副豬嗜血桿菌與PCV3 混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷及分析

趙自亮，田宇森，莊鴻琨，李婕，朱桓奕，劉霞，楊曉偉，，張立武，趙光偉，

（1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng) 550008；3.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司，重慶 402460）

副豬嗜血桿菌病也稱格拉澤氏?。℅lasser's disease）[1]，是養(yǎng)豬業(yè)中影響較為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，臨床上往往與其他呼吸系統(tǒng)疾病或免疫抑制性疾病病原，如豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等發(fā)生混合感染，單獨(dú)感染時(shí)則以豬多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征，呈現(xiàn)出高發(fā)病率、高死亡率特點(diǎn)[2]。該病由隸屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起。Hps 無(wú)鞭毛和芽孢，為革蘭陰性短小桿菌，目前已發(fā)現(xiàn)15種血清型[3]。不同Hps血清型毒力差異較大，交叉保護(hù)力較低，且不同時(shí)空分離菌株的主要生物學(xué)特性存在較大差異，因而盡管目前有防控該病的商品化疫苗，但其預(yù)防效果存在地區(qū)差異。臨床上，抗生素仍是當(dāng)前防治副豬嗜血桿菌病的主要手段，但長(zhǎng)期不合理地用藥造成的耐藥問(wèn)題較為突出。

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的閉合單股環(huán)狀DNA 病毒，有多種血清型，其中PCV3 于2016 年首次在患有皮炎腎病綜合征的母豬及流產(chǎn)胎兒的組織病料中被檢出[4]，隨后世界范圍內(nèi)陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒。我國(guó)在遼寧、江西和重慶等地也檢測(cè)到PCV3[5]?，F(xiàn)有資料表明，PCV3 單獨(dú)感染會(huì)導(dǎo)致壞死性心肌炎、間質(zhì)性肺炎以及輕度的淋巴細(xì)胞性肝炎及免疫器官淋巴細(xì)胞消耗型炎癥等，與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）癥狀較為相似[6]。盡管PCV3 分離困難，但通過(guò)病毒拯救獲得的PCV3 病毒粒子可以導(dǎo)致4 周齡和8 周齡仔豬產(chǎn)生與豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）相似的臨床癥狀[7]，因而PCV3 的致病性不容忽視。鑒于對(duì)PCV3 感染尚無(wú)商品化疫苗及治療藥物，目前對(duì)其防控仍是一大難點(diǎn)。

本研究對(duì)重慶市某豬場(chǎng)發(fā)生的表現(xiàn)發(fā)熱和呼吸道癥狀的疫病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，確定為Hps 和PCV3 的混合感染，進(jìn)而對(duì)Hps 分離株的主要生物學(xué)特征以及PCV3 的基因組特征進(jìn)行了分析，以期為這兩種病原混合感染的臨床綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料及發(fā)病情況

重慶市某豬場(chǎng)（存欄基礎(chǔ)母豬300 頭）育肥豬中出現(xiàn)以發(fā)熱和呼吸道癥狀為典型特征的疾病，發(fā)病率約為25%，死亡率約為20%；剖檢病死豬發(fā)現(xiàn)，肺臟有纖維素膜覆蓋，出血、腫脹明顯，心包內(nèi)有大量積液。無(wú)菌采集病死豬心包液和肺臟組織至冰盒中，低溫迅速送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；特級(jí)胎牛血清（FBS）和一管式臨床樣品DNA 抽提試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、2×RapidTaqMaster Mix 和DL 2 000 Plus DNA Marker，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物合成及測(cè)序，均在北京六合華大基因重慶分公司完成。

1.3 病料PCR 檢測(cè)

根據(jù)臨床表現(xiàn)及剖檢病理變化，參考已發(fā)表的RT-PCR 或PCR 方法，對(duì)組織病料進(jìn)行傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）[8]、Hps[9]、豬瘟病毒（CSFV）[10]、PRRSV[11]、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mps）[12]、PCV2 和PCV3[13]等 病原的核酸檢測(cè)。病料組織勻漿后，利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit 提取核酸，其中提取的DNA用于App、Hps、Mps、PCV2 和PCV3 檢測(cè)，提取的RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于CSFV 和PRRSV 檢測(cè)。病原檢測(cè)及PCV3 全長(zhǎng)擴(kuò)增用引物序列、目的片段大小及退火溫度等見(jiàn)表1。

表1 病原檢測(cè)及PCV3 全長(zhǎng)擴(kuò)增用引物信息

1.4 細(xì)菌分離

用接種環(huán)無(wú)菌鉤取肺臟深層組織以及心包液接種兔血TSA 平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，5% CO2厭氧培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及菌落特征，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行二次純化培養(yǎng)36～48 h；將純化后的單個(gè)菌落接種于含有5%胎牛血清（FBS）的TSB 培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，革蘭氏染色后鏡檢觀察其形態(tài)，后加無(wú)菌甘油凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 16S rDNA 測(cè)序鑒定及同源性分析

