基于外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)探討葉酸缺乏對N2a-APP細胞β-淀粉樣蛋白的影響☆

樊珺婷 董翠霞 黃麗 張美琳 劉歡

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）以β-淀粉樣蛋白（amyloid-β,Aβ）在神經(jīng)元沉積形成老年斑為主要病理特征[1]。外泌體是來自內(nèi)體的膜囊泡，接收并分泌Aβ至細胞外，參與形成老年斑[2]。葉酸缺乏與AD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其作用機制與葉酸缺乏導(dǎo)致細胞外Aβ沉積有關(guān)[3]。有研究表明，脂肪酸的營養(yǎng)素可影響外泌體的分泌[4]。葉酸缺乏可引起細胞氧化應(yīng)激[5]，促進來自內(nèi)體的自噬體形成[6]。細胞氧化應(yīng)激和自噬改變都會影響外泌體分泌[7]。以上研究提示，葉酸缺乏導(dǎo)致細胞外Aβ增加，可能與外泌體分泌有關(guān)。外泌體起源于內(nèi)體，其內(nèi)容物可反映細胞內(nèi)物質(zhì)變化[7]。近期研究表明，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析可確定外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)特征[8]。本研究擬觀察葉酸缺乏對轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細胞內(nèi)外Aβ水平和外泌體分泌的影響，基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析外泌體內(nèi)容物的改變，探討葉酸缺乏促進AD的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞材料 本研究采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP695質(zhì)粒的小鼠成神經(jīng)瘤細胞（N2a neuroblastoma cells overexpressing APP695,N2a-APP），由廈門大學(xué)許華曦教授提供。將復(fù)蘇的N2a-APP細胞在10%胎牛血清（FBS）和1%青/鏈抗生素?zé)o葉酸（0 μmol/L）DMEM培養(yǎng)基（北京源培生物有限公司）或添加葉酸（10 μmol/L）DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，即為葉酸缺乏（folic acid deficiency，F(xiàn)D）組和葉酸正常（folic acid normal，F(xiàn)N）組。將以上細胞在相應(yīng)葉酸濃度無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以去除培養(yǎng)基中外源性外泌體對實驗結(jié)果的影響，收集細胞培養(yǎng)液用于后續(xù)分離外泌體。

1.2 方法

1.2.1 細胞內(nèi)外Aβ水平檢測 取細胞及細胞培養(yǎng)液，使用檢測Aβ1-40、Aβ1-42的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司），參照說明書加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，以及其他工作液，用酶標(biāo)儀測定λ為450 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Aβ1-40、Aβ1-42濃度。

1.2.2 外泌體提取 將細胞培養(yǎng)液上清與總外泌體提取試劑（美國invitrogen公司）以2∶1的比例混勻。經(jīng)4°C孵育16 h，離心10000 g，靜置1 h后棄上清，PBS吹打混勻沉淀。0.22 μm無菌濾器過濾懸液，再以2∶1比例加入總外泌體提取試劑，重復(fù)孵育離心步驟，沉淀即為外泌體。

1.2.3 外泌體鑒定 采用電鏡觀察、粒徑分析的方法鑒定外泌體。電鏡鑒定：用PBS稀釋外泌體，取10 μL稀釋液于塑料薄膜上，將載樣銅網(wǎng)倒置于薄膜上，室溫吸附3 min，滴加2%磷鎢酸染液10 μL于銅網(wǎng)上，風(fēng)干銅網(wǎng)上液體，120 kV透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，并拍照和保存。粒徑分析：收集外泌體，PBS稀釋，使外泌體顆粒濃度在106～109/mL。取200 μL稀釋液注入樣本池，用納米顆粒跟蹤分析儀進行檢測。

