牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1對白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥損傷的研究

魯斌，程加峰，汪洋，冀林，王巖松，趙平*

(1.蕪湖市第一人民醫(yī)院骨一科，安徽 蕪湖 241000；2.哈爾濱市第一醫(yī)院骨一科，黑龍江哈爾濱 150081；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，黑龍江 哈爾濱 150081)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，大約50%的65歲以上和12%的25歲以上人群患有此種疾病[1]。OA的主要病理機(jī)制是軟骨細(xì)胞炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解、關(guān)節(jié)軟骨喪失、軟骨下骨增殖和骨贅形成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失[2]。目前，確定的OA危險(xiǎn)因素包括衰老、肥胖或體重、關(guān)節(jié)損傷史、遺傳、性別和解剖因素[3]。但是，OA的確切分子發(fā)病機(jī)制仍不清楚[4]。關(guān)節(jié)軟骨沒有自我修復(fù)能力，其穩(wěn)態(tài)受到一系列因素的精確調(diào)控，因此了解OA過程中軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)機(jī)制對于尋找OA有效治療方案具有重要意義。研究表明，炎癥參與了OA軟骨細(xì)胞的病理過程[5]。關(guān)節(jié)腔微環(huán)境中的炎癥因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α可能會降低軟骨細(xì)胞的活力并增加壞死和凋亡[6-7]。有研究已經(jīng)確定了某些分子對OA的作用，例如OA期間乙?；?(Sirtuin 1，SIRT1)活性和水平的降低會促進(jìn)軟骨的逐漸喪失，SIRT1抑制人OA軟骨細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13，減少軟骨基質(zhì)的丟失[8]。對OA軟骨細(xì)胞分子功能的不斷探索將有助于本研究找出潛在的新型治療靶點(diǎn)。

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein，DMP-1)是一種酸性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在牙本質(zhì)和骨組織中高表達(dá)，在牙本質(zhì)和骨形成中起到了重要的作用[9]。然而，目前尚未有研究DMP-1在OA軟骨細(xì)胞中的作用。本研究評估了DMP-1在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，并確定了其對軟骨細(xì)胞的生物學(xué)作用。使用體外和體內(nèi)模型評估DMP-1水平，測定了DMP-1對ECM合成、炎癥、細(xì)胞凋亡的影響。這些發(fā)現(xiàn)揭示了DMP-1對OA發(fā)病機(jī)理，為治療OA尋找潛在新型治療靶點(diǎn)提供線索。

1 材料和方法

1.1 Affymetrix微陣列分析 作者從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫下載GSE42295基因表達(dá)數(shù)據(jù)集[(Rat230_2) Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array]，選取3例手術(shù)誘發(fā)的8周大鼠OA模型以及相應(yīng)的對照組，通過DESeq軟件包篩選對照組8周和OA組8周之間鑒別差異表達(dá)基因(differential gene expression，DEG)(P<0.05)[10]，進(jìn)而分析OA大鼠模型中軟骨細(xì)胞的DMP-1的水平。

1.2 建立體外OA模型 挑選新生的SD大鼠(體重5～6 g)，處死大鼠，膝關(guān)節(jié)獲取關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨組織切成1～3 mm3的小塊。在37 ℃下用2 mg/mL膠原酶Ⅱ(Sigma)消化3 h，將消化的軟骨細(xì)胞懸浮在Dulbecco氏培養(yǎng)基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)中，該培養(yǎng)基中添加了1%青霉素/鏈霉素(碧云天)和10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Sciencell公司)。在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，將第3代細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。使用IL-1β(10 ng/mL；Merk公司)刺激軟骨細(xì)胞，建立體外OA模型[11]。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 DMP-1過表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒通過上海吉瑪基因設(shè)計(jì)合成。將軟骨細(xì)胞以每孔5×106個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中過夜，當(dāng)融合達(dá)到70%～80%的密度時(shí)，使用Lipofectamine?3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為以下四組：對照組(軟骨細(xì)胞，未經(jīng)任何處理)；IL-1β組(用IL-1β處理的軟骨細(xì)胞)；IL-1β+pcDNA組(用IL-1β處理并用陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞)和IL-1β+DMP-1組(用IL-1β處理并用DMP-1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞)。

1.4 細(xì)胞活力測定 將軟骨細(xì)胞以每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中，進(jìn)行不同的處理，并培養(yǎng)6、12、24、48或72 h。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)(Dojindo分子技術(shù)公司)法用于測量細(xì)胞活力。向每個(gè)孔中添加20 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)將細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)4 h。選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，并繪制生長曲線。

1.5 糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)檢測 將處理過的軟骨細(xì)胞更換10% FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞10 h，抽取上清液，使用大鼠GAG的酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒(EIAab公司)進(jìn)行檢測，并使用酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)在450 nm處測量吸光度，計(jì)算出樣品濃度。