利用一管式臨床樣品DNA 抽提試劑盒提取純培養(yǎng)細(xì)菌基因組，參考焦振泉[14]報(bào)道的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化后送華大基因科技有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果利用NCBI 的Blast 功能進(jìn)行比對(duì)，確定分離菌種類。

1.6 Hps 血清型鑒定

1.7 分離菌生長(zhǎng)曲線繪制

將純化培養(yǎng)菌接種于含5% FBS 的TSB 中，37 ℃ 180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h；將上述菌液按1%的體積分?jǐn)?shù)接種于含5% FBS 的5 mL 滅菌TSB 中，設(shè)3 個(gè)平行組，共15 組，以未接菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每隔2 h 取一組測(cè)定OD600nm，計(jì)算樣品與空白對(duì)照差值的平均值，連續(xù)測(cè)定30 h，繪制分離菌株生長(zhǎng)曲線。

1.8 分離菌藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的Kriby-Bauer 紙片擴(kuò)散法，對(duì)分離菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和四環(huán)素類共23 種藥物的敏感性試驗(yàn)，參照藥敏紙片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行耐藥（R）、中介（I）和敏感（S）分析。具體步驟：取分離菌純化培養(yǎng)物調(diào)整菌液濃度為0.5 麥?zhǔn)媳葷岫?，均勻涂布于兔血TSA 平板，培養(yǎng)36 h，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.9 分離菌耐藥基因檢測(cè)

對(duì)分離菌分別進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類[17-20]、氨基糖苷類[21]和四環(huán)素類[22]藥物的49 種常見(jiàn)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)分析，其中β-內(nèi)酰胺類包括blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaPER、blaSIM、blaDHA、blaADC、blaEBC、blaCIT、blaACC、blaCMY、blaMOX、blaFOX、blaPSE、blaIMP、blaVIM、blaOprD2、blaGES、blaMIR、blaISAbal、blaCARB、blaGIM、blaSPM、blaCMY-1、blaKPC-gp、blaNMC和blaACT-1共27 種，氨基糖苷類包括strA、strB、aadB、aac(3)-IV、aph3'-III、aacC2和aphA1共7 種，四環(huán)素類包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetM、tetO、tetS、tetZ、tet31、tet33和tet34共15 種。

1.10 PCV3 全基因組擴(kuò)增與拼接

參考Fux 等[23]報(bào)道，合成3 對(duì)引物（表1）對(duì)病料進(jìn)行3 段PCV3 基因組擴(kuò)增；PCR 產(chǎn)物純化測(cè)序后，利用DNAstar 7.0 軟件進(jìn)行拼接，獲得PCV3 全基因組序列，并將該序列信息上傳至GenBank。

1.11 PCV3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及基因型鑒定

將本試驗(yàn)獲得的PCV3 基因組序列與國(guó)內(nèi)22 個(gè)省份分離的及美國(guó)最早報(bào)道的毒株信息進(jìn)行比較，參考毒株全序列包括PCV3a 基因型9 株（MH177453、MH823221、MK105924、M K 1 7 8 2 9 7、M K 1 7 8 3 2 0、M T 2 2 8 7 0 3、OK334614、OL422143、KT869077），PCV3b 基因型5 株（MH607133、MK142773、MK178285、MN605937、MN790776），PCV3c 基因型9株（KY075990、MF072716、MG372486、MG564175、MH683051、MK656956、MN507536、MZ934695、MZ449237）；利用MEGA 7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行基因型鑒定。

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢

臨床剖檢患病豬，可見(jiàn)心包中有大量渾濁積液（圖1-A），并混有血液；肺臟表面被乳白色纖維素性膜覆蓋（圖1-B），并與胸腔發(fā)生粘連，剝?nèi)ケ荒ず蠓闻K出血、腫脹明顯。

圖1 發(fā)病豬剖檢結(jié)果

2.2 病料PCR 檢測(cè)

PCR 檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，病料樣本中Hps和PCV3 兩種病原均為陽(yáng)性，其余5 種病原（App、PCV2、CSFV、PRRSV 和Mps）均為陰性。

對(duì)所選用的太陽(yáng)能電池組件和蓄電池，有必要對(duì)它們的設(shè)計(jì)進(jìn)行校核，以進(jìn)一步了解系統(tǒng)運(yùn)行中可能出現(xiàn)的情況，保證太陽(yáng)能電池組件和蓄電池可以有效、協(xié)調(diào)工作。

圖2 病料PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 分離菌培養(yǎng)及形態(tài)特征

