紅白忍冬花青素合酶編碼基因rLjANS1的克隆、表達分析及其與花色苷積累的關系

譚政委， 魯?shù)さぃ?李 磊， 余永亮， 許蘭杰， 董 薇， 楊紅旗， 楊 青， 李春明， 安素妨， 梁慧珍

(河南省農業(yè)科學院芝麻研究中心，河南鄭州 450002)

金銀花為大宗中藥材，來源于忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的花蕾或待初開的花。金銀花中含有豐富的揮發(fā)油、黃酮類、有機酸類、三萜類和環(huán)烯醚萜類等化學成分，因其具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老等功效，具有重要的臨床藥用價值[1]。此外，金銀花屬于中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會公布的110種藥食同源名錄品種之一，其提取物已被廣泛應用于香料、化妝品、食品飲料等領域[2]。

紅白忍冬[LonicerajaponicaThunb. var.chinensis(Wats.) Bak.]是一個忍冬自然變異的自變種，其幼枝呈紫黑色，幼葉帶紫紅色，花冠外面呈紫紅色，里面呈白色。與忍冬相比，紅白忍冬中綠原酸、花色苷(anthocycanins)含量較高且揮發(fā)油種類更多[3]，香味更加濃郁，并且具有更強的抗寒性、耐旱性，花期長且開花時間比忍冬早，四季長青，因此也具有較高的觀賞價值和茶飲價值。

花色苷是一類天然水溶性色素，廣泛存在于植物的花、根、莖、葉及果實等多種組織中，使這些組織呈現(xiàn)紅色、藍色或粉色?；ㄉ赵谥参锏纳L發(fā)育和抗逆反應中都起著重要作用，主要包括抗氧化、抗紫外脅迫及吸引昆蟲與食草動物前來傳播花粉和種子等[4]。此外，花色苷還具有抗炎、抗腫瘤、調節(jié)血脂等生物活性[5-6]，因此可見，作為一種天然存在的色素，花色苷在應用到食品添加劑方面具有良好的前景[7]?；ㄇ嗨氐纳锖铣缮婕霸S多類黃酮生物合成的必需結構基因，包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL)、查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構酶(chalcone isomerase，CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H)、二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、花青素合成酶[(anthocyanin synthase(ANS)，又稱leucoanthocyanidin dioxygenase(LDOX)]及UDP類黃酮葡萄糖基轉移酶(UDP flavonoid glucosyltransferase，UFGT)[8]。

ANS作為花色苷合成途徑中重要的關鍵酶之一，已從擬南芥[9]、草莓[10]、紅薯[11]、可可樹[12]、百脈根[13]等多種植物中得到克隆，ANS的功能特性及表達量影響了植物花色苷的種類和含量，如龍膽花中ANS基因突變可導致花色變白[14]，金鐘連翹中ANS的表達量決定了花青素含量[15]。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)，紅白忍冬中的花色苷以矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷為主，并且DFR基因結構變異是導致忍冬中花色苷含量較低的重要因素之一[3]，但是目前關于ANS基因表達量是否與紅白忍冬花色苷含量有關的研究未見報道。為了探究ANS基因在紅白忍冬花色苷合成中的作用，本研究以紅白忍冬為材料，通過轉錄組數(shù)據(jù)分析、RT-PCR 方法等，從紅白忍冬中克隆得到rLjANS1基因cDNA序列全長，隨后對該基因進行生物信息學分析，用qRT-PCR對其表達模式進行分析，并對其表達量與花色苷含量進行相關性分析，以期為紅白忍冬花色苷生物合成和rLjANS1基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用紅白忍冬于2017年種植于河南農業(yè)科學院現(xiàn)代農業(yè)研究開發(fā)基地，經(jīng)河南省農業(yè)科學院芝麻研究中心梁慧珍研究員鑒定為忍冬的變種紅白忍冬，在自然條件下生長。于2021年4—5月在河南農業(yè)科學院現(xiàn)代農業(yè)研究開發(fā)基地采取其根、莖、葉和不同發(fā)育時期的花，紅白忍冬花發(fā)育時期參照忍冬花期劃分標準，分為幼蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期。每份樣品設置3個生物學重復，每個生物學重復分成2份，分別用于基因、花色苷的定量分析，先將樣品在液氮中速凍，然后轉移至超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