1.6 免疫熒光檢測 將處理過的軟骨細(xì)胞使用4%的多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗后加入牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)稀釋的Col2a1一抗(Proteintech公司)，37 ℃下孵育2 h后，加入山羊抗兔紅色熒光二抗(Abcam公司)，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染細(xì)胞核后，加入抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.7 軟骨細(xì)胞mRNA的檢測 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測DMP-1、Sox9、Acan、Col2a1的基因表達(dá)水平。提取細(xì)胞中總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用2×Greenstar qPCR Master Mix(Vazyme)進(jìn)行RT-PCR。根據(jù)結(jié)果計(jì)算基因表達(dá)。

1.8 ELISA分析 根據(jù)制造商的說明，使用特定的ELISA試劑盒(R&D Systems)，收集經(jīng)過不同處理的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，檢測炎性細(xì)胞因子(IL-6和TNF-α)的水平。使用酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)測量450 nm處的吸光度。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法(western blot，WB) WB用于定量分析DMP-1、Sox9、Acan、Col2a1。提取總蛋白，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)檢測蛋白質(zhì)的濃度。將每組總共50μg蛋白質(zhì)滴加到10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)凝膠上，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上(Biosharp Life Sciences)。在室溫下，使用5%脫脂牛奶將膜封閉1 h。將膜與一抗在4℃下孵育過夜，然后與二抗共同孵育1h。最后進(jìn)行顯色檢測相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)情況。

1.10 活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染(Calcein-AM/PI)染色 提前配制Calcein-AM/PI染色工作液，用PBS洗滌處理過的細(xì)胞，每孔中加入200 μL染色工作液，在室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌細(xì)胞后，熒光顯微鏡檢測染色結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 體內(nèi)和體外OA模型的軟骨細(xì)胞中DMP-1表達(dá) 使用微陣列分析在OA的體內(nèi)模型中檢測軟骨細(xì)胞中DMP-1的表達(dá)，與對照組相比，8周OA體內(nèi)模型中DMP-1表達(dá)明顯降低(P<0.05；見圖1a～b)，表明DMP-1的下調(diào)可能與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)。IL-1β處理用于建立體外OA模型，RT-qPCR(見圖1c)和WB(見圖1d)檢測DMP-1表達(dá)，結(jié)果IL-1β處理后軟骨細(xì)胞中的DMP-1表達(dá)明顯降低。這些結(jié)果表明，在OA中軟骨細(xì)胞中的DMP-1表達(dá)降低。

a 8周OA和對照組差異性基因表達(dá)火山圖 b DMP-1在OA組和對照組基因表達(dá)差異 c 體外OA模型DMP-1的mRNA的表達(dá) d 體外OA模型DMP-1蛋白的表達(dá)

2.2 DMP-1可提高IL-1β處理后的軟骨細(xì)胞活力 為了觀察DMP-1對IL-1β處理后的軟骨細(xì)胞的作用，使用了DMP-1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞。在過表達(dá)DMP-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過DMP-1處理的軟骨細(xì)胞中DMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加，而陰性對照組質(zhì)粒對DMP-1表達(dá)沒有顯著影響(見圖2a～c)。CCK-8分析用于評估細(xì)胞的生存能力，結(jié)果表明DMP-1+pcDNA陰性對照組質(zhì)粒和對未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒軟骨細(xì)胞的生長速度沒有顯著區(qū)別。但是，DMP-1的過表達(dá)增加了用IL-1β處理的軟骨細(xì)胞的生長速度(見圖2d)。

2.3 DMP-1減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞變性 軟骨細(xì)胞的變性主要表現(xiàn)為GAG水平降低和軟骨特異性基因(包括Col2a1、Sox9和Acan)的表達(dá)降低。而且，ELISA檢測表明與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中GAGs水平增加(見圖3a)。細(xì)胞免疫熒光染色也表明，與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中Col2a1的表達(dá)增加(見圖3b)。另外，軟骨特異性基因的表達(dá)與上述結(jié)果一致。與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中Sox9、Acan和Col2a1(見圖4a)mRNA的表達(dá)水平均增加，還評估了Sox9、Acan、Col2a1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平也同時(shí)上調(diào)(見圖4b)。結(jié)果表明，DMP-1的過表達(dá)減輕了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞變性。

a 未經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染DMP-1后mRNA表達(dá)水平 b 經(jīng)過IL-1β處理的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染DMP-1后mRNA表達(dá)水平 c 經(jīng)過IL-1β處理的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染DMP-1后的蛋白表達(dá)水平 d 轉(zhuǎn)染DMP-1后不同條件下軟骨細(xì)胞生長速度比較

a 不同條件下軟骨細(xì)胞分泌的GAG定量分析 b 不同條件下軟骨細(xì)胞Col2a1免疫熒光表達(dá)情況(免疫熒光，×400)

a 不同處理?xiàng)l件下軟骨細(xì)胞Sox9、Acan、Col2a1 mRNA的表達(dá)

b 不同處理?xiàng)l件下軟骨細(xì)胞Sox9、Acan、Col2a1蛋白的表達(dá)

