非洲豬瘟病毒拮抗宿主抗病毒免疫分子機(jī)制研究進(jìn)展

時(shí)夢晗，胡永新，張友明，吳曉東，曹晶晶

（1.山東大學(xué)微生物技術(shù)研究院，微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266237；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種高度接觸性傳染病，急性ASF 致死率可高達(dá)100%。1921 年ASF 首次被發(fā)現(xiàn)于肯尼亞，到目前為止，已有68 個(gè)國家發(fā)生該病[1]。其中，我國作為世界上最大的豬肉生產(chǎn)國和消費(fèi)國受其影響尤為嚴(yán)重[2]。充分了解ASFV 的致病機(jī)制有助于設(shè)計(jì)有效的疫苗進(jìn)行疾病防控[3]。

ASFV 是一種核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA 病毒，也是目前唯一的蟲媒DNA 病毒[4]，其宿主包括家豬、野豬和軟蜱[5]。ASFV 顆粒是一個(gè)多層的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑為260～300 nm，病毒基因組為雙股線狀DNA，其中央保守區(qū)長約125 kb，兩端為可變區(qū)[6]。ASFV 基因組編碼的蛋白復(fù)雜多樣，目前已知的有150 多種編碼蛋白且部分蛋白的功能已被鑒定，這些蛋白參與病毒粒子結(jié)構(gòu)組成、基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制和翻譯、病毒入侵和細(xì)胞免疫功能調(diào)控等[7]。由此可見ASFV 基因組十分龐大且編碼蛋白復(fù)雜多樣。ASFV 主要感染單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或巨胞飲作用完成入侵過程[8]，進(jìn)一步完成復(fù)制、組裝和子代病毒顆粒的釋放。

在感染過程中，為抵御病毒攻擊，細(xì)胞的免疫系統(tǒng)被激活，同時(shí)，為促進(jìn)自身的存活和復(fù)制，病毒進(jìn)化出逃避或抑制宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制[9]。ASFV 編碼多種免疫逃逸蛋白以拮抗宿主免疫反應(yīng)，按參與的細(xì)胞反應(yīng)事件可分為4 類，包括調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的蛋白（pA238L）、抑制I 型干擾素（IFN-I）信號(hào)通路的蛋白（pMGF360，pMGF505，pI329L）、調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的蛋白（p54、pA179L、pA224L和pEP153R）以及其他免疫抑制蛋白（CD2v、pL83L）[4]，以上蛋白拮抗宿主抗病毒免疫反應(yīng)事件既相互獨(dú)立又協(xié)同合作，共同構(gòu)建拮抗宿主免疫反應(yīng)的分子網(wǎng)絡(luò)。本文對ASFV 的結(jié)構(gòu)和生命周期進(jìn)行簡要介紹，并對病毒編碼蛋白逃避宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)歸納，為未來ASFV致病機(jī)制研究和疫苗研發(fā)提供參考。

1 ASFV 基因組和粒子結(jié)構(gòu)

ASFV 粒子呈二十面體，基因組長為170～190 kb，包含150～167 個(gè)緊密排列的開放閱讀框，基因組包括中央保守區(qū)域和兩側(cè)的5 個(gè)多基因家族（multigene families，MGF），多基因家族的缺失或重復(fù)則導(dǎo)致了不同分離株基因組長度不同[10]。ASFV 呈多層結(jié)構(gòu)，從外到內(nèi)依次是外包膜、衣殼、內(nèi)膜、核殼和類核[4，11]。

病毒粒子的最外層為外包膜，是病毒出芽時(shí)從宿主細(xì)胞膜上獲得的結(jié)構(gòu)[12]。在病毒外包膜上能檢測到pEP402R（CD2v）蛋白存在。病毒外包膜的存在一方面能保護(hù)病毒粒子，另一方面使病毒入侵細(xì)胞和出芽過程復(fù)雜化，但外包膜的存在并不影響病毒的感染性[10]。

病毒衣殼的功能主要是保護(hù)病毒核酸并參與病毒感染過程。ASFV 衣殼最大直徑為250 nm，呈一個(gè)六邊形的對稱立體結(jié)構(gòu)[13]。P72 是主要的病毒衣殼蛋白。有研究[10]表明，病毒二十面體衣殼主要由8 280 拷貝的p72 蛋白和其余少量衣殼蛋白（如pE120R 和pB438L 蛋白）組成，其中p72 約占病毒顆?？傊亓康?2%。