總RNA提取所用Quick RNA Isolation Kit試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司，反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、pMD19-T和熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa TB Green?Premix ExTaqTMⅡ)均購自寶生物工程(大連)有限公司，KOD FX購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞由河南省農業(yè)科學院芝麻研究中心保存，引物合成和基因測序委托河南尚亞生物技術有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 按照北京華越洋生物科技有限公司的試劑盒說明書提取樣品的總RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA的質量和完整性進行檢測，用NanoDrop 2000分光光度計對總RNA進行定量，參照試劑盒說明書將總RNA反轉錄為第1鏈cDNA。

1.3.2rLjANS1基因cDNA全長序列的克隆 根據(jù)筆者所在研究室構建的紅白忍冬轉錄組數(shù)據(jù)庫注釋信息，篩選注釋為“l(fā)eucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase”并有完整讀碼框的轉錄本，提取轉錄本的核酸序列，用Primer Premier 5軟件目的基因引物，上游引物序列為5′-A T G G T G A C C A C G A T G T C C T C A A G-3′，下游引物序列為5′-T C A T T T C T T C T C A A G A G C T T C T T-3′。以提取得到的不同花期的cDNA為模板，用KOD酶進行PCR擴增，得到基因全長cDNA序列，PCR反應程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，30 個循環(huán)；68 ℃ 10 min。反應結束后，對PCR產物進行電泳并切取目的片段，回收后與pMD19-T載體連接，并用連接后的載體轉化DH5α感受態(tài)細胞，通過PCR篩選陽性克隆，將菌液送往河南尚亞生物技術公司測序。

1.3.3 rLjANS1蛋白的生物信息學分析 rLjANS1蛋白的氨基酸組成、分子量、理論等電點及穩(wěn)定性參數(shù)的分析通過在線軟件ProtParam (https：//web.expasy.org/protparam/)完成；通過美國國家生物信息中心(NCBI)在線查找軟件ORF finder查找rLjANS1的開放閱讀框(ORF)；通過NCBI的CD-Search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對rLjANS1蛋白的保守結構域進行預測分析；使用在線工具SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)對rLjANS1蛋白的二級結構進行預測分析；通過SWISSMODLE (https：//swissmodel.expasy.org/interactive)完成rLjANS1蛋白的三級結構分析；分別用SignalP-5.0在線軟件 (https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)和PSORT (https：//www.genscript.com/psort.html)完成信號肽的預測和亞細胞定位分析；用DNAMAN 6.0軟件對rLjANS1蛋白及其同源蛋白的氨基酸序列進行多重比對；通過MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining構建rLjANS1蛋白的系統(tǒng)進化樹，并通過Bootstrap方法對進化樹進行檢測，Bootstrap值設置為100。

1.3.4rLjANS1基因的表達模式分析 通過熒光定量PCR技術檢測rLjANS1基因在不同組織部位及不同發(fā)育時期花中的表達量，用Premier5設計rLjANS1基因的熒光定量PCR引物，上游引物序列為5′-C C C T C A A C T G C C A A C A A T-3′，下游引物序列為5′-A T C A C C C C C C A C T C C A T-3′；內標參比基因為Ct60S基因，上游引物序列為5′-C A T C C A T T A T C C A A C A A T C-3′，下游引物序列為5′-A A G A G T A A T C A G T C T C C A-3′。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。通過熔解曲線分析目的基因PCR擴增的特異性，反應程序：從55 ℃到 94 ℃，升溫速度為0.1 ℃/s。每個熒光定量PCR反應重復3次，采用2-ΔΔCT相對定量法對基因進行表達水平的分析。

1.3.5 花色苷含量的測定及相關性分析 用Wrolstad等的pH示差法對花色苷含量進行定量分析[16]，稱取0.5 g用液氮研磨的樣品，加入5 mL提取液，混勻后于4 ℃避光保存過夜，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液，分別檢測樣品在pH值為1.0、4.5時520、700 nm處的吸光度，用如下公式計算花色苷含量：花色苷含量(μg/g)=(D/εL)×Mm×DF×V/m×1 000。式中：D=(D520 nm-D700 nm)pH1.0-(D520 nm-D700 nm)pH4.5；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù)(26 900)；L為比色皿光程(1 cm)；Mm為矢車菊-3-葡萄糖苷分子量(449.2)；DF為稀釋因子；V為最終體積(mL)；m為樣品鮮質量(mg)。用Excel對rLjANS1基因的表達量與其對應樣本花色苷含量進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 rLjANS1基因的克隆

