槲皮素對草莓生長發(fā)育、光合和生理生化特性影響的綜合評價

柳苗苗， 蔡偉建， 張斌斌， 趙密珍， 王 靜， 劉懷鋒

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

草莓生長周期短、產(chǎn)出快、收益高，是江蘇等地冬春季第1果。草莓以設(shè)施生產(chǎn)為主，冬春季低溫弱光會嚴(yán)重制約草莓生產(chǎn)，提高設(shè)施條件下草莓的光合速率和抗性，是冬春季草莓生產(chǎn)的重要研究方向。

槲皮素(quercetin)即3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮，是一種植物性黃酮醇，屬于多酚中的黃酮類化合物，廣泛存在于果蔬、中草藥植物的花、葉和果實(shí)中[1]，位于葉綠體外被，有強(qiáng)抗氧化作用[2-3]，有望成為一種新的植物生物刺激素[2-4]。槲皮素在植物中的應(yīng)用較少，主要集中在保護(hù)植物免受非生物脅迫的影響[5-7]，或通過激素信號[脫落酸(ABA)、吲哚-3-乙酸(IAA)]級聯(lián)調(diào)控影響植物生長發(fā)育[8-9]。

本試驗(yàn)以寧玉草莓品種為材料，研究不同濃度(0、20、40、80 mg/L)槲皮素溶液對草莓生長發(fā)育、光合及抗性的影響，以期確定槲皮素對于草莓耐低溫弱光的作用，為未來草莓的生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計與試劑

供試材料為寧玉草莓(由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育并經(jīng)江蘇省農(nóng)作物品種審定委員會鑒定)，將草莓種苗定植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地中長度55 m、跨度7 m的塑料大棚內(nèi)，壟高 30 cm，壟面寬60 cm，壟間距40 cm，采用高壟雙行的栽培方式。處理分為6個小區(qū)，種苗植株長勢均一，分別噴施20、40、80 mg/L槲皮素(分別記作T1、T2、T3處理)，以噴清水為對照(CK)，每個小區(qū)設(shè)5株重復(fù)，取草莓頂端生長點(diǎn)以下完全展開的第2～3張葉片測定相關(guān)指標(biāo)。

槲皮素、丙二醛(MDA)試劑盒、脯氨酸測定試劑盒、總抗氧化能力試劑盒(T-AOC)均購于南京建成生物工程研究所，測定可溶性糖含量所用試劑盒購于索萊寶生物科技有限公司，蛋白含量測定所用考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測試盒、測定植物總酚(TP)含量所用測試盒購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 植株農(nóng)藝性狀測定 2021年2月測定草莓的農(nóng)藝性狀和光合特性。株高、葉柄長、果長和果寬用卡尺測定，根莖粗用游標(biāo)卡尺測定，花序數(shù)、葉片數(shù)用目測法測定，果質(zhì)量用電子計數(shù)天平稱量，葉面積使用CI-203手持式激光葉面積儀(美國CID公司)測定，相對葉綠素含量使用SPAD-502 Plus便攜式葉綠素測定儀(日本柯尼卡美能達(dá)公司)測定。選擇連續(xù)無云的晴天，在09：00—11：00用Li-6800便捷式光合系統(tǒng)測定儀(美國LI-COR公司)測定光合參數(shù)[光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)]。

1.2.2 葉片生理生化指標(biāo)測定 丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖、可溶性蛋白、總酚(TP)含量和總抗氧化能力(T-AOC)均用試劑盒檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、鄧肯差異顯著性(α=0.05)分析和雙變量相關(guān)性分析，用DPS 7.05統(tǒng)計處理軟件進(jìn)行主成分分析。

通過如下公式得出不同處理后綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)：

U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1，2，3，…，n。

式中：Xj表示第j個綜合指標(biāo)；Xmax、Xmin分別表示第j個綜合指標(biāo)的最大值、最小值。根據(jù)公式計算出每個處理所有指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。

權(quán)重計算公式：

式中：Wj表示在所有綜合指標(biāo)中第j個綜合指標(biāo)的重要程度(權(quán)重)；Pj表示第j個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

綜合評價指標(biāo)(D值)的計算公式：

D=n∑j=1[u(Xj)×Wj]，j=1，2，3，…，n。

式中：D值即草莓在不同濃度槲皮素處理下用綜合指標(biāo)評價得到的最優(yōu)處理濃度的綜合評價值。

用Origin 2019軟件分析作圖，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對草莓花序數(shù)、結(jié)果數(shù)和果實(shí)質(zhì)量的影響

