蔡文博
(常州市金壇區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,江蘇常州 213200)
口蹄疫(foot and mouth disease,F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,F(xiàn)MDV)感染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病,可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)將其列為須通報(bào)動(dòng)物傳染病,我國(guó)將其規(guī)定為一類動(dòng)物疫病[1]。目前,我國(guó)仍是受FMD 危害較為嚴(yán)重的國(guó)家之一,主要流行O 型和A 型[2]。
FMD 是我國(guó)優(yōu)先防治病種之一,對(duì)其控制與消滅需要借助科學(xué)的檢測(cè)手段。目前,常用的FMDV 抗體檢測(cè)方法主要有病毒中和試驗(yàn)(VNT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。ELISA 因在FMDV 抗體檢測(cè)中具有敏感、特異、穩(wěn)定、安全等特點(diǎn)而備受青睞[3]。其中,液相阻斷ELISA(LPB-ELISA)是檢測(cè)FMDV 的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法[4],也是我國(guó)FMD 診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中認(rèn)可的檢測(cè)方法。但該方法操作步驟繁瑣,每塊反應(yīng)板檢測(cè)數(shù)量少,試驗(yàn)所需時(shí)間長(zhǎng)[1]。目前市面上有一種固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA(SPC-ELISA)抗體定性檢測(cè)試劑盒,它不需要對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋,每塊反應(yīng)板的檢測(cè)量由LPB-ELISA 的最多20 份增多至92 份,從而有效解決了ELISA 定量檢測(cè)方法不適合大批量檢測(cè)的問(wèn)題,但其尚未列入國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
近年來(lái),基層畜牧獸醫(yī)部門技術(shù)人員短缺是我國(guó)大多數(shù)地區(qū)普遍存在的問(wèn)題。為減輕基層技術(shù)人員檢測(cè)壓力,需要一種操作簡(jiǎn)單、適合大批量快速檢測(cè)的方法。為評(píng)價(jià)SPC-ELISA 定性檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)性能,本研究以2022 年春季從常州市金壇區(qū)采集的300 份豬、牛、羊血液樣本為試驗(yàn)對(duì)象,分別應(yīng)用SPC-ELISA 定性和LPB-ELISA 定量檢測(cè)方法同時(shí)進(jìn)行O 型、A 型FMDV 抗體檢測(cè),并以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法LPB-ELISA檢測(cè)結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn),比較兩種方法的符合率和一致性,以期為技術(shù)人員在實(shí)際工作中科學(xué)選擇檢測(cè)方法提供依據(jù)。
分兩批次抽檢常州市金壇區(qū)2 家規(guī)模豬場(chǎng),其中一家免疫的是新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬O 型、A 型FMDV 二價(jià)滅活苗,另一家免疫的是中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)的豬O 型、A 型FMDV 二價(jià)滅活苗,每次每場(chǎng)采集30 份血樣;分2 批次抽檢 1 家規(guī)模牛場(chǎng),免疫的是金宇保靈生物藥品有限公司生產(chǎn)的O 型、A 型二價(jià)滅活苗,每次采集30 份血樣;抽檢2 家規(guī)模羊場(chǎng),其中一家分2 批次采集,另一家采集1次,免疫的是中牧實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的O 型、A 型FMDV 二價(jià)滅活苗,每次每場(chǎng)采集30 份血樣。另外,采集未免疫家畜血樣30 份,作為陰性對(duì)照。共采集血液樣本300 份。
O 型FMDV 抗體LPB-ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20210922101-5)、A 型FMDV 抗 體LPBELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20210910103-1),購(gòu)自蘭州獸研生物科技有限公司;O 型FMDV 抗體SPC-ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):TE210802)、A型FMDV 抗體 SPC-ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):E211002-1),購(gòu)自洛陽(yáng)萊普生信息科技有限公司。試劑均在有效期內(nèi)使用。
