自體富血小板凝膠聯(lián)合脂肪干細(xì)胞對糖尿病足大鼠lncRNA的影響*

馮召嵐 盛健健 董愛武 李江雄 曹玲玲

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）為因絕對或相對缺乏胰島素誘導(dǎo)的慢性內(nèi)分泌與代謝疾病，以2型糖尿病多見，最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國2 型糖尿病發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到11.3%，有較高致死率與致殘率[1]。DM 患者常伴發(fā)踝以下組織感染、深層組織破壞或潰瘍，即糖尿病足（diabetic foot，DF）[2]，目前治療DF 主要以控制血糖、抗感染、潰瘍清創(chuàng)、促進(jìn)組織再生等為主[3]。自體富血小板凝膠（autologous platelet-rich gel，APG）最早用于骨科、燒傷整形科、頜面外科等，治療效果好，而脂肪干細(xì)胞（ADSCs）治療DF 主要依據(jù)干細(xì)胞可于體內(nèi)分化成平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，分泌大量的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），可促進(jìn)下肢的血流盡快恢復(fù)，以治療該病[4]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通過吸附miRNA 參與調(diào)控靶基因表達(dá)從而影響細(xì)胞的功能已被證實(shí)，雖然lncRNA 因缺少完整開放的閱讀框而不具有編碼蛋白質(zhì)的能力，但其可有效地調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、糖脂代謝[5]。本研究通過構(gòu)建DF 大鼠模型，研究APG 聯(lián)合ADSCs 治療DF 的效果，并對潰瘍組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA 芯片分析，探討APG 聯(lián)合ADSCs 對lncRNA 表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 于2021 年6-9 月選取30 只SPF 級別的C57BL/6 大鼠（江蘇艾菱菲生物科技）。體重195～215 g，平均（205.64±5.49）g，放置于潔凈實(shí)驗(yàn)動物房飼養(yǎng)，自然光線，自由飲食，溫度21～27 ℃，濕度42%～61%。肝素（常州千紅生化制藥股份有限公司）、氯化鈉注射液（生產(chǎn)廠家：杭州民生藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20043304，規(guī)格：1 000 mL∶9 g）、利多卡因（生產(chǎn)廠家：上海朝暉藥業(yè)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021071，規(guī)格：20 mL∶0.4 g）、腎上腺素（生產(chǎn)廠家：無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32024032，規(guī)格：1 mL∶1 mg）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠DF 模型 在適應(yīng)性地喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為正常組、對照組、治療組，各10 只。正常組自由飲水不建模，其余兩組建立DF 模型。模型建立方法：經(jīng)鏈脲霉素（STZ）（生產(chǎn)廠家：Sigma-Aldrich 公司，貨號：S0130）誘導(dǎo)建立模型[6]。予以高糖高脂飼料，包括豬油、蔗糖、膽固醇、豬膽酸鹽、雞蛋、黃豆芽及基本飼料，分別占11.0%、19.0%、2.5%、1.0%、1.0%、29.0%、36.5%，在4 周后腹腔注射1 次30 mg/kg STZ，注射3 d 后采集大鼠尾靜脈血，測得的隨機(jī)血糖在16.7 mmol/L 以上則認(rèn)為成功造模T2DM。在造模后3周，對大鼠進(jìn)行麻醉，足背部消毒，后進(jìn)行DF 造模，采用矩形印章在大鼠足背面剪下矩形（2 mm×5 mm）傷口，銳性移除全層皮膚，制造DF 模型，DF 造模成功標(biāo)準(zhǔn)：肢端出現(xiàn)不同程度紫黯、紅腫、潰瘍與壞疽。制造全層皮膚創(chuàng)面后第2 天觀察并記錄24 h 內(nèi)創(chuàng)面面積大小，測量時(shí)重復(fù)2 次。