內(nèi)膜是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離出來的厚約70? 的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)[14]。在ASFV 內(nèi)膜上存在p17、pE183L、p12、pE248R、pH108R 和pE199L 蛋白，其中p17 和pE183L 主要作用是幫助組裝病毒衣殼，p12、pE248R 和pE199L 則參與病毒入侵宿主細(xì)胞[4]。

核殼是病毒的一個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，直徑為180 nm，主要由多聚蛋白前體pp220 和pp62組成[15]。pp220和pp62均含有多個(gè)蛋白酶水解位點(diǎn)，其中，Gly-Gly-Xaa 位點(diǎn)可以被特異性的SUMO-1半胱氨酸蛋白酶pS273R 識(shí)別并切割，pp220 被水解成p5、p14、p34、p37 和p150，pp62 則被水解成p8、p15 和p35，水解后的蛋白為成熟蛋白，這一過程對于ASFV 粒子成熟和感染性具有重要意義[10]。pp220 與pp62 之間存在密切的交互應(yīng)答作用，pp62 的加工依賴于pp220 的表達(dá)，而pp62 對pp220 的亞細(xì)胞定位有重要影響，pp62 和pp220缺失會(huì)影響病毒粒子類核發(fā)育狀態(tài)，產(chǎn)生空核粒子[15-16]。

ASFV 粒子核心部位是核殼包裹著的類核，其包含ASFV 基因組，編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白和與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和免疫抑制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。pA104R是存在于類核處的一種重要DNA 結(jié)合蛋白，對ASFV 基因的包裝和復(fù)制至關(guān)重要。pA104R 以14～16 nt/bp 的速率與單鏈DNA（ssDNA）和雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合，與ASFV 拓?fù)洚悩?gòu)酶II pP1192R 共存時(shí)顯現(xiàn)出DNA 超卷曲活性。由于pA104R 在ASFV 復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此它是目前對抗ASFV 感染的一個(gè)重要靶點(diǎn)[10]。

2 ASFV 的生命周期

2.1 吸附和入侵

內(nèi)吞作用是許多病毒用來通過細(xì)胞膜物理屏障進(jìn)入細(xì)胞的一種方式。病毒內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞依賴于特定的細(xì)胞信號(hào)通路激活，并由病毒和細(xì)胞相互作用所驅(qū)動(dòng)[17]。早期研究表明，ASFV 入侵宿主細(xì)胞依賴于低pH、溫度、能量和膽固醇[18]，并且由于ASFV 對細(xì)胞具有趨向性，因此認(rèn)為巨噬細(xì)胞的某些受體（CD163、CD45、MHC-II 等）可能介導(dǎo)了病毒入侵這一過程。然而，基因敲除豬的感染試驗(yàn)結(jié)果[19]表明，CD163 對于ASFV 感染并非是必需的，還有其他未明確的特異性受體蛋白參與這一過程。

近些年的研究[20]主要認(rèn)為，ASFV 通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（clathrin-dependent endocytosis，CME）和巨胞飲作用進(jìn)行內(nèi)化。在CME 過程中，病毒顆粒首先與細(xì)胞膜表面的特定受體結(jié)合，受體接受信號(hào)后，膜上相應(yīng)部位會(huì)形成網(wǎng)格蛋白包被小窩，隨后形成直徑85～120 nm 的包被囊泡，而病毒粒子就被包裹在包被囊泡中[17]。囊泡形成后，會(huì)在GTPase 動(dòng)力驅(qū)動(dòng)下從細(xì)胞膜脫落并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)囊泡失去網(wǎng)格蛋白，形成早期內(nèi)體并進(jìn)一步成熟[21]。而在巨胞飲過程中，無需受體介導(dǎo)，主要由多種激酶，如RTK、PI3K1、PAK1 等和Rho GTPases 激活而在質(zhì)膜上產(chǎn)生褶皺或泡狀結(jié)構(gòu)來完成。通過巨胞飲作用入侵細(xì)胞的病毒粒子被包裹在0.5～10 mm 的無包被的囊泡中，形成巨胞飲體[22]。在形成早期內(nèi)體或巨胞飲體后，ASFV 粒子會(huì)被進(jìn)一步運(yùn)輸?shù)酵砥诤藘?nèi)體，進(jìn)行病毒脫殼。隨后ASFV 內(nèi)膜與晚期內(nèi)體膜之間發(fā)生融合，將病毒類核釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞質(zhì)中形成病毒工廠（virus factory，VF）進(jìn)行復(fù)制[2]。