病料接種兔鮮血瓊脂平板于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h 后，可見(jiàn)無(wú)色透明、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)的圓形小菌落，菌落周圍有溶血環(huán)（圖3-A）；純培養(yǎng)的細(xì)菌為革蘭氏陰性，多單個(gè)存在，呈球狀、短桿狀，部分以短鏈排列，呈絲狀排布（圖3-B）。

圖3 分離菌培養(yǎng)及形態(tài)結(jié)果

2.4 分離菌16S rDNA 基因擴(kuò)增及進(jìn)化樹(shù)分析

分離菌的16S rDNA 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4-A。測(cè)序后經(jīng)Blast 比對(duì)，該菌與Hps 江西株（JN031031）同源性為100%（圖4-B），可以確定分離菌為Hps，將其命名為YY-1。該序列已上傳GenBank，登錄號(hào)為ON645281。YY-1 與貴州、湖南、云南的Hps 菌株同源性較高，但與四川、江蘇的同源性較低，說(shuō)明Hps 在我國(guó)存在一定地域差異。

圖4 YY-1 株16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果及其與巴氏桿菌科主要成員的同源性比較結(jié)果

2.5 YY-1 菌株生長(zhǎng)曲線

Hps YY-1 株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果（圖5）顯示，該菌0～4 h 內(nèi)生長(zhǎng)較為緩慢，4 h 后上升趨勢(shì)明顯，10～14 h 上升最為顯著，為該菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 h 后吸光值（OD600nm）趨于平緩，進(jìn)入平臺(tái)期。

圖5 YY-1 株在TSB 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.6 YY-1 菌株血清型鑒定

利用PCR 方法對(duì)YY-1 菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌血清5 型wcwk基因擴(kuò)增出450 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符，經(jīng)測(cè)序比對(duì)確定YY-1 菌株為血清5 型（圖6）。

圖6 YY-1 菌株血清型鑒定結(jié)果

2.7 YY-1 菌株藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果顯示：YY-1 菌株對(duì)頭孢他啶、苯唑西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素、米諾環(huán)素、多黏菌素B 和四環(huán)素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)頭孢氨芐、丁胺卡那、氟苯尼考表現(xiàn)為中介，對(duì)頭孢曲松、氨芐西林、羧芐西林、青霉素、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定和多西環(huán)素等藥物表現(xiàn)為敏感。

2.8 YY-1 菌株耐藥基因檢測(cè)

PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：YY-1 菌株中含有9 種耐藥基因，分別是β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaVIM、blaISAbal、blaCARB和blaCMY-1（圖7-A、B），氨基糖苷類耐藥基因aadB（圖7-C）和四環(huán)素類耐藥基因tetB、tetK、tetM、tetO（圖7-D）

圖7 YY-1 株β 內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.9 PCV3 全基因組擴(kuò)增

以送檢樣本提取的DNA 為模板進(jìn)行PCV3 分段擴(kuò)增。結(jié)果（圖8）顯示：經(jīng)測(cè)序拼接，PCV3全基因組全長(zhǎng)2 000 bp，GC 含量為50.45%；主要開(kāi)放閱讀框ORF1（216～1 106 nt）編碼的復(fù)制酶蛋 白（replication-associated protein）共296 aa，ORF2（1 336～1 980 nt）編碼的衣殼蛋白（capsid protein），共214 aa；ORF1 無(wú)經(jīng)典起始密碼子ATG，且ORF2 與ORF1 編碼方向相反。將其命名為PCV3-CQ-YunYang，序列信息上傳GenBank（登錄號(hào)：ON505646）。

圖8 PCV3-CQ-YunYang 株全基因組擴(kuò)增結(jié)果

2.10 PCV3 全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及基因型分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖9）顯示：本試驗(yàn)分離毒株與吉林MK178320 株位于同一分支，具有最高的同源性；與廣西MH823221 株和美國(guó)最早報(bào)道的KT869077 株也具有較高的親緣關(guān)系?；贑ap 蛋白氨基酸序列24/27 位點(diǎn)分型方法，確定本試驗(yàn)分離毒株為3a 基因型。

圖9 PCV3-CQ-YunYang 全基因組序列與參考毒株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

多病原混合感染是當(dāng)前豬病的典型特征之一，引起的癥狀更加復(fù)雜，僅憑臨床表現(xiàn)往往無(wú)法準(zhǔn)確判斷其病因，需借助實(shí)驗(yàn)室手段嚴(yán)格檢驗(yàn)并與臨床結(jié)合方能得出準(zhǔn)確結(jié)果。本試驗(yàn)中豬場(chǎng)發(fā)生的病情也符合這一點(diǎn)，剖檢結(jié)果與多種病原感染較為相似，單靠肉眼觀察并不能確定病因，因而實(shí)驗(yàn)室診斷十分必要。此外，一些新興的診斷技術(shù)和方法應(yīng)在臨床中廣泛推廣，這樣有利于提升診斷效率，迅速確定病因，從而降低經(jīng)濟(jì)損失。

