20份馬鈴薯品種(系)指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析

劉毅強， 田再民， 祁利潘， 龔學(xué)臣， 馮 琰， 張云帥， 翟鑫娜， 蘇晨晨， 柴國柱， 王 然

(河北北方學(xué)院，河北張家口 075000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬于茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)一年生草本植物，是以塊莖為食物的糧菜兼用作物。據(jù)2017年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計，中國馬鈴薯種植面積、產(chǎn)量分別占世界的29.88%、25.56%，是種植面積和產(chǎn)量最大的國家[1]。馬鈴薯的遺傳多樣性可以從很多方面體現(xiàn)，包括形態(tài)特征、生理特征、細胞特征和DNA序列等，其中遺傳多樣性的本質(zhì)是DNA多樣性[2]，因此，應(yīng)用分子標記技術(shù)對馬鈴薯進行DNA標記和遺傳差異性分析顯得至關(guān)重要。簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)是一種應(yīng)用較廣泛的分子標記技術(shù)，該技術(shù)具有低成本、操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于新品種選育和遺傳多樣性研究[3-4]。de Galarreta等通過SSR分子標記聚類分析的方法，把西班牙當?shù)?05個馬鈴薯品種中具有相似特性的品種聚在了一起[5]。de Haan等利用SSR標記技術(shù)，比對了1 162份來自秘魯中部的地方品種及外遷地方品種，通過15對SSR引物檢測到173個等位位點[6]。谷青等利用5對SSR引物對河北省、黑龍江省、遼寧省、寧夏回族自治區(qū)和內(nèi)蒙古自治區(qū)5個地區(qū)的74株馬鈴薯早疫病病菌進行SSR標記，共檢測到26個等位位點[7]。李靚等利用10對SSR引物擴增6份馬鈴薯新品系，共擴增出105個等位位點，其中多態(tài)性位點82個，多態(tài)性比率為78.1%[8]。李建武等利用11對多態(tài)性高、譜帶清晰SSR的引物分析了甘肅省42份馬鈴薯主栽品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，42份馬鈴薯品種之間的遺傳基礎(chǔ)較狹窄，遺傳相似性較高[9]。李國彬等利用SSR引物和細胞質(zhì)DNA引物對云南省79份馬鈴薯品種進行遺傳多樣性分析，分析了不同馬鈴薯品種的細胞質(zhì)類型并構(gòu)建了指紋圖譜[10]。種質(zhì)資源鑒定、資源收集、種質(zhì)保存和創(chuàng)新利用是拓展品種遺傳基礎(chǔ)、不斷提高育種水平的重要條件和緊迫任務(wù)[11-12]。SSR分子標記技術(shù)在馬鈴薯的遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源鑒定的應(yīng)用已逐漸成熟，本研究利用形態(tài)學(xué)鑒定和SSR分子標記鑒定技術(shù)對20份馬鈴薯材料進行遺傳多樣性分析，解析品種間的親緣關(guān)系，并初步構(gòu)建了20份馬鈴薯材料的指紋圖譜，為馬鈴薯種質(zhì)資源的保護利用、親緣關(guān)系分析及品種鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

20份馬鈴薯材料來自國際馬鈴薯研究中心(CIP)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所、河北北方學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究中心等馬鈴薯選育單位(表1)。

1.2 試驗地點

試驗于2021年5—9月在河北省張家口市河北北方學(xué)院馬鈴育種試驗基地(114°21′20.69″)進行。該地區(qū)屬中溫帶大陸性季風氣候，海拔1 600～1 800 m，年降水量300 mm左右。試驗地為栗鈣土，土壤肥力中等，年平均日照時數(shù)2 897.8 h。

1.3 試驗方法

選取20份馬鈴薯品種(系)，隨機排列種植，每份品種(系)種植面積108 m2(30 m×3.6 m)，起壟種植，壟寬90 cm，種植密度52 500株/hm2。播種前施復(fù)合肥(N ∶P2O5∶K2O=1 ∶0.5 ∶2.5)1 500 kg/hm2，不追肥，正常田間管理，2021年5月7日播種，9月18日收獲。