酶標(biāo)儀(型號(hào):iMark),購(gòu)自Bio-Rad 公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào):DHP-420),購(gòu)自常州崢嶸儀器有限公司;微量移液器,購(gòu)自Eppendorf 公司。
血樣采集后,室溫靜置2 h,4 000 r/min 離心5 min,分離血清,-20 ℃凍存?zhèn)溆?。分別應(yīng)用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 對(duì)所有血清樣品進(jìn)行O型和A 型FMDV 抗體檢測(cè)。
LPB-ELISA 選擇20 份檢測(cè)樣品布局。在U型反應(yīng)板的A1~10、E1~10 孔分別加入87.5 μL PBST 和12.5 μL 被檢血清;B1~10、C1~10、D1~10、F1~10、G1~10、H1~10 各孔加入50.0 μL PBST,以50.0 μL/孔的量用PBST 2 倍連續(xù)稀釋血清,A1~10 孔的血清樣品稀釋至D1~10 孔后棄掉50.0 μL,E1~10 孔的血清樣品稀釋至H1~10 孔后棄掉50.0 μL。被檢血清即在第1~10 列從1:8 稀釋至1:64;在第11 列陽(yáng)性對(duì)照血清,從1:2(即A11 孔50.0 μL PBST 加50 μL 陽(yáng)性對(duì)照血清)稀釋至1:256;A12—B12 孔陰性對(duì)照,從1:2 稀釋至1:4;E12—H12 孔為病毒抗原對(duì)照孔。試驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
LPB-ELISA:牛羊抗體效價(jià)≥27,豬抗體效價(jià)≥26,判定為個(gè)體免疫合格,即為陽(yáng)性,否則為陰性。
SPC-ELISA:O 型抗體S/N<0.4,判定為抗體陰性,S/N≥0.4,判定為抗體陽(yáng)性;A 型抗體S/N<0.7,判定為抗體陰性,S/N≥0.7,判定為抗體陽(yáng)性。
應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8 中的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)與分析。其中,P≤0.01為差異極顯著,0.01 <P≤0.05 為差異顯著,P>0.05 為差異不顯著。采用Kappa 統(tǒng)計(jì)量分析兩種ELISA 檢測(cè)方法的一致性[5],Kappa 統(tǒng)計(jì)量一致性強(qiáng)度參考判斷指標(biāo):將Kappa 值從大到小劃分為6 個(gè)區(qū)段,分別代表一致性強(qiáng)弱程度。Kappa值<0,為極差;0~0.2,為微弱;>0.2~0.4,為弱;>0.4~0.6,為中度;>0.6~0.8,為高度;>0.8~1.0,為極強(qiáng)[6]。應(yīng)用公式(1)計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。
式中,P0為符合率,Aii為c×c表中主對(duì)角線上的實(shí)際值,N為總計(jì)數(shù)[5]。
從表1 可以看出,應(yīng)用SPC-ELISA 檢測(cè)的O 型FMDV 抗體陽(yáng)性率(88.15%)總體略高于LPB-ELISA(85.93%),但差異不顯著(P>0.05)。不同畜種兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果有所區(qū)別,但差異不顯著(P>0.05)。其中:豬的SPCELISA 抗體陽(yáng)性率(97.50%)高于LPB-ELISA(90.83%),牛的SPC-ELISA 抗體陽(yáng)性率(93.33%)低于LPB-ELISA(96.67%),羊的二者相等,均為72.22%。兩種方法檢測(cè)陰性對(duì)照樣品的O 型FMDV 抗體陽(yáng)性率均為0。
表1 O 型FMDV 抗體LPB-ELISA與SPC-ELISA 檢測(cè)結(jié)果
從表2 可以看出,應(yīng)用SPC-ELISA 檢測(cè)的A型FMDV 抗體陽(yáng)性率(85.56%)總體略高于LPBELISA(81.48%),但差異不顯著(P>0.05)。除兩種方法檢測(cè)羊A 型FMDV 抗體陽(yáng)性率相同外,SPC-ELISA 檢測(cè)豬和牛的抗體陽(yáng)性率均高于LPBELISA,但差異不顯著(P>0.05)。兩種方法檢測(cè)陰性對(duì)照樣品的A 型FMDV 抗體陽(yáng)性率均為0。
表2 A 型FMDV 抗體LPB-ELISA與SPC-ELISA 檢測(cè)結(jié)果
2.3.1 O 型抗體 根據(jù)表3 可以得出,兩種方法的總符合率為94.81%[P0=(228+28)/270=0.948 1];Kappa 值為0.8,表明一致性強(qiáng)度為高度。應(yīng)用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 同時(shí)檢測(cè)羊O型FMDV 抗體,兩者的總符合率為100%[P0=(65+25)/90=1],即為完全符合。
表3 O 型FMDV 抗體SPC-ELISA 與LPB-ELISA檢測(cè)結(jié)果一致性比較 單位:份
2.3.2 A 型抗體 根據(jù)表4 可以得出,兩種方法的總符合率為91.48%[P0=(214+33)/270=0.914 8];Kappa 值為0.7,表明一致性強(qiáng)度為高度。應(yīng)用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 檢測(cè)羊A 型FMDV 抗體,兩者的總符合率為100%[P0=(65+25)/90=1],即為完全符合。
