清徐低溫大曲真菌菌群多樣性及其功能性關(guān)聯(lián)分析

王 強(qiáng)，蔡文超，劉忠軍，單春會(huì)，郭 壯2，，郝光飛*

（1.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.清香型白酒生物技術(shù)襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441053；4.襄陽(yáng)市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；5.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

曲乃酒之骨，沒(méi)有好曲就很難釀出好酒，酒曲中的微生物是白酒釀造的動(dòng)力[1]。作為主產(chǎn)清香型白酒的山西，所使用的低溫大曲，是用小麥、大麥和豌豆等原料，在40～50 ℃之間的溫度制曲，其獨(dú)特而又豐富的微生物群落，能夠提供代謝和降解原料并產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)所需的微生物和酶促作用，是清香型白酒酒體風(fēng)味品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素[2]。而酒曲中的真菌微生物能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶，其群落結(jié)構(gòu)和功能對(duì)白酒品質(zhì)控制有重要的影響[3]，故探究山西清徐低溫大曲的真菌菌群多樣性就顯得尤為重要。

Illumina MiSeq高通測(cè)序技術(shù)因具有免培養(yǎng)、高通量、快速檢測(cè)、結(jié)果精確且能夠全面展現(xiàn)大曲樣品中復(fù)雜微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析[4]。如陳申習(xí)等[5]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型和醬香型酒曲細(xì)菌群落特征進(jìn)行研究，揭示了不同香型酒曲中細(xì)菌的主要類群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清香型大曲QDB中含有較高比例的放線菌屬（Actinobacteria）；周森等[6]基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)濃香型白酒大曲的真菌菌群多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15份大曲樣品門分類和綱分類較為一致，但真菌屬組成存在較大的差異；薛宇昂等[7]利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)襄陽(yáng)市石花酒大曲中微生物的多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的假單胞菌屬與真菌的曲霉屬有顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）；羅愛(ài)國(guó)等[8]采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型白酒酒糟中微生物多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，酒糟中的細(xì)菌豐富度和多樣性均高于真菌。同樣，現(xiàn)代仿生儀器檢測(cè)設(shè)備電子舌和電子鼻[9]也一直用于食品滋味和香氣的檢測(cè)，由于其客觀、快速、簡(jiǎn)便、靈敏、出錯(cuò)率低等優(yōu)點(diǎn)，近幾年在酒曲上的應(yīng)用也日益增多，如CAI W C等[10-12]均使用電子舌和電子鼻技術(shù)對(duì)大曲的滋味和風(fēng)味進(jìn)行了分析，但卻少有人將兩者結(jié)合，探究大曲中真菌多樣性并研究功能性關(guān)聯(lián)。

本研究使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清徐低溫大曲真菌菌群多樣性進(jìn)行研究，采用電子鼻和電子舌分別對(duì)大曲的滋味和風(fēng)味進(jìn)行分析，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）[13]與相關(guān)性分析探究清徐大曲中真菌微生物的功能，對(duì)后續(xù)從清徐大曲中篩選這些相應(yīng)的真菌，提升酒曲質(zhì)量，并加以在清香白酒生產(chǎn)中運(yùn)用提供思路，為進(jìn)一步利用白酒釀造微生物資源優(yōu)化提供一些方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

清徐低溫大曲樣品：采于山西省太原市清徐縣陽(yáng)順和曲業(yè)有限公司，通過(guò)機(jī)械進(jìn)行制曲。從曲庫(kù)不同位置采集10塊大曲，編號(hào)為QXDQ 1～QXDQ 10。

1.1.2 試劑

引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；5×FastPfu Buffer、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、FastPfu Polymerase、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；酒石酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鉀、氫氧化鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

使用800Y高速萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)曲塊進(jìn)行粉碎并過(guò)20目篩，然后裝入500 mL樣品瓶中于-20 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測(cè)序