表1 供試馬鈴薯品種(系)資源

1.4 測定項目及方法

1.4.1 田間表型性狀調(diào)查及賦值方法 參考《馬鈴薯種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[13]和《馬鈴薯DUS測試指南》的分級標準[14]，對供試材料19個田間性狀進行調(diào)查并賦值，具體性狀及賦值方法見表2。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，通過描述統(tǒng)計模塊，對所有形態(tài)學(xué)性狀鑒定的數(shù)據(jù)進行標準化處理，之后將標準化的數(shù)據(jù)輸入處理軟件SPSS 22.0，采用歐氏距離，利用UPGMA法對供試材料進行聚類，生成聚類圖。

1.4.2 馬鈴薯基因組DNA的提取與SSR-PCR擴增 摘取未感病蟲害的馬鈴薯幼嫩葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA。12對SSR引物均來自段艷鳳等馬鈴薯科研工作者公開發(fā)表的文獻[15]，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表3)，用于對供試馬鈴薯材料進行擴增。PCR擴增體系為 25 μL，包括模板DNA 2 μL、GreenTaqMix 10 μL(來自南京諾唯贊生物科技有限公司)、上下游引物各 1 μL、ddH2O 11 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，恒定電壓1 800 V，電泳時間90 min，并用硝酸銀染色，氫氧化鈉顯色，拍照記錄結(jié)果。

表2 19個馬鈴薯田間性狀及其賦值方法

1.4.3 SSR分子標記聚類分析 以12對SSR引物對供試材料進行擴增，采取人工的方法對擴增出的條帶進行統(tǒng)計，在相同的位置，擴增遷移出條帶的記為“1”，無條帶或條帶模糊的記為“0”，構(gòu)成(1，0)矩陣。使用軟件NTSYS 2.10進行遺傳距離分析，計算供試材料之間的遺傳距離，并使用UPGMA進行聚類分析，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于19個表型性狀的聚類分析

基于歐氏距離按UPGMA方法，對20份馬鈴薯品種(系)的19個基本形態(tài)學(xué)性狀進行聚類分析研究(圖1)。結(jié)果表明，在歐氏距離19.6處可將供試材料分為3個類群。第Ⅰ類包括4份材料，分別為萬紫千紅、BJ16、隴薯309、宣薯4號；第Ⅱ類包括2份材料， 分別是東農(nóng)311、云薯1號；其他14份材料聚為第Ⅲ類。

表3 12對SSR引物信息

2.2 12對SSR引物擴增結(jié)果分析

以20份馬鈴薯品種(系)的DNA為模板，利用12對多態(tài)性豐富、條帶清晰的SSR引物對其DNA進行擴增，結(jié)果見圖2和表4。12對SSR引物共擴增出91個等位位點，其中多態(tài)性位點87個，多態(tài)性比率95.6%，平均每對引物擴增7.6個等位位點，7.3個多態(tài)性位點。12對SSR引物擴增出的等位位點在3～20個之間，多態(tài)性位點在1～19個之間，多態(tài)性比率在33.3%～100.0%之間。

2.3 20份馬鈴薯材料的遺傳距離分析

使用NTSYS 2.10軟件計算遺傳距離(表5)，20份馬鈴薯品種(系)間的遺傳距離范圍在0.148 1～0.655 2，平均遺傳距離0.486 9，說明供試材料的遺傳背景差距明顯。其中遺傳距離最近的是荷十四、中薯18號，遺傳距離為0.148 1，遺傳距離最遠的是2014-89-47、麗薯6號，遺傳距離為0.655 2。

2.4 基于SSR分子標記的聚類分析

SSR分子標記聚類分析(圖3)結(jié)果表明，20份馬鈴薯品種(系)的聚類結(jié)果與其遺傳關(guān)系基本保持一致，在遺傳相似系數(shù)為0.51時，可將供試材料分為3個類群。第Ⅰ類包括萬紫千紅1份材料； 第Ⅱ類包括2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21、BJ16、宣薯4號、荷十四、晉薯15號、中薯18號8份材料；第Ⅲ類包括夏坡蒂、隴薯309、東農(nóng)311、德薯3號、青薯168、定薯1號、天薯12號、畢薯4號、蒙薯19號、麗薯6號、云薯1號11份材料。