1.2.2 APG 的制備 參考文獻(xiàn)[7]，經(jīng)7%（0.3 mL/100 g）水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取5 mL 注射器，吸取0.3 mL 4%的枸櫞酸鈉抗凝劑，注射器連接硬膜外管，在大鼠頸靜脈取3 mL 的靜脈血，以1 100g離心10 min，后加0.3 mL 氯化鈣50 mg/mL以激活，靜置后中間淡黃色凝膠即為APG 凝膠，留取備用。

1.2.3 ADSCs 的制備 參考文獻(xiàn)[8]，采用250 mL氯化鈉注射液+2%利多卡因10～15 mL+腎上腺素0.25 mg 的腫脹液對脂肪組織區(qū)域進(jìn)行局麻，以20 mL注射器配備口徑1.5～3.5 mm、側(cè)孔3.0～5.0 mm 的吸脂針，進(jìn)入供區(qū)，形成負(fù)壓后呈扇形手動而均勻地吸取脂肪組織，吸出3～5 mm3脂肪組織顆粒，若脂肪組織顆粒較大，則需予以手工剪制。

1.2.4 分組處理及觀察 治療組于潰瘍處注射APG+ADSCs（用量均依據(jù)創(chuàng)面大小確定，0.1 mL/cm2），對照組注射等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）于DF 動物潰瘍處，正常組同樣在動物足部相同位置注射等量PBS。（1）三組均連續(xù)注射14 d，采集治療前（建模大鼠于建模成功時(shí)采集，對照組與正常組于同時(shí)間采集）、治療后尾靜脈血，經(jīng)血糖儀測定大鼠血糖水平；（2）注射14 d 后將潰瘍組織固定在4%多聚甲醛溶液中。在治療前及治療后采用免疫印跡法測定炎癥因子[白介素-6（IL-6）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）]、VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）水平，以β-actin 為內(nèi)標(biāo)。

1.2.5 lncRNA 芯片分析 在治療后收集對照組、治療組的潰瘍組織，以及正常組對應(yīng)位置組織，進(jìn)行l(wèi)ncRNA 芯片分析，測定lncRNA 表達(dá)譜變化，探針為60 met 長寡核苷酸。先提取總RNA，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄，熒光標(biāo)記，排列雜交、清洗。后予以熒光強(qiáng)度掃描，掃描圖像傳至NumbleScan 軟件，以Agilent Gene Spring 軟件進(jìn)行差異基因、功能富集研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本和配對樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血糖水平檢測結(jié)果比較 治療14 d后，正常組血糖與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對照組血糖水平顯著高于治療前，治療組血糖水平明顯低于治療前，且治療組低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 三組血糖水平檢測結(jié)果比較[mmol/L，（）]

表1 三組血糖水平檢測結(jié)果比較[mmol/L，（）]

*與對照組比較，P＜0.05。

2.2 兩組炎癥因子及血管生成因子水平比較 治療前，兩組的IL-6、CRP、TNF-α 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療14 d后，對照組的IL-6、CRP、TNF-α 水平均高于治療前，治療組上述指標(biāo)水平均低于治療前，且治療組均低于對照組（P＜0.05）；治療14 d后，對照組的VEGF、bFGF 水平均低于治療前，治療組上述指標(biāo)水平均高于治療前，且治療組均高于對照組（P＜0.05）。見表2、3。

表2 兩組炎癥因子水平比較（）

表2 兩組炎癥因子水平比較（）

*與治療前比較，P＜0.05。

表3 兩組血管生成因子水平比較[ng/100 μg，（）]

表3 兩組血管生成因子水平比較[ng/100 μg，（）]

*與治療前比較，P＜0.05。

2.3 各組lncRNA 表達(dá)譜分析 對照組與正常組比較存在1 627 個顯著差異的lncRNA，治療組與正常組比較存在1 896 個顯著差異的lncRNA，對照組與治療組比較存在2 576 個顯著差異的lncRNA。

