重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)在生物安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究

張 娟，綦 艷，嚴(yán)家俊，楊純佳，佘之蘊(yùn)，周臣清

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東 佛山 510670）

生物安全問(wèn)題是影響世界公共衛(wèi)生安全的主要問(wèn)題之一。近年來(lái)，寄生蟲(chóng)、病毒、細(xì)菌等生物危害不僅嚴(yán)重影響著人類的身體健康和正常生活，也阻礙了我國(guó)畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)的有序發(fā)展。因此，如何做到對(duì)這些生物危害更為快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)成為當(dāng)務(wù)之急。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新技術(shù)層出不窮，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)相比，憑借其恒溫?cái)U(kuò)增、操作簡(jiǎn)便、降低成本、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[1]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)和重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（recombinase-aid amplification，RAA）技術(shù)是目前發(fā)展比較成熟的3種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其中，RAA技術(shù)是目前唯一可能研究出體內(nèi)核酸擴(kuò)增技術(shù)的后備技術(shù)[2]。本文重點(diǎn)闡述了RAA技術(shù)在寄生蟲(chóng)、病毒、細(xì)菌、動(dòng)物源性成分、植物病原等生物安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展前景予以展望，以期為RAA技術(shù)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 RAA技術(shù)的簡(jiǎn)介

RAA技術(shù)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，它的顯著特點(diǎn)在于可實(shí)現(xiàn)常溫下的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）解鏈和擴(kuò)增，且可用于定時(shí)定量分析[2-3]（見(jiàn)圖1）。和傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，該技術(shù)無(wú)疑是一種升級(jí)換代的體外核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。除此之外，還有一種常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)—RPA，兩者的主要差別在于前者的重組酶是從細(xì)菌或真菌中獲得的，而后者是較難獲得的噬菌體重組酶[4]。RAA技術(shù)是我國(guó)自主研發(fā)的新型檢測(cè)技術(shù)，相對(duì)RPA來(lái)說(shuō)，其重組酶來(lái)源相對(duì)廣泛，完全滿足我國(guó)快速檢測(cè)的需求。RAA技術(shù)憑借其反應(yīng)迅速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，吸引了眾多生物學(xué)者的關(guān)注。傳統(tǒng)RAA技術(shù)的結(jié)果判斷需要通過(guò)凝膠電泳，隨著檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，RAA通過(guò)與其他檢測(cè)方法相結(jié)合衍生出眾多新的檢測(cè)技術(shù)，例如實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（real time-recombinase-aid amplification，real time-RAA）、重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增側(cè)向流試紙檢測(cè)（recombinase-aidamplification-lateralflowdipstic，RAA-LFD）、RAA微流控芯片檢測(cè)等，已廣泛應(yīng)用于診斷、醫(yī)療、食品安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，體現(xiàn)出了極大的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法的原理示意圖Fig.1 Principle schematic diagram of recombinase-mediated amplification