2.4 DMP-1減少IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥 檢測DMP-1對軟骨細(xì)胞炎癥的影響。ELISA法顯示，與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中OA中關(guān)鍵炎癥因子(如IL-6和TNF-α)的含量均降低(見圖5a)。此外，IL-1β+DMP-1組中細(xì)胞的凋亡率低于IL-1β組(見圖5b～c)。結(jié)果表明，DMP-1的過表達(dá)減輕了用IL-1β刺激處理的軟骨細(xì)胞的炎癥和凋亡。

a 不同處理?xiàng)l件下IL-6、TNF-α表達(dá)水平 b Calcein-AM/PI染色檢測細(xì)胞活力(免疫熒光，×200)

c 不同組軟骨細(xì)胞凋亡率

3 討 論

OA是關(guān)節(jié)最常見的疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨受損。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成。軟骨細(xì)胞的主要功能是分泌ECM蛋白，例如Acan和Col2a1，以維持關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)[12]。軟骨細(xì)胞功能的改變伴隨著軟骨基質(zhì)的變性，并最終導(dǎo)致OA的發(fā)生和發(fā)展。保護(hù)或拯救軟骨細(xì)胞的功能可有助于減輕OA的進(jìn)展[13]。盡管有研究報(bào)道了OA軟骨細(xì)胞潛在靶點(diǎn)和機(jī)制，但由于缺乏敏感性和特異性，因此探索OA軟骨細(xì)胞新的靶點(diǎn)及發(fā)病機(jī)制顯得刻不容緩。本研究發(fā)現(xiàn)DMP-1在OA軟骨細(xì)胞中下調(diào)，DMP-1的過度表達(dá)減輕了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞變性、炎癥、細(xì)胞凋亡。因此，突出了DMP-1對OA軟骨細(xì)胞的潛在作用，結(jié)果表明DMP-1可能是有治療前景的OA新靶點(diǎn)。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對軟骨發(fā)育有重要調(diào)控作用。有研究表明DMP-1是軟骨發(fā)育過程中特異性表達(dá)的基質(zhì)蛋白，在DMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠的關(guān)節(jié)軟骨層增厚，其軟骨細(xì)胞數(shù)量增加，Sox9、Col Ⅱ、Col X、Acan等軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)[14]。有學(xué)者研究表明，在OA患者的膝關(guān)節(jié)樣本中觀察到了DMP-1蛋白的分級特異性抑制，在半月板切除術(shù)誘導(dǎo)的OA模型中，Mankin評分的增加伴隨著DMP-1表達(dá)的逐漸減少，DMP-1可能在維持軟骨生成表型中發(fā)揮重要作用，并可能參與骨關(guān)節(jié)炎等疾病條件下軟骨基質(zhì)重構(gòu)和降解的改變[15-16]。另外有學(xué)者研究DMP-1可通過降低氧化應(yīng)激和抑制轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β信號通路激活來減緩大鼠糖尿病腎病損傷的病理過程，保護(hù)腎臟[16]。

在本研究中，DMP-1在OA的軟骨細(xì)胞中表達(dá)降低，這表明DMP-1參與了OA的發(fā)病。在正常情況下軟骨基質(zhì)的合成和分解處于一個(gè)動態(tài)平衡中，轉(zhuǎn)錄因子Sox9是維持軟骨細(xì)胞表型的重要分子，能激活一系列下游信號分子，以促進(jìn)Col2a1、Acan和GAG的沉積[17]。在OA患者中有許多炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α可以抑制Sox9的表達(dá)并降低軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)[18]。所以降低炎癥水平和恢復(fù)軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是延緩OA進(jìn)展的重要措施。本研究中用IL-1β處理的軟骨細(xì)胞，觀察到炎癥刺激降低了GAG的水平，而DMP-1的過表達(dá)恢復(fù)了GAG的沉積。DMP-1的過表達(dá)降低了IL-1β對軟骨細(xì)胞中Sox9、Acan和Col2a1表達(dá)的抑制作用。此外，DMP-1過表達(dá)可以減輕IL-6和TNF-α的水平，同時(shí)抑制IL-1β處理的軟骨細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明，DMP-1對軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、炎癥和細(xì)胞凋亡均具有保護(hù)作用。

綜上所述，DMP-1在OA中表達(dá)降低，并且與OA的進(jìn)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)DMP-1參與了軟骨細(xì)胞的動態(tài)平衡，DMP-1的過表達(dá)恢復(fù)了OA中軟骨細(xì)胞的表型、減輕了炎癥和細(xì)胞凋亡。因此，DMP-1可能是OA研究和治療中的潛在重要靶點(diǎn)。