由圖1可以看出，不同濃度槲皮素對草莓花序數(shù)量和結(jié)果數(shù)量的影響不大，噴施清水的對照與20、40、80 mg/L 3個濃度槲皮素處理的花序數(shù)量間差異不顯著，但結(jié)果數(shù)量有顯著差異。清水對照與20、40、80 mg/L槲皮素處理的花序數(shù)分別為2.86、3.36、2.73、3.07個，結(jié)果數(shù)分別為3.52、6.24、5.74、6.47個。由表1可以看出，與清水對照相比，3種濃度槲皮素處理的單果質(zhì)量和果實(shí)總質(zhì)量均增加，清水對照與20、40、80 mg/L槲皮素處理的果實(shí)總質(zhì)量、單果質(zhì)量分別為301.14、338.18、366.60、382.08 g和19.30、22.91、25.13、25.21 g，3種濃度槲皮素處理間的果實(shí)可溶性固形物含量差異不顯著。

2.2 對草莓植株農(nóng)藝性狀的影響

由表2可以看出，在不同濃度槲皮素處理下，草莓農(nóng)藝性狀中的株高、葉片數(shù)與清水對照處理相比均無顯著差異，清水對照與3個濃度槲皮素處理的株高分別為12.85、12.73、12.95、12.75 cm，相互之間無顯著差異；各處理的植株葉片數(shù)為11.85～15.67 張，沒有顯著差異。與清水對照相比，槲皮素處理的植株葉柄更長、葉面積更大、根莖越粗且差異顯著，20mg/L槲皮素處理的葉面積最大，為18.75 cm2，其次為40 mg/L槲皮素處理(18.19 cm2)和80 mg/L槲皮素處理(18.17 cm2)，葉面積最小的為清水對照(15.23 cm2)；40 mg/L槲皮素處理的葉柄最長，根莖最粗，在葉柄長度上，表現(xiàn)為40 mg/L槲皮素處理(11.33 cm)>20 mg/L槲皮素處理(11.10 cm)>80 mg/L 槲皮素處理(11.08 cm)>清水對照(8.99 cm)；在根莖粗上，表現(xiàn)為40 mg/L槲皮素處理(15.70 mm)>20 mg/L槲皮素處理(15.57 mm)>80 mg/L槲皮素處理(15.25 mm)>清水對照(12.32 mm)。

表1 不同濃度槲皮素對草莓果實(shí)質(zhì)量的影響

表2 不同濃度槲皮素對草莓植株農(nóng)藝性狀的影響

2.3 對草莓葉片葉綠素含量和光合作用的影響

由圖2可以看出，槲皮素處理顯著提高了草莓植株葉片的葉綠素含量，20、40、80 mg/L槲皮素處理的葉片葉綠素含量分別比對照高7.00%、6.86%、8.13%，在不同濃度槲皮素處理下，葉綠素含量無顯著差異。

由圖3可以看出，槲皮素處理提高了草莓葉片的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度。在40 mg/L槲皮素處理下，Pn最大，為 22.77 μmol/(m2·s)，顯著高于對照的 20.73 μmol/(m2·s)；在20、80 mg/L槲皮素處理下，Pn分別為21.52、22.33 μmol/(m2·s)，20 mg/L 處理、對照和40 mg/L槲皮素處理間有顯著差異。在80 mg/L槲皮素處理下，Tr最大，達(dá) 4.4 mmol/(m2·s)，顯著高于對照[3.3 mmol/(m2·s)]。在20、40 mg/L 槲皮素處理下，Tr分別為3.9、4.2 mmol/(m2·s)，20 mg/L處理、對照和80 mg/L槲皮素處理間差異顯著。80 mg/L 槲皮素處理的Ci、Gs分別為 283.17 μmol/mol、0.348 4 mol/(m2·s)，40 mg/L 槲皮素處理的Ci、Gs分別為 275.88 μmol/mol、0.34 mol/(m2·s)，對照Ci、Cs分別為 265.33 μmol/mol、0.28 mol/(m2·s)。

2.4 對草莓葉片丙二醛含量和脯氨酸含量的影響

由圖4-A可以看出，不同濃度槲皮素處理降低了草莓葉片中的丙二醛含量，并且隨著施用槲皮素濃度的遞增，丙二醛含量逐漸降低，其中清水處理的丙二醛含量最高，達(dá)0.0267 μmol/g，80 mg/L槲皮素處理的丙二醛含量僅為0.018 3 μmol/g，表明施用槲皮素可有效緩解逆境中植株細(xì)胞的受損。由圖 4-B 可以看出，施用槲皮素處理可有效提高植株葉片細(xì)胞中的脯氨酸含量，其中40、80 mg/L槲皮素處理下草莓植株葉片的脯氨酸含量分別為38.5、37.1 μg/g，與清水對照(20.5 μg/g)間差異顯著。