通過(guò)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對(duì)清徐大曲微生物多樣性進(jìn)行測(cè)序。按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒說(shuō)明書，從2 g大曲樣品中提取微生物宏基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。以其為模板，采用引物ITS3F和ITS4R對(duì)真菌的ITS3F-ITS4R區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、ITS3F（5 μmol/L）0.8 μL，ITS4R（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，使用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，并使用微量紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)量其數(shù)量和質(zhì)量，以獲得高品質(zhì)和高濃度的微生物宏基因組DNA，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina MiSeq測(cè)序儀測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參考沈馨等[14-15]的方法，對(duì)返回的序列進(jìn)行質(zhì)量控制并根據(jù)核苷酸標(biāo)簽（barcode）區(qū)分序列來(lái)源，然后利用微生物生態(tài)學(xué)定量分析（QIIME）包（1.9.1版）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用UCLUST算法[16]以97%的相似度將高質(zhì)量序列進(jìn)行序列劃分并建立操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[17]，利用UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)[18]對(duì)清徐低溫大曲中真菌菌群的OTU進(jìn)行序列同源性比對(duì)，確定清徐低溫大曲樣品中真菌的分類地位，并在測(cè)序量均為43010條序列下計(jì)算清徐低溫大曲樣品中真菌的超1（Chaol）指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)，同時(shí)對(duì)清徐低溫大曲中的優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)含量＞1.00%）進(jìn)行分析。

1.3.4 基于電子舌技術(shù)對(duì)清徐低溫大曲滋味的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量30 g曲粉，加入120 mL蒸餾水，混勻浸泡0.5 h，于4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，取上清液，過(guò)濾得到濾液。參照楊小麗等[19-21]的方法，采用電子舌對(duì)大曲樣品的滋味進(jìn)行測(cè)定，得到每個(gè)樣品的酸、苦、澀、咸和鮮5個(gè)基本味的相對(duì)強(qiáng)度值，以及樣品的后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）3個(gè)回味的相對(duì)強(qiáng)度值。

1.3.5 基于電子鼻技術(shù)對(duì)清徐低溫大曲香氣的測(cè)定

參照郭壯等[22-24]的方法使用PEN3電子鼻對(duì)清徐低溫大曲中的典型揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。電子鼻的金屬氧化物傳感器列陣的性能描述分別為W1C：芳香成分，W5S：靈敏度大、對(duì)氮氧化合物很靈敏，W3C：氨氣、對(duì)芳香成分靈敏，W6S：主要對(duì)氫氣有選擇性，W5C：烷烴芳香成分，W1S：對(duì)甲烷靈敏，W1W：對(duì)有機(jī)硫化物敏感，W2S：對(duì)乙醇靈敏，W2W：芳香成分、對(duì)有機(jī)硫化物靈敏，W3S：對(duì)烷烴靈敏。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2021對(duì)清徐低溫大曲測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用R（4.0.5 版本）、Origin 2021、SAS 9.0軟件繪制圖、表。通過(guò)腸型分析對(duì)10個(gè)清徐低溫大曲進(jìn)行分組，并結(jié)合皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析揭示優(yōu)勢(shì)菌群與香氣及滋味之間的相關(guān)性，通過(guò)普氏分析（Procrustes）揭示清徐低溫大曲的真菌菌群與大曲品質(zhì)之間是否存在一致性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 清徐低溫大曲樣品中真菌菌群高通量測(cè)序結(jié)果及α多樣性分析

10個(gè)清徐低溫大曲樣品真菌菌群的高通量測(cè)序結(jié)果及α多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 清徐低溫大曲樣品中真菌菌群高通量測(cè)序及α多樣性分析結(jié)果Table 1 High-throughput sequencing and α diversity analysis results of fungal flora in Qingxu low temperature Daqu

由表1可知，經(jīng)過(guò)序列質(zhì)控，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生了63 253.5條真菌序列，以97%的相似度進(jìn)行序列劃分共得到703個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品341個(gè)OTU，通過(guò)UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)將這些序列注釋到了2個(gè)門、4個(gè)綱、5個(gè)目、13個(gè)科和17個(gè)屬。作為α多樣性指數(shù)，超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別從豐度和多樣性兩個(gè)維度，對(duì)清徐大曲中真菌菌群多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，QXDQ 1樣品的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)最大，這說(shuō)明QXDQ1樣品具有最高的真菌物種多樣性和物種豐度[25]。