2 RAA技術(shù)的應(yīng)用研究

2.1 在寄生蟲(chóng)檢測(cè)方面的應(yīng)用

RAA檢測(cè)技術(shù)憑借其自身的優(yōu)勢(shì)，逐漸開(kāi)始應(yīng)用于寄生蟲(chóng)病的檢測(cè)，成為推進(jìn)寄生蟲(chóng)病防控和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的重要手段。丁昕等[5]建立了一種快速、靈敏、特異檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的熒光RAA法，最低可檢測(cè)質(zhì)粒DNA 10拷貝/μL和0.1 ng/μL基因組DNA。同樣是針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的RAA檢測(cè)方法，周鴻讓等[6]建立針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1的RAA檢測(cè)技術(shù)，最低可檢測(cè)量為200 fg/μL，最低檢出質(zhì)?？截悢?shù)為200拷貝/μL，可望用于該蟲(chóng)種的鑒定以及棘球蚴病基因診斷。上述相同的檢測(cè)方法和研究對(duì)象，檢測(cè)靈敏度雖有所不同，但均展現(xiàn)出較高的靈敏度。此外，周鴻讓研究團(tuán)隊(duì)還分別建立了基于RAA技術(shù)和雙重RAA技術(shù)的多房棘球絳蟲(chóng)的檢測(cè)方法，為多房棘球絳蟲(chóng)鑒定與棘球蚴病診斷提供技術(shù)支撐[7-8]。張學(xué)勇等[9]則建立了RAA多重核酸檢測(cè)技術(shù)，用于多房棘球絳蟲(chóng)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和石渠棘球絳蟲(chóng)的快速鑒定，基因組DNA的最低檢測(cè)限分別為2.0 pg/μL、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL，為棘球蚴病病原檢測(cè)和疫病監(jiān)測(cè)提供了一種新的檢測(cè)工具。張強(qiáng)等[10]建立了一種可用于廣州管圓線蟲(chóng)核酸檢測(cè)的熒光RAA法，該法最低檢出限分別為10拷貝/μL重組質(zhì)粒和100 pg/μL基因組DNA，具有較好的敏感性和特異性。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)利用同樣的方法檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)，重組質(zhì)粒的最低檢出限為10拷貝/μL，基因組DNA最低檢出限為3 pg/μL[11]。鄭偉等[12]建立了可檢測(cè)瘧疾的快速檢測(cè)方法，可對(duì)100個(gè)拷貝的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，并具有較好的特異性。針對(duì)血吸蟲(chóng)病，眾多學(xué)者利用該技術(shù)在血吸蟲(chóng)的檢測(cè)方面做出了較多研究成果。趙松等[13-14]建立了一種可用于檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)特異性基因片段的RAA方法，可特異性擴(kuò)增成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵基因組DNA，最低可檢出的質(zhì)?？截悢?shù)為20個(gè)/μL，具有應(yīng)用于日本血吸蟲(chóng)病基因診斷的價(jià)值。隨后，該研究團(tuán)隊(duì)又建立了可檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)核酸片段的實(shí)時(shí)熒光RAA方法，在5 min時(shí)即可觀察到明顯的熒光信號(hào)，不同拷貝數(shù)的擴(kuò)增均可在10 min內(nèi)完成，最低可檢出的質(zhì)粒濃度為10拷貝/μL。此外，該團(tuán)隊(duì)還基于該方法建立了曼氏血吸蟲(chóng)的檢測(cè)技術(shù)，最低可檢出質(zhì)?？截悢?shù)為10拷貝/μL和0.1 fg/μL[15]。董萱等[16]前期建立的RAA方法能辨別出包括早期感染在內(nèi)的血吸蟲(chóng)感染性釘螺，檢測(cè)結(jié)果一致性高、重復(fù)性好，可用于日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺的早期檢測(cè)。此外，該研究團(tuán)隊(duì)基于熒光RAA法最低可檢測(cè)出100只陰性釘螺中混有1只感染性釘螺[17]，同時(shí)也對(duì)該方法檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺的效能進(jìn)行評(píng)價(jià)，證明該方法具有良好檢測(cè)效能，在日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺篩查中具有一定應(yīng)用前景[18]。針對(duì)生活飲用水中比較受關(guān)注的賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)，有學(xué)者也基于上述方法做了相關(guān)研究。倪碧嫻等[19-20]分別建立了可檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)的熒光RAA方法，其中藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)以重組質(zhì)粒和基因組DNA為模板，檢測(cè)敏感性可達(dá)102拷貝/μL和1 pg/μL；隱孢子蟲(chóng)對(duì)重組質(zhì)粒、不同濃度隱孢子蟲(chóng)卵囊基因組DNA和不同數(shù)量隱孢子蟲(chóng)卵囊基因組DNA的最低檢出限分別為102拷貝/μL、1 pg/μL和1個(gè)/50 μL。兩者的檢測(cè)靈敏度高且一致，特異性強(qiáng)，檢測(cè)過(guò)程中無(wú)交叉反應(yīng)，相比現(xiàn)有的檢測(cè)方法，適用性更強(qiáng)。

