常見肉類成分熒光PCR 檢測(cè)試劑盒的比較

史喜菊，杜思樂，蒲靜，張偉，任彤，徐立偉，鄧叢良，趙相鵬，高志強(qiáng)，汪琳，張佳瑋，白子龍，張小寒，賴平安，宋悅謙

（中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

動(dòng)物源性食品是人類飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，而動(dòng)物源性食品中肉類又居于首位，是人類動(dòng)物蛋白的主要來源。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2015年之前我國(guó)肉類總產(chǎn)量呈逐年上升趨勢(shì)，2016—2018 年基本持平，2019 年開始出現(xiàn)下降，這種下降主要是由于原來占肉類總量60%以上的豬肉產(chǎn)量降低了21.3%，相反，牛肉和羊肉產(chǎn)量卻分別增加了3.6%和2.7%。不同種屬來源的肉，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味以及消費(fèi)者宗教習(xí)俗等原因，價(jià)格差異很大，所以市場(chǎng)上肉類摻假現(xiàn)象層出不窮。肉制品摻假是全球性問題。國(guó)外對(duì)近千種肉制品的檢測(cè)結(jié)果表明，有近20%的產(chǎn)品存在標(biāo)識(shí)與品種不完全相符的現(xiàn)象，如2012 年沃爾瑪?shù)暮側(cè)狻?013年的歐洲馬肉等事件[1]。在國(guó)內(nèi)，有些不法肉食品企業(yè)使用相對(duì)廉價(jià)的豬肉、雞肉等肉類原料，通過各種深加工手段，冒充牛、羊肉制品進(jìn)行銷售以謀取不當(dāng)利益，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。

目前已知的肉及肉制品中肉類成分的鑒定方法眾多，其中基于DNA 的PCR 檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是精準(zhǔn)有效的檢測(cè)方法之一[2-5]，我國(guó)也相應(yīng)出臺(tái)了一系列檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR 法》[6]、《動(dòng)物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法》[7]、《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR 法》[8]等。隨著這些標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)，市場(chǎng)上銷售的各類肉源成分熒光PCR 檢測(cè)試劑盒也層出不窮。本研究特選取了市場(chǎng)上常見的4 個(gè)品牌的5 種肉及肉制品（牛、羊、豬、雞、鴨）熒光PCR 檢測(cè)試劑盒，并對(duì)其特異性、靈敏性、成本效益等方面進(jìn)行了比較，旨在為選擇更合適的肉類成分檢測(cè)試劑盒提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)上購(gòu)買牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉各20 份。

1.1.2 主要試劑 動(dòng)物組織DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；5 種肉類成分熒光PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自4 家生物公司，分別用A、B、C 和D 代表。

1.1.3 主要儀器 核酸提取儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、均質(zhì)儀、研缽和研磨棒、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 單一樣品 去除樣品中明顯的脂肪組織并用滅菌水清洗干凈；取100～200 mg 樣品用手術(shù)剪剪碎，并用研磨棒充分研磨；取50 mg 研磨樣品置于1.5 mL 無菌離心管中，加入200 μL 滅菌PBS（pH 7.2）用于核酸提取。每份樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.1.2 混合樣品 稱取5 種肉類樣品各100 mg，置于研缽中，用研磨棒充分研磨混勻；取50 mg 研磨樣品置于1.5 mL 無菌離心管中，加入200 μL 滅菌PBS（pH 7.2）用于核酸提取。每份樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 核酸提取 按照動(dòng)物組織DNA 提取試劑盒說明書，分別從上述樣品中提取DNA，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 核酸濃度測(cè)定 用NanoDrop 微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定各樣品核酸濃度，用于靈敏性試驗(yàn)。

1.2.4 肉類種屬成分熒光PCR 檢測(cè) 參加比對(duì)的4 種品牌肉類成分檢測(cè)試劑盒均為熒光PCR 方法。按照各試劑盒說明書要求配制反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行結(jié)果判定。具體見表1。

表1 4 種品牌肉類成分熒光PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)條件

1.2.5 特異性比較試驗(yàn)

1.2.5.1 單一樣品 以單一樣品提取的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測(cè)單一樣品的特異性。

1.2.5.2 混合樣品 以混合樣品提取的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測(cè)混合樣品的特異性。

1.2.6 靈敏性比較試驗(yàn)

1.2.6.1 單一樣品 分別提取5種肉類樣品核酸，測(cè)定濃度后進(jìn)行10 倍倍比稀釋；以倍比稀釋的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測(cè)單一樣品的靈敏性。每種試劑盒檢測(cè)出的最低核酸濃度即為該類源性成分的最低檢測(cè)限。

1.2.6.2 混合樣品 提取5種混合肉類樣品核酸，測(cè)定濃度后進(jìn)行10 倍倍比稀釋；以倍比稀釋的核酸為模板，分別用4 種品牌試劑盒進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，試驗(yàn)檢測(cè)混合樣品的靈敏性。每種試劑盒檢測(cè)出的最低核酸濃度即為該類源性成分的最低檢測(cè)限。

1.2.7 成本與效率比較 計(jì)算4 種品牌試劑盒的反應(yīng)時(shí)間及試劑耗材成本，比較成本與效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸濃度

測(cè)定的單一樣品和混合樣品的核酸純度和濃度見表2。

表2 核酸原始純度及濃度

2.2 特異性比較試驗(yàn)

2.2.1 單一樣品 結(jié)果（表3）顯示：每種試劑盒均只能從單一樣品中檢出特異性擴(kuò)增，而對(duì)其他肉類模板擴(kuò)增均為陰性。說明各試劑盒的特異性均較好，不同肉類之間不存在交叉反應(yīng)。

