿菌計(jì)數(shù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2016統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）并進(jìn)行顯著性比較，P＜0.05為差異顯著；采用GraphPad Prism8.02軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉用發(fā)酵劑的篩選結(jié)果

2.1.1 菌株的安全性和酶活性檢測(cè)結(jié)果

10株菌株的安全性和酶活性檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，乳酸菌BR-12和葡萄球菌H-1均無溶血能力，無氨基酸脫羧酶、血漿凝固酶、耐熱核酸酶活性，不產(chǎn)黏、不產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)氨產(chǎn)氣，為安全菌株，均可以應(yīng)用到香腸中。蛋白質(zhì)和脂肪是風(fēng)味物質(zhì)生產(chǎn)的重要來源[18]，乳酸菌BR-12具有蛋白酶和脂肪酶活性，葡萄球菌H-1具有蛋白酶活性，說明這兩株菌株在香腸中發(fā)酵具有豐富產(chǎn)品風(fēng)味的潛力。

表2 菌株的安全性和酶活性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of safety and enzyme activity of strains

2.1.2 菌株的抑菌效果

菌株BR-12和H-1的抑菌性能見表3。由表3可知，這兩株菌都具有抑菌活性，菌株BR-12對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和普通變形桿菌均具有抑制作用，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果最好。而菌株H-1只對(duì)普通變形桿菌有抑菌作用，對(duì)其余3種菌無抑制作用，說明這兩株菌應(yīng)用到香腸發(fā)酵中有利于提高產(chǎn)品的安全性。

表3 菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of bacteriostatic experiments of the strains

2.2 肉用發(fā)酵劑的分子生物學(xué)鑒定

菌株BR-12及菌株H-1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。由圖1可知，菌株BR-12與植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系最近，菌株H-1與木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株BR-12為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），菌株H-1為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

圖1 菌株BR-12（a）及H-1（b）的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain BR-12 (a) and strain H-1 (b)

2.3 植物乳桿菌BR-12與木糖葡萄球菌H-1間的拮抗作用

植物乳桿菌BR-12與木糖葡萄球菌H-1間的拮抗作用見圖2。由圖2可知，植物乳桿菌BR-12與木糖葡萄球菌H-1在平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，交叉部分有菌株生長(zhǎng)，未出現(xiàn)菌株相互拮抗現(xiàn)象，說明這兩株菌可以作為發(fā)酵劑復(fù)合應(yīng)用于發(fā)酵香腸中。

圖2 植物乳桿菌BR-12與木糖葡萄球菌H-1間的拮抗作用Fig.2 Antagonism between Lactiplantibacillus plantarum BR-12 and Staphylococcus xylose H-1

2.4 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸的影響

2.4.1 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸感官評(píng)價(jià)的影響

由表4可知，A組發(fā)酵香腸的各項(xiàng)感官評(píng)分均最高，且與B組無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于CK1組（P＜0.05），在顏色、氣味和滋味方面的評(píng)分顯著高于CK2組（P＜0.05），在組織狀態(tài)上與CK2組無明顯差異（P＞0.05）。這可能是由于植物乳桿菌BR-12和木糖葡萄球菌H-1的抑菌效果能有效減少其他雜菌對(duì)香腸的影響，同時(shí)具有蛋白酶、脂肪酶活性，促進(jìn)了蛋白質(zhì)、脂肪分解生成風(fēng)味物質(zhì)，提高了產(chǎn)品的滋氣味[18]。結(jié)果表明，在低鹽條件下，添加發(fā)酵劑BR-12和H-1能夠保證產(chǎn)品色澤，提高產(chǎn)品的滋氣味和組織形態(tài)，提升產(chǎn)品品質(zhì)，在1%食鹽添加量的基礎(chǔ)上，保證了發(fā)酵香腸良好的感官和風(fēng)味品質(zhì)。

表4 不同組發(fā)酵香腸的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of fermented sausage in different groups