1.2.4 Western blot檢測蛋白 采用Western blot法檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD63和Flotillin-1，以及細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p62和LC3II/I。收集細胞和外泌體，提取細胞和外泌體蛋白后，BCA法檢測蛋白濃度。LC3使用15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳，其他蛋白采用10%凝膠電泳，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗LC3、Beclin-1、p62（均采購于美國CST公司）、CD63（美國Abcam公司）和Flotillin-1（美國CST公司）（1∶1000稀釋）以及GAPDH（美國CST公司）（1∶5000稀釋）單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗滌3次，加入二抗山羊抗兔HRP（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）（1∶10000稀釋），37℃孵育1 h，滴加顯影液顯色，ImageJ軟件分析條帶光密度值。

1.2.5 外泌體非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析 裂解外泌體和BCA蛋白定量后，進行丙酮沉淀、蛋白重溶、還原、烷基化以及酶解。對脫鹽處理后的多肽，用nano-UPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1200進行分離，并使用Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測。由上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿傻鞍捉M學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法和生物信息學(xué)分析 采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以±s描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。使用MaxQuant（1.6.1.0）和 UNIPROT數(shù)據(jù)庫（uniprot-mouse-20200526）進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析和生物信息分析，如GO富集分析。為控制質(zhì)量及避免出現(xiàn)假陽性，以表達倍數(shù)差異≥1.5，唯一性肽段≥2，且經(jīng)錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白，視為差異蛋白。

2 結(jié)果

2.1 N2a-APP細胞內(nèi)外Aβ 與FN組相比，F(xiàn)D組細胞內(nèi)Aβ1-40（t=-7.218，P＜0.001）、Aβ1-42（t=-5.041，P=0.001）表達水平升高，細胞外 Aβ1-40（t=-4.754，P=0.001）、Aβ1-42（t=-3.784，P=0.004）表達水平同樣升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 外泌體鑒定結(jié)果與外泌體蛋白濃度 透射電鏡顯示兩組N2a-APP細胞培養(yǎng)基上清物質(zhì)，粒徑50～200 nm，呈雙層膜樣結(jié)構(gòu)，形狀不一，呈茶托形、凹陷半球形、類圓形和圓形。符合外泌體形態(tài)特征，表明所提取的物質(zhì)為外泌體。FD組外泌體粒徑為（157.7±53.3）nm，粒徑主峰為122.9 nm；FN組外泌體粒徑為（161.9±60.8）nm，粒徑主峰為114.8 nm。見圖1。

BCA檢測外泌體蛋白濃度如表2所示，F(xiàn)D組外泌體蛋白濃度為（637.56±47.31）μg/mL，F(xiàn)N組外泌體蛋白濃度為（365.76±76.21）μg/mL，兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.909，P＜0.001）。Western blot表明FD組和FN組細胞分泌的物質(zhì)均有外泌體特異性蛋白CD63和Flotillin-1表達。見圖2。

2.3 外泌體差異蛋白表達 利用非標(biāo)記定量技術(shù)，對N2a-APP細胞分泌的外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量篩選。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，總共鑒定1303種蛋白質(zhì)，鑒定出50種差異蛋白，其中14種蛋白在FD組表達下調(diào)，36種蛋白表達上調(diào)。見表2。

表2 FD組與FN組相比的外泌體差異蛋白

2.4 生物學(xué)信息分析 為探究葉酸缺乏可能對外泌體蛋白參與的生物過程、分子功能和細胞組分的影響，將差異蛋白進行GO富集分析。差異蛋白主要參與的生物過程有：細胞內(nèi)外以及細胞膜蛋白定位的調(diào)控、囊泡在高爾基體中運輸?shù)取２町惖鞍字饕挥诙嚯拿笍?fù)合體、蛋白酶復(fù)合體等細胞組分。差異蛋白發(fā)揮的生物功能主要有：與熱休克蛋白結(jié)合、與鈣粘蛋白結(jié)合等。GO富集分析結(jié)果見圖3。