2.2 在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用

針對(duì)目前口岸傳染病巡查手段局限，主要靠測(cè)溫儀發(fā)現(xiàn)發(fā)熱病人，而引起發(fā)熱癥狀的傳染病涵蓋廣泛，主要包括蟲(chóng)媒傳染病和呼吸道傳播疾病。目前對(duì)該類病毒感染的確診主要基于核酸檢測(cè)，RAA技術(shù)依靠自身優(yōu)勢(shì)在輸入性傳染病排查方面顯示出明顯的優(yōu)越性。鄭偉等[21]基于RAA技術(shù)建立了黃熱病毒的口岸快速檢測(cè)方法，檢測(cè)下限可達(dá)100 copy，與登革熱病毒、西尼羅病毒等蚊媒病毒無(wú)交叉反應(yīng)。此外，針對(duì)該類蟲(chóng)媒病毒，李樊等[22]采用反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增（reverse translation-recombinase-aid amplification，RT-RAA）法建立了塔希納病毒檢測(cè)方法，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下線為100拷貝/反應(yīng)，病毒培養(yǎng)物最低檢出限為10空斑形成單位/反應(yīng)。呂沁風(fēng)等[23]則建立了西尼羅病毒的RT-RAA檢測(cè)方法，檢測(cè)限可達(dá)10 copies，與其他蚊媒病毒無(wú)交叉反應(yīng)。張勤等[24]基于RT-RAA技術(shù)建立了日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）分型鑒定方法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)100拷貝/μL，其中JEV I的靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，適用于口岸現(xiàn)場(chǎng)JEV的快速檢測(cè)。此外，該團(tuán)隊(duì)還建立了快速鑒定登革病毒血清型的方法，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)102copies/μL，為確定登革病毒分子流行病學(xué)趨勢(shì)提供技術(shù)支持[25]。針對(duì)新冠病毒的爆發(fā)，研究學(xué)者也做出快速反應(yīng)。XUE G H等[26]建立了該病毒的RT-RAA快速檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)PCR結(jié)果一致，為該病毒的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單可靠的方法。ZHENG Y Z等[27]建立了新冠病毒的反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條（RT-RAALFD）檢測(cè)方法，該方法檢出限達(dá)1 copy/μL，在檢測(cè)臨床樣本時(shí)，與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果保持高度一致的特異性和靈敏度。趙凱穎等[28]為建立非洲豬瘟病毒簡(jiǎn)便且高效的基層臨床檢測(cè)方法，基于RAA技術(shù)建立了與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International Des épizooties，OIE）推薦的熒光定量PCR方法靈敏度相當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，靈敏度可達(dá)10 copies/μL。徐超等[29]建立了檢測(cè)鴨瘟病毒的普通和熒光RAA方法，其靈敏度分別為100 copies/μL和10 copies/μL，檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)化PCR試劑盒的符合率為100%。趙康辰等[30]建立了H7N9禽流感病毒的反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增（RT-RAA）技術(shù)，H7反應(yīng)體系和N9反應(yīng)體系的最低檢出限分別為10 copy/μL和100 copy/μL，為該病毒快速檢測(cè)提供了新的分子工具。陳淑丹等[31]采用反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)建立檢測(cè)人鼻病毒的快速方法，最低擴(kuò)增拷貝數(shù)為100拷貝。該研究團(tuán)隊(duì)同樣利用該技術(shù)建立了禽流感病毒H5N1的快速檢測(cè)方法，對(duì)質(zhì)粒檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝[32]。