本研究進(jìn)一步采用稀疏性曲線和α多樣性指數(shù)分析，對(duì)清徐低溫大曲的取樣深度和物種組成進(jìn)行綜合分析，在97%相似性水平下，劃分OTU并制作的稀疏性曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 清徐低溫大曲樣品真菌菌群的稀釋曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Dilution curve (A) and Shannon index curve (B) of fungal flora in Qingxu low temperautre Daqu

由圖1可知，清徐低溫大曲中真菌菌群的物種多樣性都隨著測(cè)序深度的增加而在緩慢上升，而當(dāng)測(cè)序深度≥10 000條之后，香農(nóng)指數(shù)均隨著測(cè)序深度的增加而保持不變，均已達(dá)到平臺(tái)期，說(shuō)明隨著測(cè)序深度的繼續(xù)增加，清徐低溫大曲中仍有少量新的OTU在不斷的被檢出，但微生物多樣性已不再發(fā)生較大的變化，表明本研究的測(cè)序深度已經(jīng)足夠滿足后續(xù)的分析要求[26]。

2.2 清徐低溫大曲真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平，清徐低溫大曲中的優(yōu)勢(shì)真菌門（平均相對(duì)含量＞1.00%）只有子囊菌門（Ascomycota），平均相對(duì)含量高達(dá)（99.99±0.02）%?；趯偎?，清徐低溫大曲樣品中真菌菌群的相對(duì)含量見(jiàn)圖2。

由圖2可知，清徐低溫大曲樣品中共有4個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)含量＞1.00%），分別是復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、紅曲菌屬（Monascus）、曲霉屬（Aspergillus），其中復(fù)膜孢酵母屬的平均相對(duì)含量最高，為（80.71±8.83）%，其余3個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬的平均相對(duì)含量分別為（8.96±5.03）%、（6.10±4.56）%、（1.54±1.18）%。此外，還有（2.44±1.58）%的序列無(wú)法鑒定到真菌屬水平。

圖2 基于屬水平清徐低溫大曲樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal flora structure based on genus level in Qingxu low temperature Daqu

2.3 清徐低溫大曲樣品的腸型分組及其各組真菌屬的群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)腸型分析對(duì)清徐低溫大曲進(jìn)行分組，并基于優(yōu)勢(shì)真菌屬繪制各組菌屬的群落結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 清徐低溫大曲樣品的腸型分析（A）及各組優(yōu)勢(shì)真菌屬群落結(jié)構(gòu)（B）Fig.3 Enterotype analysis (A) and community structure of dominant fungi in each group (B) of Qingxu low temperature Daqu

由圖3A可知，經(jīng)過(guò)腸型分析，清徐低溫大曲樣品被分為兩組，分別為Type 1（包含QXDQ2、QXDQ4、QXDQ5）和Type 2（包含QXDQ1、QXDQ3、QXDQ6、QXDQ7、QXDQ8、QXDQ9、QXDQ10）。由圖3B可知，Type 1組樣品復(fù)膜孢酵母屬的平均相對(duì)含量高于Type2組樣品，而熱子囊菌屬和曲霉屬的平均相對(duì)含量低于Type2組樣品。

2.4 清徐低溫大曲樣品香氣和滋味的解析

采用電子舌和電子鼻分別對(duì)清徐大曲的滋味和香氣進(jìn)行解析，并通過(guò)PCA直觀展現(xiàn)不同樣品間香氣和滋味的相似性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 基于滋味和風(fēng)味指標(biāo)清徐低溫大曲樣品主成分分析的因子載荷圖（A）及得分圖（B）Fig.4 Factors loading diagram (A) and score (B) of Qingxu low temperature Daqu based on taste and flavor indicators by principal component analysis