2.5 細胞自噬水平 Western blot檢測N2a-APP細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白相對表達水平，與FN組相比，F(xiàn)D組細胞內(nèi)Beclin-1（t=-6.339，P＜0.001）和LC3II/I（t=5.396，P=0.002）表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)D組細胞內(nèi)p62蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.162，P＜0.001）。見表3。

表3 兩組N2a-APP細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達水平

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，葉酸缺乏可上調(diào)AD動物模型腦組織中淀粉樣前體蛋白基因的表達[9]，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性[10]，使Aβ生成增多和堆積[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D組N2a-APP細胞內(nèi)和細胞外Aβ1-40與Aβ1-42水平均高于FN組，表明葉酸缺乏可促進N2a-APP細胞中Aβ的生成和向胞外分泌。

本研究中FD組和FN組N2a-APP細胞分泌的物質(zhì)均有外泌體特異性蛋白CD63和Flotillin-1表達，該物質(zhì)的電鏡形態(tài)特征和粒徑大小均符合外泌體特征，說明在有或無葉酸的條件下，N2a-APP細胞均可分泌外泌體。有研究發(fā)現(xiàn)N2a細胞可通過外泌體分泌Aβ[2]。本研究中FD組外泌體蛋白濃度高于FN組，且與兩組細胞外Aβ1-40、Aβ1-42水平變化一致，提示葉酸缺乏可影響外泌體的分泌，從而調(diào)節(jié)Aβ轉(zhuǎn)運。

細胞對葉酸的攝取，由葉酸轉(zhuǎn)運蛋白溶質(zhì)載體（SLC）家族介導(dǎo)[11]。本實驗通過外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D組外泌體中二氫葉酸還原酶（DHFR）表達上升和葉酸轉(zhuǎn)運蛋白家族SLC7A1成員表達下降，提示細胞處于葉酸缺乏狀態(tài)，且葉酸轉(zhuǎn)運功能受損。已知，氧化應(yīng)激可影響外泌體分泌[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的PYCR1和TXNL1在FD組外泌體中上升，推測葉酸缺乏引起的外泌體分泌增多與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。

本研究外泌體蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明，葉酸缺乏可影響VPS29、BAG6、HASP1A、MAP2K1等蛋白的表達，這些差異蛋白所在的蛋白家族均與自噬密切相關(guān)[12-14]。例如，VPS29組成逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體貨物識別核心，參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分選和運輸[15]。BAG6具有與LC3結(jié)合的結(jié)構(gòu)，可結(jié)合自噬體[16]。HASP1A相關(guān)蛋白HSC70為自噬途徑的伴侶蛋白[17]。因此，本研究結(jié)果提示葉酸缺乏可引起細胞自噬改變。

自噬增加可促進Aβ分泌[18]，而自噬缺乏會導(dǎo)致多泡體中Aβ減少[19]。為進一步驗證葉酸缺乏對N2a-APP細胞自噬的影響，本研究對自噬相關(guān)蛋白進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FD組細胞自噬水平增高，與細胞內(nèi)外Aβ含量變化一致。外泌體與自噬共享內(nèi)體網(wǎng)絡(luò)[7]，干擾自噬會影響外泌體的產(chǎn)生和釋放。Beclin-1可與VPS29同一家族的VPS34形成自噬體[20]，本研究發(fā)現(xiàn)FD組細胞內(nèi)Beclin-1表達與外泌體中VPS29表達趨勢相同。因此，葉酸缺乏引起的Aβ和外泌體分泌增多均可能與自噬增強有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)D組細胞內(nèi)外Aβ1-40和Aβ1-42水平高于FN組，與外泌體分泌量、細胞內(nèi)自噬水平變化一致，提示葉酸缺乏可能通過直接增強自噬，也可能通過自噬間接調(diào)節(jié)外泌體分泌，促進細胞分泌Aβ。以上結(jié)論是通過觀察細胞內(nèi)外物質(zhì)變化的相關(guān)性得出的，缺乏進一步驗證，因此葉酸缺乏影響外泌體分泌Aβ的機制需要進一步探究。