筆者所在課題組前期構建了忍冬、紅白忍冬S4期的轉錄組，通過關鍵詞“l(fā)eucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase”和KEGG編號“K05277”對轉錄組注釋文件進行搜索，發(fā)現(xiàn)有1條序列Cluster-20471.73376注釋為anthocyanidin synthase，并且紅白忍冬中FPKM值(354.02±136.65)顯著高于忍冬(0.91±0.59)。為了對該基因進行深入研究，筆者根據(jù)該注釋基因序列設計引物并進行PCR擴增，PCR擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測。結果如圖1所示，目的基因片段長度約 1 100 bp，與預測大小一致。測序結果表明，該基因cDNA序列長1 068 bp，并且測序結果與轉錄組測序結果一致，具有完整的讀碼框，編碼355個氨基酸(圖2)。通過NCBI保守結構域預測分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白具有ANS蛋白典型的保守結構域2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結構域(圖3)，因此將該基因命名為rLjANS1。

2.2 rLjANS1生物信息學分析

2.2.1 蛋白的理化性狀、亞型胞定位、跨膜區(qū)域預測 通過Prot Param對rLjANS1蛋白進行分析，其分子式為C1807H2863N475O541S15，包含5 701個原子，相對分子量為40.38 ku，理論等電點為5.47。氨基酸組成及比例的分析結果表明，該蛋白中Glu數(shù)量最多，占11.8%，Trp數(shù)量最少，占1.4%。帶正電荷氨基酸殘基、帶負電荷氨基酸殘基數(shù)分別是45、56個，脂肪系數(shù)為88.17，親水性指數(shù)為-0.420，不穩(wěn)定指數(shù)為54.85，半衰期為30 h，對以上數(shù)據(jù)的初步分析發(fā)現(xiàn)，rLjANS1蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。通過PSORT對rLjANS1蛋白的亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于細胞質中，用SignalP 5.0對其信號肽進行分析發(fā)現(xiàn)，rLjANS1蛋白無信號肽，為非分泌蛋白；用TMHMM 2.0預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白無跨膜區(qū)域，屬于非膜蛋白。

2.2.2 rLjANS1蛋白的空間結構分析 用SOPMA對rLjANS1的二級結構進行在線預測，統(tǒng)計結果顯示，rLjANS1蛋白的4種主要二級結構主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-折疊組成，其中無規(guī)則卷曲在4種二級結構中所占比例最高，為40.85%，α-螺旋次之，占比為35.21%，延伸鏈、β-折疊的占比分別為17.75%、6.20%(圖4)。用SWISS-MODEL對rLjANS1蛋白進行同源建模，得到rLjANS1蛋白的三維空間模型(圖5)。通過ExPAsy structure assessment程序評測推導可知，rLjANS1蛋白模型得分為0.93，可信度較高，與擬南芥中的ANS(PDB：1GP4)的相似度為79.60%。

2.3 rLjANS1蛋白序列比對和進化樹分析

通過DNAMAN 7.0軟件對rLjANS1蛋白與其他物種的ANS蛋白進行同源性分析，結果表明，該蛋白與藍果忍冬(Loniceracaerulea，ALU09330.1)、榴蓮(Duriozibethinus，XP_022732774.1)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii，XP_038687022.1)、三七(Panaxnotoginseng，QKV26469.1)等植物中同源ANS具有較高的同源性，同源性分別為98.31%、86.36%、86.24%、83.94%，并具有植物ANS典型的2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結構域，包含由第236位的組氨酸(His，H)、第238位的天冬氨酸(Asp，D)和第290位的組氨酸組成的亞鐵離子結合位點(HxDxnH)及由第300位的精氨酸(Arg，R)、第302位的絲氨酸(Ser，S)構成的2-酮戊二酸特異性結合位點(RxS)(圖6)。

將擬南芥、榴蓮、草莓、金蕎麥、藍果忍冬、蘋果、水稻、垂穗商陸、紫蘇、三七、菠菜、藍豬耳、雷公藤、葡萄、玫瑰、小麥和苜蓿等17種不同物種的ANS蛋白序列與rLjANS1蛋白序列進行比對后構建進化樹，結果表明，rLjANS1與同為忍冬科的藍果忍冬聚為一支，親緣關系最近，與三七、雷公藤、榴蓮、葡萄聚為一個大分支，親緣關系也較近(圖7)，推測這些物種中的ANS可能具有相似功能。