2.5 對草莓葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

由圖5可以看出，槲皮素處理的草莓植株葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白含量與清水對照相比差異顯著，施用槲皮素有效提高了草莓植株葉片中可溶性糖、可溶性蛋白含量。在3個不同濃度槲皮素處理下，可溶性糖含量逐漸增加，分別為16.83、21.16、22.33 mg/g(圖5-A)；但3個濃度槲皮素處理之間的草莓葉片可溶性蛋白含量差異不顯著(圖5-B)。

2.6 對草莓葉片總酚和總抗氧化能力的影響

施用不同濃度槲皮素對草莓葉片總酚含量(圖6-A)和總抗氧化能力(圖6-B)沒有顯著影響。清水對照(CK)與T1、T2、T3處理的總酚含量分別為16.18、16.74、16.78、16.76 mg/g，總抗氧化能力分別為8.392、8.785、9.558、8.864 U/mg。

2.7 各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性主成分分析及隸屬函數(shù)法綜合評價

由表3可以看出，總酚含量與葉柄長、葉片數(shù)，可溶性糖含量與果實(shí)總質(zhì)量，根莖粗與葉柄長、可溶性蛋白含量間的相關(guān)系數(shù)最大，均為1.00。葉片數(shù)與葉柄長、葉面積、葉綠素含量、根莖粗、總酚含量及可溶性蛋白含量間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為0.96以上。呈極顯著正相關(guān)的還包括結(jié)果數(shù)與葉片數(shù)、葉面積、可溶性蛋白含量、總酚含量，以及根莖粗與葉面積、葉片數(shù)、葉綠素含量、總酚含量；單果質(zhì)量與葉柄長、葉片數(shù)、結(jié)果數(shù)、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、果實(shí)硬度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.93、0.94、0.88、0.92、0.94、0.88，同時單果質(zhì)量與果實(shí)總質(zhì)量、可溶性糖含量、蒸騰速率、凈光合作用、氣孔導(dǎo)度均呈極顯著正相關(guān)。

在對不同濃度槲皮素處理結(jié)果的比較評價中，直接用以上各項(xiàng)指標(biāo)不具有代表性，結(jié)果也缺乏準(zhǔn)確性，可利用主成分分析法進(jìn)行分析，進(jìn)而確定綜合評價指標(biāo)。對不同濃度槲皮素處理的草莓的24項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取出3個主成分，累計貢獻(xiàn)率達(dá)100%，可代表原來的24個指標(biāo)，其中第1主成分(Z1)占77.22%，第2主成分(Z2)占15.19%，第3主成分(Z3)占7.58%，它們對應(yīng)的特征向量表達(dá)式為：

表3 不同濃度槲皮素對草莓各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣

Z1=-0.016 4X1+0.221 6X2+0.223 0X3+0.026 8X4+0.213 7X5+0.204 8X6+0.223 8X7+0.215 6X8+0.226 1X9+0.231 5X10+0.208 9X11+0.210 9X12+0.212 0X13+0.155 9X14-0.182 4X15+0.222 8X16+0.224 1X17+0.214 3X18+0.223 5X19+0.177 6X20-0.229 5X21+0.217 7X22+0.201 4X23+0.229 7X24；

Z2=-0.510 5X1-0.062 5X2-0.103 1X3-0.512 6X4-0.199 7X5-0.173 2X6-0.132 5X7-0.082 6X8+0.029 9X9+0.042 0X10+0.063 3X11+0.214 6X12-0.202 0X13+0.331 3X14+0.047 4X15+0.141 4X16+0.079 6X17-0.123 4X18-0.081 0X19+0.278 9X20-0.005 7X21+0.182 4X22+0.030 4X23+0.046 3X24；

Z3=0.156 5X1+0.204 4X2+0.147 5X3+0.124 5X4+0.067 3X5+0.249 1X6+0.064 1X7+0.249 5X8-0.164 2X9-0.017 8X10-0.311 3X11-0.064 2X12-0.099 2X13+0.286 7X14+0.454 0X15-0.062 6X16-0.159 6X17+0.226 9X18+0.166 2X19+0.269 2X20-0.114 1X21+0.015 5X22-0.367 0X23-0.089 9X24。

式中：X1～X24分別為株高、葉柄長、葉片數(shù)、花序數(shù)、結(jié)果數(shù)、葉面積、葉綠素含量、根莖粗、總質(zhì)量、單果質(zhì)量、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、總酚含量、總抗氧化能力、蒸騰速率、凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度。

由以上表達(dá)式可以看出，第1主成分中葉柄長、葉片數(shù)、葉綠素、總質(zhì)量、單果質(zhì)量、果實(shí)硬度、脯氨酸含量、可溶性糖含量、總酚含量、氣孔導(dǎo)度的系數(shù)較大；第2主成分中果實(shí)橫徑、可溶性固形物含量、總抗氧化能力、凈光合速率的系數(shù)較大；第3主成分中葉面積、根莖粗、可溶性固形物含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量的系數(shù)較大。