2.2 基因表達(dá)和復(fù)制

ASFV 基因表達(dá)有嚴(yán)格時(shí)間調(diào)控，可以分為早期、中期和晚期3 個(gè)階段，其中早期基因表達(dá)先于ASFV DNA 的復(fù)制[23]。早期基因表達(dá)發(fā)生在感染后4～6 h，ASFV 的RNA 聚合酶啟動(dòng)早期基因表達(dá)，產(chǎn)生病毒復(fù)制所需的蛋白質(zhì)。ASFV 基因組的復(fù)制也分為兩個(gè)階段，最初發(fā)生在細(xì)胞核中，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)VF 中進(jìn)行。感染后6～8 h，ASFV 通過G1211R基因編碼的自身DNA 聚合酶啟動(dòng)復(fù)制。在感染8～16 h 時(shí)，開啟中晚期基因表達(dá)，產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白，隨后被組裝成病毒粒子[2，4]。

2.3 組裝和出芽

VF 定位于靠近細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)中，它既是ASFV 基因組復(fù)制的主要區(qū)域，也是子代病毒組裝的場所[4]。ASFV 內(nèi)膜前體的形成啟動(dòng)了子代病毒組裝過程，跨膜結(jié)構(gòu)蛋白p54 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上負(fù)責(zé)膜的募集和轉(zhuǎn)化。內(nèi)膜前體形成后，沉積在膜組裝中間體上的衣殼蛋白（p72 和其伴侶蛋白pB602L等）會(huì)逐個(gè)拼裝在一起，使膜前體逐漸形成二十面體結(jié)構(gòu)[24]。伴隨著衣殼形成，核殼在病毒內(nèi)膜下進(jìn)行組裝，多蛋白加工酶pS273R 在這一過程中發(fā)揮重要作用，pB602L 和p17 也通過影響pp220 和pp62 的水解來影響核殼到內(nèi)膜的組裝[25]。最后進(jìn)行基因組和相關(guān)類核蛋白包裝，主要由位于核殼的pA104R 發(fā)揮作用[26]。病毒組裝完成后，在微管和驅(qū)動(dòng)蛋白的共同作用下從被感染細(xì)胞中出芽，病毒衣殼蛋白pE120R 促進(jìn)成熟病毒顆粒從組裝位點(diǎn)運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，在質(zhì)膜中病毒獲得外包膜?？傮w來說，一個(gè)完整的ASFV 感染周期，從附著細(xì)胞到出芽在24 h 內(nèi)完成[2]。

3 ASFV 對先天性免疫反應(yīng)的逃逸

病毒入侵機(jī)體后，先天性免疫反應(yīng)是抵御病毒的第一道防線，由上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生干擾素（interferon，IFN）及其他細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞激發(fā)出顯著的主要的先天性免疫反應(yīng)，并刺激啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)，包括B 細(xì)胞發(fā)揮的特異性體液免疫反應(yīng)和T細(xì)胞發(fā)揮的適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而對病毒進(jìn)行徹底清除并建立免疫記憶[4，27]。

在先天性免疫反應(yīng)中，IFN 是重要組成部分，其可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白的表達(dá)從而干擾病毒生命周期，并抑制病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散[28]。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，各種模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），識(shí)別病原體相關(guān)分子模式從而激活先天性免疫信號(hào)通路，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和IFN-Ⅰ[29]。為保證自身的生存和復(fù)制，ASFV 進(jìn)化出多種對抗宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的策略，其中包括抑制感染細(xì)胞中IFN 和IFN 刺激基因（IFN-stimulated genes，ISG）表達(dá)，以及抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin 包括IL1-β、IL-6、IL-8）等炎癥因子釋放[9]。本文將從IFN 反應(yīng)和炎癥反應(yīng)兩個(gè)方面來闡述ASFV 對先天性免疫反應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控，其分子作用網(wǎng)絡(luò)如圖1 所示。

圖1 ASFV 拮抗宿主IFN 反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的作用網(wǎng)絡(luò)