2.3 在細(xì)菌檢測(cè)方面的應(yīng)用

RAA技術(shù)由于彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴溫變?cè)O(shè)備技術(shù)的不足，能在現(xiàn)場(chǎng)和非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)，所以進(jìn)一步奠定了其在細(xì)菌檢測(cè)這方面的應(yīng)用前景。首先，在食源性致病菌的檢測(cè)方面展現(xiàn)了巨大的潛力。方微微等[33]基于RAA技術(shù)建立了快速、靈敏、特異檢測(cè)哈維弧菌的方法，檢測(cè)細(xì)菌純培養(yǎng)物的最低檢測(cè)濃度為7.55×10-1copies/μL，且與其他食源性致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。郝林慧等[34]建立了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的RAA快速檢測(cè)方法，檢出限為5.3 CFU/mL，與其他弧菌屬菌種不存在交叉反應(yīng)，和傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果高度一致。同樣是對(duì)于副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的檢測(cè)，孫曉紅等[35]則將RAA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條結(jié)合，建立可準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的方法，靈敏度比常規(guī)PCR高出十倍數(shù)量級(jí)，細(xì)菌純培養(yǎng)物最低檢測(cè)限可達(dá)1.89×10 copies/μL。同樣基于RAA與側(cè)流層析試紙條結(jié)合技術(shù)，后來(lái)旺等[36]則建立了金黃色葡萄球菌（Staphy-lococcus aureus）的可視化快速檢測(cè)方法，檢出限分別為4 fg/μL DNA與183 CFU/mL純菌液，為牛奶中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢測(cè)提供新的發(fā)展方向。魏瑩等[37]利用RAA技術(shù)建立快速檢測(cè)A族乙型溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolytic-β）的方法，在39 ℃，20 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，靈敏度為10 拷貝/μL。張小平等[38]基于該技術(shù)建立了沙門氏菌（Salmonella）的快速檢測(cè)方法，檢測(cè)下限為102拷貝/μL，與大腸桿菌（Escherichia coli）、志賀氏菌（Shigella）無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。同樣是基于對(duì)沙門氏菌（Salmonella）的檢測(cè)，周冬根等[39]建立的方法對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度為19 CFU/mL，對(duì)模擬樣品的靈敏度為190 CFU/mL，該方法在食源性疫情現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查以及監(jiān)測(cè)中將發(fā)揮重要作用。崔榮飛等[40]基于該技術(shù)建立了食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的快速檢測(cè)方法，最低可檢出的質(zhì)?？截悢?shù)為10拷貝/反應(yīng)。王金鳳等[41]建立了一種快速檢測(cè)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)方法，對(duì)基因組DNA的檢出限為3.0×103fg/μL，對(duì)純培養(yǎng)物的檢出限為1.0×103CFU/μL。成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein，CRISPR/Cas）系統(tǒng)是原核生物用來(lái)抵御外來(lái)遺傳物質(zhì)入侵的免疫防御系統(tǒng)，現(xiàn)已被改造成一種高效的基因編輯工具[42]。葛以躍等[43]將該檢測(cè)系統(tǒng)與RAA技術(shù)相結(jié)合，建立了快速檢測(cè)副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的RAA-Cas13a檢測(cè)方法，靈敏度為10拷貝DNA分子/反應(yīng)，與實(shí)時(shí)PCR對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果一致性較高。其次，在環(huán)境病原微生物的檢測(cè)方面也頗具競(jìng)爭(zhēng)力。郭雨等[44]建立一種快速、靈敏檢測(cè)土壤沙門氏菌（Salmonella）的實(shí)時(shí)重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（RT-RAA）方法，最低檢測(cè)質(zhì)?？截悢?shù)為10拷貝/反應(yīng)。此外，朱立葦?shù)萚45]則采用該技術(shù)監(jiān)測(cè)血站采供血過(guò)程中的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和溶血性鏈球菌（Streptococcus pyogens），對(duì)兩種致病菌的最低檢出限均為102CFU/mL，檢測(cè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)-生化法相同，為血站采供血過(guò)程中致病菌的檢測(cè)提供一種快捷的檢測(cè)方法，提高了臨床用血安全。綜上所述，RAA技術(shù)可以替代PCR技術(shù)作為新型恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)用于食源性致病菌檢測(cè)。

2.4 在動(dòng)物源性成分檢測(cè)方面的應(yīng)用

肉制品摻雜摻假是食品安全問(wèn)題的一個(gè)重要方面，不僅侵犯了消費(fèi)者的權(quán)益，甚至?xí)绊懶竽翗I(yè)的健康發(fā)展和進(jìn)出口貿(mào)易的有序進(jìn)行。隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，目前應(yīng)用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)的主流技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光PCR。RAA作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)，憑借其自身的優(yōu)勢(shì)為肉源性成分的快速檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向。苗麗等[46]為了快速準(zhǔn)確檢測(cè)出肉制品中的雞源性成分，建立了實(shí)時(shí)熒光RAA方法，可穩(wěn)定檢出最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的雞源性成分，與豬肉、牛肉、羊肉均沒(méi)有交叉反應(yīng)。沈泓等[47]以水牛角鑒別為例建立中藥RAA快速鑒別方法，用于水牛角及其混偽品牦牛角的鑒別，在中藥現(xiàn)場(chǎng)鑒定、藥檢抽查等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。周新麗等[48]將離心式微流控芯片和RAA技術(shù)相結(jié)合，用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分的快速檢測(cè)，檢出的最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.0%、0.1%、0.1%、1.0%，檢測(cè)的特異性良好，無(wú)交叉反應(yīng)。新方法的建立為有快速檢測(cè)需求的食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。