以所有綜合指標(biāo)的數(shù)值為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，換算成隸屬函數(shù)值(表4)。對于同一綜合指標(biāo)如Z1，其中T3處理的U(X1)最大，表現(xiàn)最佳，而清水對照最小，表現(xiàn)最差。根據(jù)綜合評價值(D值)，對不同濃度槲皮素處理進(jìn)行排序。結(jié)果顯示，不同處理按D值排序?yàn)?0 mg/L處理>80 mg/L處理>20 mg/L處理>清水對照，其D值分別為0.948、0.822、0.592、0.125，說明40 mg/L槲皮素是最優(yōu)處理劑量。

表4 不同濃度槲皮素處理的綜合指標(biāo)值、隸屬函數(shù)值、D值及綜合評價

3 結(jié)論與討論

長江中下游地區(qū)在冬季(尤其是12月至次年2月)常有低溫弱光，嚴(yán)重影響草莓生產(chǎn)。從遺傳學(xué)角度分析可知，適合選用耐低溫弱光的草莓品種，但選育品種的費(fèi)用、品種的適應(yīng)性、生物學(xué)潛力的局限性及農(nóng)民偏好有時會制約其使用；從栽培學(xué)角度分析可知，利用化學(xué)調(diào)控手段噴施主栽草莓品種，提高其耐低溫弱光能力是一種簡便可行的方式。近年來，植物生物刺激素的使用改善了植物耐逆境的水平[10]。

槲皮素是一種應(yīng)用最廣泛的植物生物類黃酮，常存在于果樹、蔬菜中，有較強(qiáng)的抗氧化、抗逆能力，有望成為植物生物刺激素[14]。外源應(yīng)用槲皮素能減輕獼猴桃葉片在夏季所受的高溫強(qiáng)光的灼傷[15]、延緩蘋果果實(shí)衰老[16]、延遲獼猴桃果實(shí)軟化、抑制擴(kuò)展青霉的發(fā)生[17]、吸收UV-B光以保護(hù)豌豆幼苗[5]、提高滲透脅迫下羅布麻種子的發(fā)芽率和活力[4]、緩解番茄鹽脅迫[3]和百草枯毒性作用[18]。

槲皮素處理能有效增加草莓的結(jié)果數(shù)和單果質(zhì)量，同時不同濃度的槲皮素顯著增加了草莓葉面積、葉柄長和根莖粗，這與槲皮素處理增加番茄幼苗莖高、莖圍和根長[6]并提高羅布麻種子的發(fā)芽率、莖長、根長、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的結(jié)果[7]相同。

槲皮素能夠提高植株的光合特性。逆境脅迫會破壞葉綠體和類囊體膜結(jié)構(gòu)，降低葉綠素合成和氣孔導(dǎo)度，減少水分蒸騰，使光合作用降低。在本研究中，施用外源槲皮素增加了草莓葉片葉綠素含量，這與對番茄、羅布麻和小麥幼苗的研究結(jié)果相同[4，6-7]；槲皮素顯著促進(jìn)了草莓植株的光合作用，其中40 mg/L槲皮素顯著提高了凈光合速率。各濃度槲皮素處理均提高了胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率。槲皮素可以通過誘導(dǎo)類囊體膜的結(jié)構(gòu)變化，影響電子傳遞，調(diào)控氣孔開放的信號通路，消除光抑制和對光合機(jī)構(gòu)膜的損傷，導(dǎo)致光合效率提高[5]。

相關(guān)生理生化指標(biāo)包括丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、抗氧化能力和總酚含量等植物應(yīng)對逆境的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著槲皮素濃度升高，草莓體內(nèi)的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量呈遞增趨勢，而丙二醛含量顯著降低，都有效減少了逆境中植株細(xì)胞受損；總抗氧化能力和酚類化合物總量與對照有顯著差異(P<0.05)，這與小麥幼苗中應(yīng)用槲皮素增加了總抗氧化能力、酚類化合物總量的結(jié)果[17]相同。植物抗性的增加與多種因素有關(guān)，例如不良環(huán)境下植物體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡被打破，植物就會啟動保護(hù)系統(tǒng)，清除過剩的自由基；脯氨酸含量提高會降低活性氧的水平，抑制丙二醛含量增加，從而減輕細(xì)胞膜脂過氧化，這與酚類捕獲活性氧的活力的作用相似；可溶性糖、可溶性蛋白含量的增加提高了草莓的代謝反應(yīng)，以產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解不良環(huán)境尤其是低溫弱光的傷害。

槲皮素以劑量依賴性的方式起作用，而最佳劑量證明對植物是有益的[18]。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，40 mg/L 槲皮素能夠有效提高凈光合速率、減少細(xì)胞膜損傷、提高草莓植株生長和抗性能力，可用于冬春季草莓生產(chǎn)。