3.1 ASFV 對IFN 反應(yīng)的調(diào)節(jié)

ASFV 基因組為DNA，因此細(xì)胞質(zhì)DNA 傳感器在病毒識(shí)別和IFN 激活中發(fā)揮重要作用。具體而言，環(huán)二核苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）可識(shí)別病毒DNA，發(fā)生去谷氨?；皖惙核氐鞍仔揎椷M(jìn)而活化，活化的cGAS會(huì)催化第二信使分子環(huán)二核苷酸（cyclic GMPAMP，cGAMP）合成，進(jìn)而cGAMP與干擾素刺激因子編碼蛋白（stimulator of interferon，STING）結(jié)合。cGAMP 與STING 的相互作用誘導(dǎo)STING 形成二聚體，進(jìn)而與iRhom2 蛋白結(jié)合并易位至ER-golgi 中間區(qū)室（ERGIC），與TANK 結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）結(jié)合，TBK1 對干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factors 3，IRF3）進(jìn)行磷酸化，磷酸化的IRF3 入核并介導(dǎo)IFN-Ⅰ表達(dá)[8，30]，此外，STING 與TBK1的激活還會(huì)激活I(lǐng)KK 復(fù)合體（inhibitor of NF-κB，IκB，包含IKKβ、IKKα 和NEMO）從而將NF-κB的抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）磷酸化以及蛋白泛素化和降解，釋放轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 入核并介導(dǎo)IFN-Ⅰ和前炎性因子表達(dá)[31-33]。除了cGASSTING 信號(hào)軸以外，在III 型RNA 聚合酶（RNA polymerase III，RNA PolyIII）作用下，兩種PRRs包 括Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）和RIG-I 樣受體（RIG-I-like receptors，RLRs）也發(fā)揮了病原體識(shí)別和IFN 激活功能[34]。細(xì)胞分泌的IFN 可被IFN 受體復(fù)合物IFNAR1/ IFNAR2 二聚體識(shí)別，并招募胞內(nèi)的酪氨酸激酶TYK2 和JAK1 到細(xì)胞膜并進(jìn)行相互磷酸化，進(jìn)而STAT1 和STAT2被分別招募和磷酸化，并與IRF9 形成三元復(fù)合物IFN 刺激基因因子3（ISGF3），ISGF3 入核與IFN 刺激反應(yīng)元件（ISREs）結(jié)合，啟動(dòng)ISGs 轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的ISGs 可直接阻遏病毒復(fù)制和擴(kuò)散，清除病毒[9，35]。

ASFV 編碼多種蛋白質(zhì)來抑制IFN-Ⅰ的生成，主要分為兩大類：一類是多基因家族蛋白（MGF360、MGF505），另一類是其他蛋白（pI329L、pDP96R、pE120R、pI215L、pF334L、pI267L）。ASFV 編碼蛋白對IFN 產(chǎn)生的分子調(diào)控機(jī)制研究總結(jié)如表1 所示。

表1 ASFV 編碼的干擾素抑制相關(guān)蛋白及具體作用機(jī)制

在ASFV 的多基因家族中，含有11～15 個(gè)成員的MGF360 和含有9～10 個(gè)成員的MGF505 被證明可以抑制IFN-I 反應(yīng)[36-37]。研究表明，在MGF360家族中，pMGF360-12L 以核定位信號(hào)依賴的方式與KPNA2、KPNA3 和KPNA4 競爭結(jié)合NF-κB，從而阻斷NF-κB 的核易位，抑制IFN-β 表達(dá)[38]，還能通過降低IRF9 總蛋白水平抑制IFN-β 介導(dǎo)的免疫效應(yīng)[39]；pMGF360-15R 能夠以NF-κB 非依賴性的方式靶向IRF3，調(diào)節(jié)IFN-β 表達(dá)，但不影響I 型或II 型IFN 對Janus 激酶信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因 子（Janus-activated kinase Singal transducers and activators of transcriprion，JAK-STAT）通路的激活[40]；pMGF360-13L 能抑制cGAS-STING 通路介導(dǎo)的IFN-β 活化，拮抗TBK1 和IRF3 向STING 募集，還能抑制TBK1 和IRF3 磷酸化，以及IRF3二聚化和入核，從而調(diào)控宿主的IFN 反應(yīng)[41]；pMGF360-9L 與STAT1 和STAT2 存在相互作用，并通過泛素-蛋白酶體對二者進(jìn)行降解，抑制IFN抗病毒效應(yīng)通路激活[42]。pMGF360-11L 能抑制cGAS、STING、TBK1、IKKε、IRF7 和IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β 和ISRE 啟動(dòng)子的激活，與TBK1 和IRF7 相互作用，通過半胱氨酸、泛素-蛋白酶體和自噬途徑降解TBK1 和IRF7，還能抑制TBK1和IRF3 磷酸化，通過負(fù)向調(diào)控cGAS 信號(hào)通路參與IFN-I 表達(dá)[43]；pMGF360-14L，可能通過競爭結(jié)合MAVS，抑制TRIM21 對MAVS 的泛素化，抑制IFN-I 產(chǎn)生[44]。而在MGF505 家族中，有研究表明MGF505-3R 與cGAS/TBK1/IRF3 相互作用，靶向TBK1 從而破壞了cGAS-STING 介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生信號(hào)通路[45]；pMGF505-7R 通過與STING 和自噬啟動(dòng)因子絲氨酸蘇氨酸激酶Unc-51 樣自噬激活激酶1（ULK1）相互作用，導(dǎo)致STING S366 被ULK1 磷酸化，并通過自噬途徑降解STING，從而抑制cGAS-STING 途徑介導(dǎo)的IFN-I 表達(dá)[8]；除了抑制IFN-I 之外，pMGF505-7R 還能抑制IFN-γ 介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄，并與JAK1 和JAK2 相互作用，破壞IFN-γ 信號(hào)通路[8，46]。