由圖4A可知，清徐低溫大曲的PC1主要包括WIC、W3C、W5C、W3S、W2W、W2S、W1W、W5S、W1S，方差貢獻(xiàn)率為35.39%，PC2主要包括W6S、酸、咸、豐度、苦、后味-A、后味-B，方差貢獻(xiàn)率為25.41%，前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為60.80%，說(shuō)明這兩個(gè)主成分的代表性強(qiáng)，可以用來(lái)代表清徐低溫大曲樣品的滋味和香氣品質(zhì)。由圖4B可知，清徐大曲Type 1都分布在y的正半軸，Type 2大都分布在y的負(fù)半軸，將Type 1和Type 2的得分范圍映射到圖4A因子載荷上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Type 1主要受W2W、W2S、W1W、W5S、W1S、苦、后味-A和后味-B的影響，Type 2主要受W3S、W6S、酸、咸和豐度的影響，而Type 1和Type 2是由復(fù)膜孢酵母屬、熱子囊菌屬和曲霉屬的平均相對(duì)含量不同確定的，由此可以推測(cè)復(fù)膜孢酵母屬、熱子囊菌屬和曲霉屬的平均相對(duì)含量對(duì)清徐低溫大曲樣品的W3S、W6S和豐度以及W2W、W2S、W1W、W5S、W1S、苦、后味-A和后味-B指標(biāo)具有關(guān)聯(lián)性，是造成清徐大曲分組的主要原因，因此需進(jìn)一步對(duì)清徐低溫大曲樣品的優(yōu)勢(shì)真菌屬與滋味和香氣的相關(guān)性進(jìn)行分析，探究清徐低溫大曲樣品優(yōu)勢(shì)真菌屬的具體功能。

2.5 清徐低溫大曲樣品的優(yōu)勢(shì)真菌屬與滋味和香氣的相關(guān)性

為進(jìn)一步探究?jī)?yōu)勢(shì)真菌屬與功能性指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，基于清徐大曲優(yōu)勢(shì)真菌屬的平均相對(duì)含量與滋味和風(fēng)味指標(biāo)進(jìn)行普氏（Procrustes）分析，并繪制相關(guān)性熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 基于清徐低溫大曲優(yōu)勢(shì)真菌屬與滋味、香氣的普氏分析（A）和相關(guān)性熱圖（B）Fig.5 Procrustes analysis (A) and correlation heat map (B) of Qingxu low temperature Daqu based on dominant fungal genera,and taste and aroma

由圖5A可知，優(yōu)勢(shì)真菌屬與清徐大曲功能性指標(biāo)之間顯著相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明Type 1和Type 2的功能性指標(biāo)差異與菌群差異有密切的關(guān)系。由圖5B可知，復(fù)膜孢酵母屬與后味-A呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與苦味和后味-B呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與咸味呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明清徐大曲中復(fù)膜孢酵母屬含量越大，大曲的后味-A、苦味和后味-B越強(qiáng)烈，但咸味恰恰相反。同時(shí)不難發(fā)現(xiàn)，熱子囊菌屬與曲霉屬功能具有較高的一致性，如兩者都會(huì)抑制W2W、W2S、W1W、W5S、W1S、苦味、后味-A和后味-B這些功能性指標(biāo)，促進(jìn)豐度、酸味和咸味，但并不顯著（P＞0.05）。此外，紅曲菌屬能夠促進(jìn)酸味、咸味、W5S、W2S、W2W、W6S和W1S，抑制后味-A、后味-B和苦味，但不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果明確了清徐低溫大曲樣品優(yōu)勢(shì)真菌屬的具體功能，為后續(xù)從清徐大曲中篩選這些相應(yīng)的真菌，并加以其在清香白酒生產(chǎn)中的運(yùn)用提供了思路。

3 結(jié)論

通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，清徐低溫大曲中的優(yōu)勢(shì)真菌門（平均相對(duì)含量＞1.00%）為子囊菌門，平均相對(duì)含量為（99.99±0.02）%，優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)含量＞1.00%）為復(fù)膜孢酵母屬、熱子囊菌屬、紅曲菌屬、曲霉屬，平均相對(duì)含量分別為（80.71±8.83）%、（8.96±5.03）%、（6.10±4.56）%、（1.54±1.18）%。其中復(fù)膜孢酵母屬與清徐低溫大曲功能性指標(biāo)之間具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），會(huì)促進(jìn)清徐低溫大曲的后味-A、苦味和后味-B，是造成清徐低溫大曲的功能不同的主要原因。本研究能夠在一定程度上豐富人們對(duì)清徐清香型大曲真菌菌群的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步清香型白酒大曲優(yōu)勢(shì)真菌微生物功能性研究及特色菌株應(yīng)用提供一定理論支撐。