Hps 是豬場(chǎng)中常見(jiàn)的細(xì)菌性病原，利用分子生物學(xué)技術(shù)可將其分為1～15 個(gè)血清型，其中1、5、10、12、13、14 型為高毒力型，2、4、8、15 型為中等毒力型，3、6、7、9、11 型為無(wú)毒力型[3]。根據(jù)以往的報(bào)道，2007—2014 年我國(guó)的優(yōu)勢(shì)血清型為2、4、5、12、13 型[24]，2014—2020 年為4、5、7、13、14 型[25]，2020—2021 年為4、5、12、13 型[26]，可以看出4、5、13 型是在我國(guó)長(zhǎng)期流行的優(yōu)勢(shì)血清型。本試驗(yàn)自重慶市分離到的YY-1 菌株，經(jīng)鑒定為血清5 型，與上述報(bào)道的優(yōu)勢(shì)血清型一致。

Hps 另一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是耐藥性嚴(yán)重。盡管目前已有針對(duì)Hps 的商品化疫苗（2 價(jià)、3 價(jià)、4 價(jià)），但由于在使用過(guò)程中往往并不清楚養(yǎng)殖場(chǎng)流行的優(yōu)勢(shì)菌株血清型，容易造成免疫失敗，因而很多養(yǎng)殖場(chǎng)仍主要采用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，導(dǎo)致菌株耐藥現(xiàn)象非常普遍。孫華潤(rùn)等[27]對(duì)河南、湖北、湖南、山西、陜西、安徽和江西等7 個(gè)省份分離的104 株Hps 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類氨芐西林耐藥率為39.4%，對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星耐藥率分別為51.9%和51.0%，對(duì)氨基糖苷類卡那霉素耐藥率為10.6%，使得養(yǎng)殖場(chǎng)有效防控Hps 感染的藥物逐漸減少。本試驗(yàn)分離的YY-1 菌株對(duì)多數(shù)的頭孢類藥物仍表現(xiàn)為敏感，但對(duì)氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物敏感性較差，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性；隨后的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果也與之基本相符，頭孢類耐藥基因共檢出blaVIM、blaISAbal、blaCARB和blaCMY-1，四環(huán)素類耐藥基因（tetB、tetK、tetM、tetO）和氨基糖苷類耐藥基因aadB均有檢出，這也充分暴露出Hps 耐藥嚴(yán)重的問(wèn)題。

PCV3 是近幾年剛發(fā)現(xiàn)但其實(shí)早已在豬場(chǎng)流行的，與PMWS、PDNS 等密切相關(guān)的病毒，目前對(duì)該病毒致病性研究的報(bào)道較少，主要是因?yàn)镻CV3分離困難。研究人員曾嘗試將陽(yáng)性病料接種到傳代細(xì)胞系PK15 和ST 細(xì)胞中，但由于不出現(xiàn)細(xì)胞病變而導(dǎo)致分離失敗[4]。盡管如此，PCV3 的致病性不容忽視。呂志凱等[6]對(duì)PCV3 自然感染仔豬病例進(jìn)行病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PCV3 單獨(dú)感染病豬呈現(xiàn)典型的PMWS 癥狀，且病毒主要位于單核和巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中；Jiang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)病毒拯救獲得的PCV3 病毒粒子可使仔豬產(chǎn)生PDNS 癥狀。因而對(duì)PCV3 臨床感染病例進(jìn)行研究是必要的。本研究中的患病豬由于是PCV3 和Hps 的混合感染，比單獨(dú)感染引起的癥狀更為復(fù)雜。

基于PCV3 Cap 蛋白第24 位和27 位氨基酸差 異，將PCV3 基因型分為PCV3a、PCV3b 和PCV3c。本試驗(yàn)檢測(cè)到的病毒屬于3a 亞型，其第24 位和27 位氨基酸分別為丙氨酸（A）和精氨酸（R），這與2020 年在重慶市所檢測(cè)到毒株基因型一致[28]，說(shuō)明PCV3a 可能是該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型。

病原混合感染往往會(huì)導(dǎo)致比單一感染更加嚴(yán)重的后果。本病例也存在類似情況，其發(fā)病率和死亡率均高于單一病原感染，但Hps 與PCV3 在感染過(guò)程中是否是某一病原起主導(dǎo)作用，或者是先感染某一病原，而后繼發(fā)感染另一病原，其準(zhǔn)確的感染機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。盡管如此，本研究對(duì)Hps和PCV3 的主要生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，其結(jié)果可為臨床疫病防控提供參考。