除了多基因家族以外，ASFV 還編碼一些其他蛋白質(zhì)來抑制IFN 反應(yīng)。pI329L 是TLR3 的同源物，通過靶向TLR3 通路中的TRIF，競爭性地結(jié)合到TLRs 的下游信號(hào)分子上，從而影響IFN 產(chǎn)生[47-48]；pDP96R 是ASFV 的一個(gè)毒力因子，通過cGAS-STING 信號(hào)通路負(fù)調(diào)控IFN-I 產(chǎn)生，并通過阻斷TBK1 和IKK-β 的激活影響NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)[49]；pD345L 對于cGAS-STING 誘導(dǎo)的IFN-β 和NF-κB 激活有抑制作用，與IKKα 以及IKKβ 互作，破壞激酶活性，抑制IκBα 磷酸化[50]。pE120R 是一種與病毒轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白，它與IRF3 羧基末端結(jié)構(gòu)域相互作用，干擾IRF3 向TBK1 募集，進(jìn)而抑制IRF3 的磷酸化，通過cGAS-STING 通路抑制IFN-β 生成[51]；pI215L 是病毒的一種E2 泛素結(jié)合酶，能抑制TBK1 K63 泛素化，從而抑制IFN-β 產(chǎn)生[52]。pF334L 通過與IRF9 相互作用，誘導(dǎo)IRF9通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解，阻礙ISGF3的部分入核，抑制ISGs 分子表達(dá)[53]。pI267L 通過與E3 泛素連接酶RIPLET 相互作用中斷其與RIG-I 的聯(lián)系，從而損害RIPLET 介導(dǎo)的泛素化和RIG-I 的激活，抑制IFN-β 生成[35]；pA528R 能與p65 蛋白相互作用，抑制TLR8-NF-κB 通路及其介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)[54]；pE248R 能招募ATG101 降解STING，通過負(fù)調(diào)控cGAS-STING 信號(hào)通路抑制IFN-I 產(chǎn)生[55]?？傊?，為逃避宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，ASFV 編碼多種蛋白質(zhì)以不同策略抑制IFN 產(chǎn)生，從而保證自身存活和復(fù)制，提高感染效率。

3.2 ASFV 對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)

炎癥反應(yīng)在ASFV 的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用。ASFV 感染豬后，會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）、CCL4、CXCL10 等，引起強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致受感染豬發(fā)生嚴(yán)重的炎癥病變甚至死亡[9]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，與高毒力ASFV 毒株相比，低毒力毒株能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的炎性細(xì)胞因子，說明炎癥反應(yīng)與ASFV 感染致病力密切相關(guān)。ASFV 編碼蛋白對炎性因子產(chǎn)生的分子調(diào)控機(jī)制研究總結(jié)如表2 所示。

表2 ASFV 編碼的抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白及功能

NF-κB 信號(hào)通路是機(jī)體通過炎癥反應(yīng)進(jìn)行抗病毒的重要途徑。細(xì)胞中的PRR 可識(shí)別病毒DNA或dsRNA 激活NF-κB通路，使NF-κB二聚體入核，在細(xì)胞核中積累并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[56]。炎癥反應(yīng)的發(fā)生，除了通過對NF-κB 通路的激活，還能通過激活NLRP3 炎癥小體途徑，促進(jìn)炎癥因子分泌[57]。

ASFV pA238L、pF317L、pL83L 和pMGF505-7R 蛋白參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)控。pA238L 蛋白對炎癥因子轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的調(diào)控有多種途徑：首先它是IκB的同源物，可以與NF-κB 結(jié)合抑制NF-κB 激活，從而抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；其次它能與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcium/calmodulin-regulated phosphatase calcinerurin，CaN）相互作用，影響其磷酸酶活性，抑制活化T 細(xì)胞核內(nèi)因子（nuclear factor of activated T cell cytoplasmic，NFAT）激 活，抑制IL-2、IL-4 等細(xì)胞因子產(chǎn)生；最后pA238L 能與細(xì)胞核中CBP/p300 相互作用，破壞p300 向轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的募集，阻止p300 磷酸化，進(jìn)而抑制TNF-α產(chǎn)生[9，58]。研究[59]發(fā)現(xiàn)，在ASFV 感染的細(xì)胞中，pF317L 與IKKβ 相互作用，抑制IKKβ 磷酸化，導(dǎo)致IκBα 磷酸化和泛素化降低，IκBα 表達(dá)上調(diào)，從而抑制NF-κB 激活，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