表4 12對SSR引物擴增結(jié)果

2.5 20份馬鈴薯材料的指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)SSR引物標記結(jié)果，挑選出多態(tài)性好、條帶清晰、重復(fù)性高的SSR引物，構(gòu)建20份馬鈴薯材料指紋圖譜。引物STM1052可以鑒別夏坡蒂、2014-89-61、萬紫千紅、BJ16、東農(nóng)311、德薯3號、宣薯4號、天薯12號、畢薯4號、蒙薯19號、中薯18號、麗薯6號12份供試材料；引物S25可以鑒別萬紫千紅、2011-5-21、BJ16、東農(nóng)311、德薯3號、畢薯4號、蒙薯19號、麗薯6號8份供試材料；結(jié)合引物STM1052和引物S25的擴增結(jié)果構(gòu)建指紋圖譜(表6)，可以把20份供試材料完全區(qū)分開。

表6 20份供試馬鈴薯材料的SSR指紋圖譜

3 討論與結(jié)論

表型性狀聚類結(jié)果表明，表型性狀聚類分析可以較為準確地區(qū)分具有顯著形態(tài)差異的馬鈴薯材料，如在表型聚類中，類群Ⅰ的材料花繁茂、薯皮光滑、分支數(shù)少等；類群Ⅲ的材料絕大多數(shù)植株高、單株產(chǎn)量高、葉綠素含量高等。在徐敏的研究結(jié)果中，表型聚類的群體3中的材料薯形圓形、薯皮黃色、芽眼較深，群體4花繁茂性強、花粉量大、薯肉為白色[16]，本研究結(jié)果與之相似。

SSR分子標記聚類結(jié)果表明，地理來源不同的馬鈴薯材料，在聚類圖中也可能被聚合為一類，如荷十四、晉薯15號、中薯18號被聚合在類群Ⅱ；德薯3號、天薯12號、蒙薯19號被聚合在類群Ⅲ，與王鵬等的研究中，天薯12號、蒙薯19號被聚合在一個類群結(jié)果[17]相似。同一育種單位選育的馬鈴薯材料遺傳差異較小，如由河北北方學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究中心育成的材料2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21親緣關(guān)系較近，張招娟等研究發(fā)現(xiàn)，品種間親緣關(guān)系的遠近程度與育種單位有一定的相關(guān)性[18]，本試驗結(jié)果與之相近。

大多數(shù)馬鈴薯材料在表型性狀聚類圖上和SSR標記聚類圖上都被聚到一個類群當中，如青薯168、定薯1號、天薯12號、畢薯4號、蒙薯19號、麗薯6號在2種聚類圖中都聚合到一起，2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21在2種聚類圖中也都聚合到一起。表明SSR分子標記聚類分析結(jié)果和表型性狀聚類分析結(jié)果具有一定的一致性，植物表型性狀的差別也能夠相應(yīng)反映基因水平的差別。部分馬鈴薯材料在2種聚類分析結(jié)果上表現(xiàn)出差異，劉福翠等研究認為，外界環(huán)境的改變?nèi)菀资柜R鈴薯性狀發(fā)生改變，從而使馬鈴薯基因型發(fā)生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化，最終導(dǎo)致SSR分子標記結(jié)果與形態(tài)學(xué)標記結(jié)果產(chǎn)生差別[19]。段紹光等研究表明，馬鈴薯是同源四倍體，其高度雜合的特性，決定了表型性狀聚類分析不能從本質(zhì)上反映馬鈴薯的遺傳差異，只能反映出不同材料之間表型性狀的差異[20]。本試驗SSR分子標記聚類圖中萬紫千紅與其他材料親緣關(guān)系較遠，單獨聚為一類，而在表型性轉(zhuǎn)聚類圖中萬紫千紅、BJ16、隴薯309、宣薯4號則被聚為一個類群，產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是土壤、水、氣候等不同環(huán)境因素共同影響了植物的形態(tài)學(xué)性狀，導(dǎo)致2種聚類分析結(jié)果產(chǎn)生差異。

本試驗采用20份馬鈴薯品種(系)為供試材料，通過19個表型性狀和12對SSR引物對供試材料進行了表型性狀聚類分析和SSR分子標記聚類分析，并利用2對核心引物(STM1052和S25)構(gòu)建了供試材料的DNA指紋圖譜，為馬鈴薯種質(zhì)資源的利用、親緣關(guān)系分析及品種鑒定提供了理論依據(jù)。