表4 A 型FMDV 抗體SPC-ELISA 與LPB-ELISA檢測(cè)結(jié)果一致性比較 單位:份
LPB-ELISA 是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的FMDV 抗體定量檢測(cè)方法,敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好,但操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求較高,不適合基層大批量檢測(cè),多適用于科學(xué)研究、比對(duì)試驗(yàn)等有特殊需要或考察檢測(cè)能力的場(chǎng)景。2018 年后,我國(guó)在《口蹄疫診斷技術(shù)》(GB/T 18935—2018)[7]和《2022 年國(guó)家動(dòng)物疫病免疫技術(shù)指南》中均增加了SPC-ELISA 定量檢測(cè)方法。SPC-ELISA 定量檢測(cè)方法延續(xù)了LPB-ELISA 方法的優(yōu)點(diǎn)[8],而且特異性更高,結(jié)果更為穩(wěn)定[9],但仍未解決操作繁瑣、檢測(cè)通量少等問(wèn)題。而SPCELISA 定性檢測(cè)試劑盒,操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短,1 塊反應(yīng)板同時(shí)能檢測(cè)92 份血清樣品,可大大提高檢測(cè)效率,較適合于流行病學(xué)調(diào)查等的大批量檢測(cè)以及基層獸醫(yī)工作人員使用。SPC-ELISA 定性檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯,但還不是國(guó)標(biāo)中規(guī)定的檢測(cè)方法。
為驗(yàn)證兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合度和一致性,便于檢測(cè)人員根據(jù)具體情況選擇一種更適合的方法,對(duì)2022 年春季采集的規(guī)模豬場(chǎng)、牛場(chǎng)、羊場(chǎng)共300 份血液樣本,分別用LPB-ELISA 試劑盒和SPC-ELISA 定性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行O 型、A 型FMDV 抗體測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SPC-ELISA 檢測(cè)O 型和A 型FMDV 抗體的陽(yáng)性率均總體略高于LPB-ELISA,但差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明兩種方法的陽(yáng)性檢出率相當(dāng)。
本試驗(yàn)采用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 測(cè)得的羊O 型、A 型FMDV 抗體總符合率均為100%,即完全符合,測(cè)得的陰性對(duì)照樣品抗體陽(yáng)性率均為0,也為完全符合。應(yīng)用兩種方法,對(duì)接種了不同廠家疫苗的不同畜種、不同免疫時(shí)段的血清,同時(shí)進(jìn)行O、A 型FMDV 抗體檢測(cè),所得總符合率均在90%以上,Kappa 值均大于0.6,表現(xiàn)出高度一致,說(shuō)明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合程度高,一致性強(qiáng)。朱愛(ài)發(fā)[1]分別應(yīng)用LPB-ELISA和SPC-ELISA定量、定性檢測(cè)豬O 型FMDV 抗體,發(fā)現(xiàn)兩種方法的總符合率為91.67%,符合程度高。陳小麗等[10]應(yīng)用同樣的兩種方法檢測(cè)A 型FMDV 抗體,發(fā)現(xiàn)總符合率為90.00%,Kappa 值為0.8,證明二者的符合率和一致性均較高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。
雖然應(yīng)用兩種方法檢測(cè)豬、牛的符合率略低,但對(duì)于結(jié)果不一致的樣品,其LPB-ELISA 抗體效價(jià)均在陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)的±1 滴度以內(nèi),屬于正常誤差范圍。因LPB-ELISA 對(duì)操作要求較高,其準(zhǔn)確性受多種因素影響,當(dāng)樣品抗體水平剛好處于臨界值附近時(shí),較易出現(xiàn)與SPC-ELISA 結(jié)果不符合的情況。之所以兩種方法檢測(cè)不同畜種的符合率有所差別,可能與樣品質(zhì)量有關(guān)。ELISA 對(duì)血清樣品質(zhì)量要求較高,溶血、嚴(yán)重混濁或被細(xì)菌污染等都可能產(chǎn)生非特異性顯色,影響檢測(cè)結(jié)果[3]。從外觀上看,此次抽檢的羊血清樣品無(wú)溶血,質(zhì)量好,兩種檢測(cè)方法得到的結(jié)果完全一致;而豬、牛有部分血清樣品溶血嚴(yán)重、質(zhì)量差,可能導(dǎo)致兩種方法得到的結(jié)果有所出入,符合率相對(duì)低一點(diǎn)。
應(yīng)用SPC-ELISA 定性檢測(cè)和LPB-ELISA 定量檢測(cè)FMDV 抗體,符合率高,結(jié)果高度一致。在實(shí)際工作中,可以根據(jù)具體需要,任意選擇其中一種合適的方法進(jìn)行檢測(cè),但均需保證樣品質(zhì)量。