作為一種重要的促炎細(xì)胞因子，IL-1β 由單核-巨噬細(xì)胞分泌后可引起炎癥反應(yīng)并促進(jìn)B 細(xì)胞增殖分化[4]。然而研究[60]表明，ASFV pL83L 蛋白可特異性結(jié)合IL-1β，從而阻斷IL-1β 與受體結(jié)合，抑制IL-1β 引起的炎癥反應(yīng)。pMGF505-7R 是一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，與IKKα 相互作用，抑制IκBα磷酸化和NF-κB 核易位，從而抑制IL-1β 前體轉(zhuǎn)錄。另外，pMGF505-7R 還與NLRP3 相互作用，阻斷NLRP3 炎癥小體組裝，抑制成熟IL-1β 分泌[57，61]。除此之外，還有研究[62]發(fā)現(xiàn)pI226L、pA151R、pNP419、pQP383R 蛋白能抑制AIM2 炎癥小體組裝，從而抑制IL1-β 成熟和分泌。

4 ASFV 對適應(yīng)性免疫反應(yīng)的逃逸

近些年來，研究[9]表明，用ASFV 弱毒株感染豬可以產(chǎn)生保護(hù)性抗體，且弱毒株免疫血清能夠提高健康豬對同源毒株的抵抗力，說明宿主細(xì)胞的適應(yīng)性免疫在抵抗ASFV 感染中也發(fā)揮著重要作用。在抗原遞呈和T 細(xì)胞免疫反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞的MHC-I 類和MHC-II 類分子發(fā)揮關(guān)鍵作用。在ASFV 感染過程中，其編碼的pEP402R、pEP153R蛋白能通過不同的分子機(jī)制來逃避適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

pEP402R 蛋白也稱為CD2v 蛋白，是ASFV感染晚期編碼的一種蛋白質(zhì)，存在于ASFV 粒子外包膜上，其結(jié)構(gòu)和功能與T 淋巴細(xì)胞表面抗原CD2 相似，它能介導(dǎo)病毒與紅細(xì)胞粘附，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)傳播[63-64]。除此之外，CD2v 可以通過與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合，或者通過與細(xì)胞質(zhì)蛋白之間相互作用抑制淋巴細(xì)胞增殖，從而抑制適應(yīng)性免疫[48]。研究[63]表明，CD2v 缺失的BA71 減毒活疫苗對不同基因型毒株可產(chǎn)生一定保護(hù)效果。

pEP153R 蛋白則與一些細(xì)胞蛋白同源，如CD94、CD69、Ly94A 和CD44 等，因此pEP153R能與這些細(xì)胞蛋白競爭結(jié)合MHC 類分子，從而抑制T 細(xì)胞激活[65]；pEP153R 與MHC 類分子的結(jié)合也會(huì)抑制MHC-I 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞膜的運(yùn)輸，抑制NK 細(xì)胞激活，由此可見pEP153R 蛋白也在抑制適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

5 ASFV 對程序性細(xì)胞死亡進(jìn)行調(diào)節(jié)

病毒入侵時(shí)，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)應(yīng)激性細(xì)胞行為以控制病毒感染，例如細(xì)胞程序性死亡（細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬等），這是宿主抗病毒免疫應(yīng)答的重要部分。然而，ASFV 在感染過程中會(huì)通過病毒蛋白來調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生，達(dá)到逃避宿主免疫反應(yīng)并維持自身復(fù)制的目的。