2.5 在植物病原檢測(cè)方面的應(yīng)用

RAA技術(shù)在植物病原檢測(cè)方面開(kāi)始嶄露頭角，尤其在農(nóng)作物病害田間早期診斷、種子病害以及貯藏期病害快速檢測(cè)等方面。玉米細(xì)菌性枯萎病菌是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性病原物之一，單長(zhǎng)林等[49]基于熒光RAA技術(shù)建立了該病菌的快速檢測(cè)技術(shù)，靈敏度達(dá)280 fg/μL，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。新菠蘿灰粉蚧是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性害蟲(chóng)，能傳播鳳梨凋萎病毒，唐慧驥等[50]利用RAA技術(shù)建立了該害蟲(chóng)的快速鑒定方法，檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度限值為1.6×103μg/mL，可大大提高一線口岸截獲粉蚧的鑒定效率。褐飛虱是亞洲稻區(qū)最嚴(yán)重的水稻害蟲(chóng)之一，還可以傳播病毒，因此，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)蟲(chóng)情是防治的關(guān)鍵。羅舉等[51]建立了褐飛虱的RAA-LFD鑒定技術(shù)可用于其與近似種的快速區(qū)分，為植保領(lǐng)域的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了新的契機(jī)。RAA技術(shù)的應(yīng)用研究成果見(jiàn)表1。

表1 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法的應(yīng)用研究成果Table 1 Application research results of the recombinase-mediated amplification

綜上所述，RAA技術(shù)在各研究領(lǐng)域的應(yīng)用都展現(xiàn)出較高的靈敏度。雖然對(duì)于相同的研究對(duì)象，不同的研究學(xué)者得出的靈敏度略有不同，但基本與現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)表現(xiàn)出較為一致的靈敏度。在保證較高靈敏度的前提下，RAA檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)將進(jìn)一步凸顯，為其更廣闊的發(fā)展領(lǐng)域奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3 展望

傳統(tǒng)PCR技術(shù)自研發(fā)之初，一直飽受儀器設(shè)備、人員能力、空間、電力等諸多因素的限制?；诖?，常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)，其中RPA和RAA作為該技術(shù)的典型代表，主要區(qū)別在于重組酶的獲取來(lái)源不同。RPA技術(shù)已經(jīng)被英國(guó)TwistDx公司申請(qǐng)專利，基于該技術(shù)的相關(guān)研究都需要依托TwistDx研發(fā)的系列試劑盒[52]。RAA技術(shù)目前已經(jīng)在國(guó)內(nèi)申報(bào)了專利，技術(shù)的便攜性能充分?jǐn)U大核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，使其有望在很大程度上突破傳統(tǒng)PCR技術(shù)的使用限制。RAA技術(shù)雖然還處于前期階段，但作為一種基礎(chǔ)的研究手段，取得的成績(jī)已不俗。RAA技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展促進(jìn)了分子生物學(xué)的研究，在未來(lái)有可能進(jìn)一步促進(jìn)功能基因組學(xué)和植物分子生物學(xué)獲得突破性進(jìn)展。同時(shí)，隨著該技術(shù)的進(jìn)一步深化、完善，其檢測(cè)對(duì)象可以從核酸擴(kuò)大到蛋白質(zhì)、糖類及其他大分子化合物，并可能開(kāi)發(fā)出系列快速診斷產(chǎn)品，定時(shí)定量檢測(cè)特定疾病。以RAA技術(shù)為基礎(chǔ)的各類核酸快速擴(kuò)增技術(shù)或產(chǎn)品，將為人類健康和動(dòng)植物疫病的防治提供及時(shí)的診斷。