表3 各試劑盒檢測(cè)單一樣品特異性結(jié)果

2.2.2 混合樣品 結(jié)果（表4）顯示：每種試劑盒均只能從混合模板中檢出特異的肉品種類，而對(duì)其他4 種肉類的擴(kuò)增均為陰性。說明各試劑盒的特異性均較好，混合模板也未對(duì)特異性產(chǎn)生干擾。

表4 各試劑盒檢測(cè)混合樣品特異性結(jié)果

2.3 靈敏性比較試驗(yàn)

2.3.1 單一樣品 不同試劑盒檢測(cè)單一樣品的最低檢測(cè)限存在差異（表5）：對(duì)于牛源性成分檢測(cè)試劑盒，D 品牌的最低檢測(cè)限為1.03 fg/μL，A 品牌為103 fg/μL，B 和C 品牌為10.3 pg/μL；對(duì)于羊源性成分檢測(cè)試劑盒，B 和C 品牌的最低檢測(cè)限為9.56 fg/μL，D 品牌為95.6 fg/μL，A 品牌為956 fg/μL；對(duì)于豬源性成分檢測(cè)試劑盒，B 和C品牌的最低檢測(cè)限為9.85 fg/μL，A 和D 品牌為98.5 fg/μL；對(duì)于雞源性成分檢測(cè)試劑盒，C 和D 品牌的最低檢測(cè)限為11.08 fg/μL，A 和B 品牌為110.8 fg/μL；對(duì)于鴨源性成分檢測(cè)試劑盒，D品牌的最低檢測(cè)限為10.21 fg/μL，其他3 家均為102.1 fg/uL。

表5 各試劑盒檢測(cè)單一樣品最低檢測(cè)限

2.3.2 混合樣品 不同試劑盒檢測(cè)混合樣品的最低檢測(cè)限存在差異（表6）：A 品牌的5 種肉類成分檢測(cè)試劑盒比較一致，最低檢測(cè)限均為1.10 pg/μL，不同成分的試劑盒之間無差異；B 品牌的羊源和雞源成分檢測(cè)試劑盒最低檢測(cè)限為1.10 pg/μL，其他3 種成分檢測(cè)試劑盒的最低檢測(cè)限為110.2 fg/μL，不同成分的試劑盒檢測(cè)限相差10 倍；C 品牌的牛源和羊源成分檢測(cè)試劑盒的核酸檢測(cè)限為11.0 pg/μL，其他3 種成分檢測(cè)試劑盒的核酸檢測(cè)限約為110.2 fg/μL，不同成分的試劑盒檢測(cè)限相差100 倍；D 品牌的5 種肉類成分檢測(cè)試劑盒比較一致，最低檢測(cè)限為110.2 fg/μL，不同成分的試劑盒之間無差異。

表6 各試劑盒檢測(cè)混合樣品最低檢測(cè)限

2.4 成本和效率比較

分別計(jì)算4 種品牌試劑盒的反應(yīng)時(shí)間及試劑耗材成本發(fā)現(xiàn)，不同品牌試劑盒的熒光PCR 檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)成本存在差異（表7）：A 品牌試劑盒耗時(shí)最短，全程僅需52.5 min，總成本價(jià)66 元/份，價(jià)格適中；B 和C 品牌耗時(shí)均需80 min 以上，總成本價(jià)分別為62 和66 元，處于中間水平；D 品牌試劑盒耗時(shí)65.0 min，但是成本偏高，單份84 元。

表7 4 種品牌試劑盒效率和成本比較

3 討論

隨著人們對(duì)生活品質(zhì)的要求逐步提高，消費(fèi)者越來越關(guān)注食用肉制品的質(zhì)量問題，但市場(chǎng)上肉類摻假的現(xiàn)象屢見不鮮，引起了消費(fèi)者及監(jiān)管部門的廣泛關(guān)注[1]。目前，已有顯微鏡法、PCR 法、熒光PCR 法、蛋白質(zhì)譜及光譜學(xué)等多種肉類成分檢測(cè)方法，其中熒光PCR 檢測(cè)方法由于其靈敏、特異和快速等優(yōu)點(diǎn)，已成為肉類成分檢測(cè)領(lǐng)域的黃金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用于肉類源性成分鑒別[3-4、9-11]。

本次研究分別從特異性、靈敏性、效率成本等方面，對(duì)市場(chǎng)上4 個(gè)品牌的5 種肉類成分熒光PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了比較。經(jīng)過試驗(yàn)，4 種品牌試劑盒特異性均較好，不同肉類之間沒有交叉反應(yīng)，與相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的描述一致[6-8]；而靈敏性則有較大區(qū)別，檢測(cè)同一種肉類的不同品牌試劑盒靈敏性及同一品牌檢測(cè)不同肉類的試劑盒靈敏性均存在差異，靈敏度高的可以達(dá)到fg 級(jí)別，差的只能到pg 級(jí)別，與王金斌等[9]、馬炳存等[10]研究結(jié)果一致。分析原因，可能是由試劑盒的固有性能特征引起的，不同品牌的檢測(cè)試劑追求的使用目的不同，有的追求高特異性，有的追求高靈敏性，這也是造成試劑盒間存在差異的根本原因。另外，不同品牌的試劑盒檢測(cè)時(shí)間和成本也有差異，耗時(shí)短的試劑盒由于循環(huán)次數(shù)少，可能會(huì)存在弱陽(yáng)性檢出率低的情況，價(jià)格偏高的試劑盒通常靈敏度也要高一些，使用者可以根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮皖A(yù)算選擇恰當(dāng)?shù)脑噭┖小?/p>