細(xì)胞凋亡主要有3 種途徑，分別為外源性凋亡途徑（extrinsic apoptotic pathway，EAP）、內(nèi)源性凋亡途徑（intrinsic apoptotic pathway，IAP）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)途徑。EAP 由胞外的凋亡受體介導(dǎo)與相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域以及procaspase-8 形成誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合體，從而依次激活caspase 8 和caspase 3 進(jìn)行細(xì)胞凋亡。IAP又稱為線粒體/細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-c）介導(dǎo)的通路，在其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，細(xì)胞內(nèi)刺激因子與線粒體上的Bcl-2 家族成員相互作用，將Cyt-c 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，Cyt-c、APAF-1 和caspase 9 形成凋亡小體，激活caspases9/3/6/7，從而引起凋亡[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)途徑則能通過持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致caspase-12 活化，從而導(dǎo)致凋亡[66]。此外，細(xì)胞自噬也是細(xì)胞的一種防御保護(hù)措施[67]，病毒入侵宿主細(xì)胞后，會(huì)通過病毒蛋白誘導(dǎo)、病毒配體與受體互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3 種機(jī)制來誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬，將病毒顆粒運(yùn)送到溶酶體中進(jìn)行降解，并進(jìn)一步通過與PRRs 結(jié)合，誘導(dǎo)IFN 反應(yīng)[68-69]。宿主細(xì)胞通過凋亡或自噬，能夠使病毒暴露在免疫系統(tǒng)中，從而抑制病毒復(fù)制進(jìn)而將病毒清除。因此為確保感染早期細(xì)胞的存活狀態(tài)，產(chǎn)生足夠的子代病毒，病毒進(jìn)化出了延遲或者抑制細(xì)胞程序性死亡的策略，進(jìn)一步為確保感染晚期子代病毒的成功出芽，病毒還進(jìn)化出了促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡的策略[9]。

在ASFV 編碼蛋白中，pA224L、pA179L、EP153R 和pDP71L 發(fā)揮抑制凋亡功能，P54/pE199L 發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能。其中，pA179L 還參與細(xì)胞自噬調(diào)控。

pA224L 是在ASFV 感染晚期表達(dá)的一種保守蛋白質(zhì)，它是一種凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）同源蛋白，能夠與激活的caspase-3 相互作用并抑制其蛋白酶功能，從而抑制多種凋亡誘發(fā)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9，70]。另有研究表明，pA224L 可通過IKK 激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 從而抑制細(xì)胞凋亡[71]，然而，A224L 的缺失對ASFV 毒力以及感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡程度并無顯著影響[72]。

pA179L 定位于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是Bcl-2 家族的同源物，它含有BH1、BH2、BH3 和BH4 的保守結(jié)構(gòu)域，但缺乏相應(yīng)跨膜結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)果[9，73]顯示，pA179L 既能結(jié)合促凋亡蛋白Bid的活性截?cái)囿wp13 和p15 從而抑制其活性，也能結(jié)合其他促凋亡蛋白Bak 和Bax 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的抑制。最近研究[74]發(fā)現(xiàn)，pA179L 能夠發(fā)生異戊二烯化修飾，異戊二烯化通過指導(dǎo)pAl79L 蛋白的線粒體定位調(diào)控其抑制細(xì)胞凋亡活性。進(jìn)一步研究[75]表明，pAl79L 蛋白通過其BH3 同源結(jié)構(gòu)域與Beclin-1 在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用，在饑餓條件下抑制自噬體形成，這提示pAl79L 蛋白具有對程序性細(xì)胞死亡的多重調(diào)控功能，以保障病毒復(fù)制和子代病毒組裝。

EP153R 是C 型凝集素類似蛋白，參與病毒感染后的血細(xì)胞吸附過程，還能抑制caspase-3，除此之外它還能降低細(xì)胞蛋白p53 的反式激活活性，從而某些凋亡抑制分子的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)受到影響，抑制細(xì)胞凋亡[76]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑之一，而在ASFV 復(fù)制過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累過量的未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白，則會(huì)誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。而ASFV可選擇性活化ATF6 信號(hào)通路，激活caspase-12，誘導(dǎo)分子伴侶鈣聯(lián)蛋白和鈣網(wǎng)狀蛋白表達(dá)，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，抑制感染早期細(xì)胞凋亡活動(dòng)[77]。pDP71L 是ASFV 中高度保守的晚期蛋白，它是單純皰疹病毒ICP34.5 以及細(xì)胞蛋白GADD34 的類似物，均可與蛋白磷酸酶PP1 結(jié)合，并招募真核翻譯起始因子eIF2α 去磷酸化，阻斷ATF4 和下游促凋亡因子CHOP 生成，從而阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)軸eIF2α-ATF4-CHOP[78]，保障細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯功能以及病毒增殖。然而pDP71L缺失體病毒研究結(jié)果[79]顯示，該蛋白并不是調(diào)控eIF2α 的唯一因素。