2.4 lncRNA 表達(dá)差異譜的靶基因預(yù)測 將靶基因代入差異mRNA 數(shù)據(jù)，篩選得到DF 相關(guān)的靶基因有8個，分別為DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR，其中DLX6-AS1、CHI3L1、STRADB、ARAP1-AS2、PVT1、ROR 高表達(dá)，CAMTA1、ARAP1-AS1 低表達(dá)。

3 討論

慢性并發(fā)癥DF 為DM 患者慢性皮膚潰瘍的主要原因，DF 所致的截肢占我國住院截肢者的28.2%。APG 為目前治療DF 的新方法，當(dāng)APG 形成后，血小板被快速地激活，在5～10 d 后釋放出多種生長因子，其含有的豐富纖維蛋白及營造的相對潮濕低氧環(huán)境均有利于創(chuàng)面修復(fù)，預(yù)防感染[9]，而ADSCs 有多向分化潛能，在增殖速度、生長動力學(xué)和衰老凋亡方面與胚胎干細(xì)胞無差異，既往李雪陽等[10]發(fā)現(xiàn)，ADSCs+APG 可促進(jìn)大鼠創(chuàng)面修復(fù)，其機(jī)制可能和調(diào)控TGFβ1-Smad、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)存在關(guān)系，但目前關(guān)于APG 聯(lián)合ADSCs 是否可改善DF 血管新生及血供目前尚未見報(bào)道。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，治療14 d后，對照組血糖水平顯著高于治療前，治療組血糖水平明顯低于治療前，且治療組的血糖低于對照組（P＜0.05），表明APG聯(lián)合ADSCs 對DF 大鼠血糖有較好調(diào)節(jié)作用。APG屬于自體富血小板血漿與促凝劑按照一定比例混合后形成的有生物修復(fù)能力的物質(zhì)，屬于新型潰瘍治療方式，其含有豐富血小板，且具備高濃度的纖維蛋白、白細(xì)胞，其中白細(xì)胞能殺滅體內(nèi)局部病原體，提高患者抗感染力，而纖維蛋白有組織構(gòu)建作用，為避免白細(xì)胞與血小板流失，可將其進(jìn)行嚴(yán)密包裹，為細(xì)胞修復(fù)供應(yīng)支架，干細(xì)胞可經(jīng)促進(jìn)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ及細(xì)胞角質(zhì)蛋白19（CK19）表達(dá)而促進(jìn)外皮形成，繼而改善潰瘍，改善DF 的血糖水平[11]。

CRP、IL-6、TNF-α 在DF 發(fā)病中起著重要作用，其中CRP、IL-6 可加快體內(nèi)淋巴細(xì)胞分化，大量產(chǎn)生免疫球蛋白G，加速殺傷性T 淋巴細(xì)胞激活，可使體內(nèi)胰島β 細(xì)胞發(fā)生凋亡，TNF-α 是單核巨噬細(xì)胞生成且具備多種生物學(xué)功能的多肽類細(xì)胞因子，可損傷血管內(nèi)皮功能，加速DF 發(fā)展[12]。VEGF 表達(dá)能有效地促進(jìn)血管通透性及表皮細(xì)胞增殖，加速新生血管生成，bFGF 表達(dá)則對機(jī)體修補(bǔ)增生肌膚表層細(xì)胞有直接的影響，能促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，替代衰老細(xì)胞。本次研究發(fā)現(xiàn)，治療后治療組IL-6、CRP、TNF-α 均低于對照組，而VEGF、bFGF 均高于對照組（P＜0.05）。APG 可促進(jìn)機(jī)體組織恢復(fù)，此外APG 制備方法簡單，治療成本較低[13-14]。ADSCs 取材容易、對機(jī)體損傷性較小、體內(nèi)的儲備量高[15]。故ADSCs 聯(lián)合APG 對降低DF 大鼠炎癥因子水平，促進(jìn)新生血管形成具有積極影響。