2.4.2 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸色澤的影響

產(chǎn)品的色澤是吸引消費(fèi)者的一項(xiàng)重要指標(biāo)，傳統(tǒng)肉制品中特有的紅色主要由肌紅蛋白的衍生物（亞硝基肌紅蛋白）來體現(xiàn)[19]。本試驗(yàn)通過測(cè)定香腸的明亮度值（L*）、紅度值（a*）及黃度值（b*）來分析發(fā)酵劑對(duì)低鹽香腸色澤的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同組發(fā)酵香腸色澤的測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of color of fermented sausage in different groups

由表5可知，A組、B組、CK1組發(fā)酵香腸的亮度值（L*值）無顯著差異（P＞0.05），均顯著高于CK2組（P＜0.05）。A組、B組及CK2組發(fā)酵香腸的紅度值（a*值）無顯著差異（P＞0.05），但A組、B組顯著高于CK1組（P＜0.05）；A組發(fā)酵香腸的黃度值（b*值）與CK1組差異不明顯（P＞0.05），說明菌株BR-12和H-1復(fù)合發(fā)酵更有利于香腸色澤的產(chǎn)生，這與LI P J等[20]的研究結(jié)果相似，這可能與木糖葡萄球菌的添加有關(guān)。木糖葡萄球菌的存在有利于生成一氧化氮（NO），使肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白，促進(jìn)色澤的形成[21]。結(jié)果表明，發(fā)酵劑BR-12和H-1在低鹽發(fā)酵香腸中能提高產(chǎn)品色澤。

2.4.3 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)的影響

不同組發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)的測(cè)定結(jié)果見表6。由表6可知，A組與B組發(fā)酵香腸的硬度適中，顯著低于CK2組（P＜0.05）；A組發(fā)酵香腸的彈性與CK1組和CK2組差異不顯著（P＞0.05），且均顯著高于B組（P＜0.05）；A組發(fā)酵香腸的膠著性與B組無顯著差異（P＞0.05），顯著高于CK1組（P＜0.05），顯著低于CK2組（P＜0.05）；在咀嚼性方面，4組發(fā)酵香腸差異不顯著（P＞0.05）?？傮w來看，A組發(fā)酵香腸的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)與CK2組差異較小且優(yōu)于CK1組，A組彈性顯著高于B組（P＜0.05），其余質(zhì)構(gòu)品質(zhì)與B組無顯著差異（P＞0.05）。這表明在1%食鹽添加量的基礎(chǔ)上，添加發(fā)酵劑BR-12與H-1能保證低鹽發(fā)酵香腸產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

表6 不同組發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of texture of fermented sausage in different groups

2.4.4 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸pH的影響

pH是產(chǎn)品發(fā)酵過程中的關(guān)鍵指標(biāo)，低pH值是控制發(fā)酵香腸安全的關(guān)鍵因素之一[22]。不同組發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中pH值的變化見圖3。

圖3 不同組發(fā)酵香腸pH值的測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination results of pH of fermented sausage in different groups

由圖3可知，A組與B組發(fā)酵香腸的pH下降速度快于CK1和CK2組。發(fā)酵24 h時(shí)A組、B組pH值（5.25）均低于安全限值（5.30）[23]。乳酸菌能發(fā)酵糖類產(chǎn)酸及其他抑菌物質(zhì)，使環(huán)境中pH值降低，抑制雜菌生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品安全性[24]。添加發(fā)酵劑的A、B組的發(fā)酵香腸pH下降速度快于CK1和CK2組。由此可以說明，添加發(fā)酵劑BR-12和H-1能迅速發(fā)酵產(chǎn)酸，降低產(chǎn)品pH值，在低鹽條件下保證了發(fā)酵香腸產(chǎn)品的安全性。