除抑制細(xì)胞凋亡以外，ASFV 還可以通過相應(yīng)策略促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有利于病毒傳播，從而增加病毒從細(xì)胞中釋放的量，避免炎癥信號(hào)的誘導(dǎo)[9]。p54（E183L）位于成熟病毒粒子內(nèi)膜，是一種結(jié)構(gòu)蛋白，在感染早期參與吸附宿主細(xì)胞，并通過自身的SQT 基序（與BCL2 家族的促凋亡蛋白BH3-only BIM 同源）與微管動(dòng)力蛋白直接結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病毒內(nèi)化后向病毒復(fù)制工廠的轉(zhuǎn)運(yùn)。在病毒感染后期p54 高量表達(dá)，激活caspase-3 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化為子代病毒內(nèi)囊膜。研究[80]表明，SQT 基序內(nèi)結(jié)構(gòu)域的缺失可使P54 蛋白喪失與微管動(dòng)力蛋白結(jié)合的能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。pE199L 是在感染晚期表達(dá)的一種內(nèi)膜蛋白，能夠激活促凋亡因子Bak 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[81]。因此為提高感染率，ASFV 通過不同策略對宿主細(xì)胞的凋亡程序進(jìn)行調(diào)控。

6 總結(jié)與展望

自2018 年我國首次報(bào)告ASF 病例以來，ASF給我國乃至全世界都帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。ASFV在感染宿主細(xì)胞過程中，細(xì)胞會(huì)識(shí)別病毒刺激，引起IFN、炎癥、程序性細(xì)胞死亡和機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)，以形成系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)。同時(shí)，ASFV 進(jìn)化出一系列逃逸宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的策略，包括調(diào)節(jié)先天性免疫信號(hào)通路、抑制抗原呈遞、調(diào)控程序性細(xì)胞死亡等，從而躲避細(xì)胞的免疫攻擊，提高感染效率。以上復(fù)雜的免疫逃逸策略加大了有效疫苗設(shè)計(jì)的難度。

基于對ASFV 編碼蛋白的鑒定和功能研究，已證實(shí)p72、p30、p54 和CD2v 等蛋白是ASFV 的重要免疫原，可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生中和抗體，然而免疫保護(hù)效果一般[82]。在缺失體病毒構(gòu)建工作中發(fā)現(xiàn)，DP71L、DP96R、B119L 或DP148R 的缺失可減弱病毒毒力，有一定保護(hù)性效果[83]。目前，國內(nèi)外對ASFV 疫苗的設(shè)計(jì)開發(fā)以重組亞單位疫苗和減毒活疫苗為主，以上免疫原和減毒策略的嘗試并未達(dá)到理想的免疫保護(hù)效果。有研究[84-85]表明，7 基因缺失的減毒活疫苗HLJ/1-7GD（MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R、MGF505-3R和CD2v缺失）有較好的臨床免疫保護(hù)效果，但該疫苗株的生物安全性還有待于進(jìn)行全面系統(tǒng)評(píng)估，因此進(jìn)一步對ASFV 編碼產(chǎn)物的鑒定及其功能進(jìn)行充分研究，可為重組減毒活疫苗的基因缺失策略提供更多缺失基因組合，有助于構(gòu)建具有良好免疫原性和強(qiáng)保護(hù)效果的疫苗株[86]。此外，通過分子流行病學(xué)對ASFV 基因組進(jìn)化的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，有2 株豬場分離毒株發(fā)生了缺失并導(dǎo)致病毒毒力減弱，可能導(dǎo)致豬群的慢性或無癥狀感染，鑒定結(jié)果表明缺失基因?yàn)閜EP402R和pEP153R[87]，回顧二者編碼蛋白的功能研究，可發(fā)現(xiàn)它們參與宿主適應(yīng)性免疫反應(yīng)的逃避或調(diào)控細(xì)胞程序性死亡。因此，在未來科學(xué)防治和新疫苗開發(fā)中可考慮當(dāng)前ASFV 的適應(yīng)和進(jìn)化。

已有研究[88-89]借助于生物信息學(xué)研究手段挖掘ASFV 免疫逃逸相關(guān)蛋白或基于T 細(xì)胞表位全景掃描技術(shù)開發(fā)ASFV 細(xì)胞免疫疫苗，這些工作為ASFV 疫苗研發(fā)工作帶來了新突破口。未來，除了對IFN 生成和炎癥反應(yīng)調(diào)控的分子機(jī)制鑒定外，還應(yīng)結(jié)合適應(yīng)性免疫中免疫細(xì)胞亞群偏移和病理性炎性反應(yīng)發(fā)生的機(jī)理研究，為新型疫苗設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)，加強(qiáng)免疫保護(hù)效果。