本次研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，對照組存在1 627 個顯著差異的lncRNA，治療組存在1 896 個顯著差異的lncRNA，對照組與治療組比較存在2 576 個顯著差異的lncRNA，將靶基因帶入差異mRNA 數(shù)據(jù)，篩選得到DF 相關(guān)的靶基因有8個，分別為DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR，表明APG聯(lián)合ADSCs 可能通過改變lncRNA 的表達(dá)，而對DF 發(fā)揮降糖及治療作用。DLX6-AS1 參與細(xì)胞分化及形態(tài)學(xué)發(fā)展，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，在DF 中也發(fā)揮重要作用，既往李杰玉[16]發(fā)現(xiàn)，DF 患者血清中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1 表達(dá)量升高，可能參與DF 發(fā)生及發(fā)展過程，并可能作為臨床診斷的分子標(biāo)記物。CHI3L1 為一種分泌型糖蛋白，主要由軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞分泌，且參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、急慢性反應(yīng)的病理過程，也可能對胰島素信號通路有阻斷作用從而誘導(dǎo)胰島素的分泌水平發(fā)生缺陷障礙[17]。CAMTA1 的活化對體內(nèi)糖脂代謝有重要調(diào)節(jié)作用，STRADB 則能較好地維持胰島素分泌平衡，既往李曉燕等[18]也發(fā)現(xiàn)，APG 與臍帶干細(xì)胞聯(lián)用后經(jīng)靶基因篩選得到CHI3L1、CAMTA1、STRADB 差異表達(dá)。ARAP1可通過調(diào)控Rho 激酶及表皮生長受體參與糖尿病腎病的發(fā)生，而lncRNA-ARAP1-AS1、lncRNAARAP1-AS2 均為位于11 號染色體上的lncRNA[19]。研究顯示表達(dá)下調(diào)的lncRNA-ARAP1-AS1 及表達(dá)上調(diào)的lncRNA-ARAP1-AS2 作用于靶基因mRNAARAP1，使mRNA-ARAP1 在糖尿病與糖尿病腎病中表達(dá)上調(diào)，可能通過調(diào)控Rho 激酶與EGF 受體途徑，參與糖尿病與糖尿病腎病的發(fā)生[20]。lncRNA PVT1 于多種腎細(xì)胞中均有表達(dá)，可能有助于糖尿病腎病腎小球特征性細(xì)胞外基質(zhì)積累的增加，葉鳳等[21]發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA PVT1 可上調(diào)Nephrin和WT-1 的表達(dá)，下調(diào)Desmin 的表達(dá)，減少足細(xì)胞的凋亡，敲低PVT1 表達(dá)則可改善高糖刺激足細(xì)胞損傷與凋亡。lncRNA ROR 位于人18 號染色體，為一種非編碼RNA，可能參與面部皮膚的老化演變，其機(jī)制為lncRNA ROR 通過正向調(diào)控UCP1 及PRDM16 的表達(dá)水平，促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞發(fā)生棕色化，及l(fā)ncRNA ROR 通過表達(dá)參與TGF-β 信號通路過度激活，共同引起dWAT 過度減少從而加速面部皮膚的老化，既往有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ROR在脂肪源性干細(xì)胞中過表達(dá)與面部皮膚老化的發(fā)生發(fā)展有顯著的相關(guān)性[22]。因此APG 聯(lián)合ADSCs可能通過改變lncRNA（DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR）的表達(dá)，而影響炎癥因子和血管生成因子水平，而對DF 發(fā)揮降糖及治療作用，但本研究也存在局限性，如一個lncRNA 可調(diào)節(jié)多個靶基因，而靶基因也可受多個lncRNA 調(diào)節(jié)[23]，后期可繼續(xù)完善研究，為明確APG 聯(lián)合ADSCs 調(diào)控DF 的機(jī)制提供依據(jù)。

綜上所述，APG 聯(lián)合ADSCs 可能通過改變lncRNA DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR 的表達(dá)，而對DF 大鼠的炎癥因子與血管生成因子水平產(chǎn)生影響，繼而發(fā)揮降糖及治療作用。