2.4 rLjANS1基因表達模式的分析

用qRT-PCR對紅白忍冬根、莖、葉及不同發(fā)育時期花組織(S1～S6)中rLjANS基因的表達情況進行定量分析，結果表明，rLjANS1基因除了不在根中表達外，在其他所測組織中都有表達，在葉中的相對表達量最高；另外，在不同花發(fā)育時期，rLjANS1基因的相對表達量都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中在S4期的相對表達量最高(圖8)。

2.5 rLjANS1基因表達與花色苷含量的相關性分析

紅白忍冬不同組織部位及不同花發(fā)育時期的花色苷含量如圖9所示。從檢測結果看，在紅白忍冬根中幾乎檢測不到花色苷，紅白忍冬地上部分組織中都有花色苷積累，其中葉中的花色苷含量最高。隨著花發(fā)育進程的推進，花色苷含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中S4期的含量最高。

對rLjANS1基因的相對表達量與其對應樣本花色苷含量進行線性回歸分析，得出相關系數(shù)為0.97(P<0.05)，其相關方程為y=0.008 6x+0.115 8，說明rLjANS基因的表達水平與其對應的花色苷含量呈正相關關系。

3 討論與結論

花青素合成酶是一個植物花青素生物合成代謝途徑中的關鍵酶，是一個依賴亞鐵離子、 2-酮戊二酸的雙加氧酶，屬于2-氧戊二酸依賴性雙加氧酶(2-OGD)超家族，可催化無色花青素(leucoanthocyanidin)轉化為有色花色苷元，在植物色澤形成中起著重要作用[14]。ANS最早是從玉米突變體A2中克隆得到的，目前已從金鐘連翹(Forsythiaintermedia)、裂葉牽牛(Ipomoeahederacea)、草莓(Fragaria×ananassa)等植物中得到克隆，研究者已對其在色澤形成中的作用進行了相關研究[15，17]。

本研究通過挖掘轉錄組數(shù)據(jù)，從紅白忍冬中篩選并克隆得到1個ANS基因rLjANS1，編碼355個氨基酸，結構域分析表明，rLjANS1蛋白具有ANS蛋白典型的保守結構域2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結構域，屬于2-OGD蛋白超家族。生物信息學分析顯示，rLjANS1蛋白定位于細胞質，為水溶性蛋白，這與擬南芥、葡萄等物種已報道的ANS一致，也與花青素主要在細胞質中合成的結論[9，18]一致。對rLjANS1進行二級結構預測發(fā)現(xiàn)，α-螺旋主要集中在蛋白的前中部和C-末端，與草莓、葡萄的二級結構類似[17-18]。多種序列比對結果顯示，rLjANS1與其他已知的ANS蛋白具有較高的同源性，并且從蛋白三級結構的模擬結果看出，rLjANS1與已知結構功能的擬南芥AtANS空間結構非常相似，提示rLjANS1的功能與AtANS具有一定的相似性，這為進一步研究紅白忍冬花色形成機制與rLjANS1催化功能提供了很好的借鑒。

黃酮類化合物與其他次生代謝物一樣，其積累大多具有組織特性，參與這些代謝物合成的關鍵基因也具有組織表達特異性，這種特性已被廣泛應用于基因組復雜或非模式植物的次生代謝產物合成途徑關鍵基因的分離鑒定中[19-20]。大量研究發(fā)現(xiàn)，ANS的表達量與花色苷含量具有一定的相關性。Aharoni等發(fā)現(xiàn)，通過RNAi降低草莓ANS基因的表達量，會導致花青素含量降低，花冠也由粉紅色變?yōu)榘咨玔21]，Nakamura等抑制植物藍豬耳中ANS基因的表達后，發(fā)現(xiàn)植株中花青素含量顯著降低[22]。在本研究中，rLjANS1基因在紅白忍冬根、莖、葉和不同發(fā)育期花組織中的表達量與花青素含量呈明顯的正相關，這與百脈根、紫娟茶葉等ANS的研究結果[13，23]一致，表明這些組織中rLjANS1基因的表達可能與紅白忍冬花色苷合成和積累密切相關。

目前ANS基因在園藝作物中的研究相對較多，但在紅白忍冬中關于該基因表達量與花色苷積累關系的研究較少。本研究在分析轉錄組數(shù)據(jù)的基礎上，克隆并對該基因的表達量和花色苷含量相關性進行研究，初步證明了rLjANS1基因表達與花色苷的正相關性，為rLjANS基因在紅白忍冬中花色苷生物合成積累及遺傳改良等方面的相關研究提供了參考。