2.4.5 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

揮發(fā)性鹽基氮主要指的是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨和胺類等揮發(fā)性堿性含氮物，揮發(fā)性鹽基氮含量越高說明產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和氨基酸被破壞的越多，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越低[25]。發(fā)酵過程中各組發(fā)酵香腸的揮發(fā)性鹽基氮含量見圖4。由圖4可知，A組發(fā)酵香腸的揮發(fā)性鹽基氮含量最低，為（30.57±1.27）mg/100 g，B組次之，CK1組和CK2組含量較高，A組發(fā)酵香腸的揮發(fā)性鹽基氮顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。這表明發(fā)酵劑BR-12與H-1對(duì)抑制香腸中蛋白質(zhì)的腐敗變質(zhì)有顯著作用，可能是添加了發(fā)酵劑能改變產(chǎn)品中的菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)繁殖能抑制有害菌的生長(zhǎng)，減少揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生[26]。總體上，低鹽發(fā)酵香腸中添加發(fā)酵劑BR-12和H-1有利于抑制產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的腐敗變質(zhì)，提高低鹽發(fā)酵香腸產(chǎn)品品質(zhì)。

圖4 不同組發(fā)酵香腸揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of volatile base nitrogen of fermented sausage in different groups

2.4.6 發(fā)酵劑對(duì)低鹽發(fā)酵香腸腸桿菌數(shù)的影響

測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵香腸中的腸桿菌數(shù)，結(jié)果見表7。

表7 發(fā)酵期間不同實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵香腸腸桿菌數(shù)的變化Table 7 Changes of Enterobacter count in different experimental groups during fermentation

由表7可知，不同組發(fā)酵香腸的腸桿菌數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈下降趨勢(shì)，這與湯興宇等[27]的研究結(jié)果相似。發(fā)酵24 h時(shí)，A組和B組發(fā)酵香腸的腸桿菌數(shù)顯著低于CK1組和CK2組（P＜0.05）。發(fā)酵72 h時(shí)，A組和B組發(fā)酵香腸無腸桿菌的生長(zhǎng)，CK2組發(fā)酵香腸腸桿菌數(shù)（11 CFU/g）較少，而CK1組發(fā)酵香腸腸桿菌數(shù)最多（1×104CFU/g），由此可以看出，菌株BR-12與H-1復(fù)合發(fā)酵劑的添加能抑制或殺死產(chǎn)品中的腸桿菌，這可能是由于發(fā)酵劑菌株的生長(zhǎng)繁殖抑制了有害菌的生長(zhǎng)[28-29]，而植物乳桿菌本身能發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，低pH能抑制腸桿菌等有害菌的生長(zhǎng)。CHEN X等[9]將木糖葡萄球菌SX16和植物乳桿菌CMRC6接種于發(fā)酵香腸中，在香腸成熟6 d后未發(fā)現(xiàn)腸桿菌科微生物。因此，發(fā)酵劑BR-12和H-1的使用對(duì)提高低鹽發(fā)酵香腸的安全性有重要的作用。

3 結(jié)論

以是否具有脂肪酶、蛋白酶活性及抑菌活性為指標(biāo)篩選得到兩株肉用發(fā)酵菌株，分別編號(hào)為BR-12、H-1，經(jīng)16S rDNA基因序列鑒定，菌株BR-12被鑒定為植物乳桿菌，菌株H-1被鑒定為木糖葡萄球菌。菌株BR-12具有蛋白酶、脂肪酶活性和抑菌活性，菌株H-1具有蛋白酶活性和抑菌活性；兩株菌之間無拮抗作用，可復(fù)配應(yīng)用于發(fā)酵香腸。菌株BR-12與H-1按2∶1和1∶5的比例接種制備低鹽發(fā)酵香腸，感官評(píng)分較高，發(fā)酵香腸呈特有的玫瑰紅色；香腸pH值快速下降，保證了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)；減少了產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的腐敗變質(zhì)，無腸桿菌生長(zhǎng)，降低了低鹽發(fā)酵香腸的安全風(fēng)險(xiǎn)，符合健康、安全的發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)理念。