等溫擴增技術(shù)概述及其在動物病原檢測中的應用

禹蘭平，王楷宬，潘俊慧，張富友，楊文靜，周凱鈺太，崔成都，孫福亮，王素春

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.延邊大學，吉林延吉 133000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

隨著全球家畜養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，動物疫病問題也越來越復雜，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大影響，對人類健康與公共衛(wèi)生造成潛在威脅。對病原的及時檢測，有助于及時控制動物疫病并減少損失。病原分離與鑒定是診斷動物疫病的金標準，但其耗時耗力，對實驗人員和實驗環(huán)境需求較高，還存在一定的生物安全風險[1]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是目前應用最廣泛的病原檢測技術(shù)。該技術(shù)可對病原核酸進行定性分析，而且特異性好、靈敏度高、準確率高，但須依賴精密的核酸擴增儀以實現(xiàn)不同溫度的熱循環(huán)擴增，多適用于實驗室檢測。20 世紀以來，等溫擴增技術(shù)作為一種創(chuàng)新性病原核酸檢測技術(shù)，得到逐步發(fā)展完善。此類技術(shù)可在一個恒定的溫度下完成擴增反應，具有靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡單、耗時短等優(yōu)點，可在野外環(huán)境下通過便攜快速檢測設備，用于動物疫病現(xiàn)場初篩。該技術(shù)與PCR 技術(shù)相結(jié)合，可為動物疫病的發(fā)現(xiàn)和處置爭取時間，對動物疫病防控具有重要意義。本文從技術(shù)原理、優(yōu)缺點及在動物疫病檢測中的應用方面，對環(huán)介導等溫擴增技術(shù)、重組酶等溫擴增技術(shù)、依賴核酸序列的擴增技術(shù)、交叉引物等溫擴增技術(shù)、賴解旋酶擴增技術(shù)等當前常見的幾種恒溫擴增技術(shù)進行分析總結(jié)，以期為動物疫病檢測方法建立和防控策略制定提供參考。

1 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

1.1 技術(shù)原理

2000 年，Notomi 等[2]研發(fā)了環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），使用4～6 條引物通過BstDNA 聚合酶的鏈置換活性，對模板進行特定擴增。該方法有3 個反應階段：第一，起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。外引物和內(nèi)引物擴增出起始模板并限制擴增范圍，同時為內(nèi)引物提供擴增用模板。第二，啞鈴狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。內(nèi)引物擴增的DNA 片段包含5'端DNA 的反向互補序列，而反向互補序列可以相互形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；另一條內(nèi)引物與互補序列退火雜交，經(jīng)過鏈置換并合成后在擴增的DNA 片段另一端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這樣擴增后的片段擁有2 個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。第三，以上一階段產(chǎn)生的啞鈴狀結(jié)構(gòu)DNA 片段為模板進行循環(huán)擴增，最終生成重復并反向的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA 片段混合產(chǎn)物。

常用的LAMP 擴增產(chǎn)物檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光、試紙條技術(shù)以及添加染料指示劑等。此外，LAMP 反應過程中，從脫氧核糖核酸三磷酸中析出的焦磷酸離子可與反應液中的鎂離子反應而生成不溶于水的焦磷酸鎂白色沉淀物，基于此設計了焦磷酸鎂白色沉淀觀察法、濁度檢測法、金屬離子指示法等檢測方法。

1.2 優(yōu)缺點和臨床應用

LAMP 擴增技術(shù)簡單高效，擴增反應和產(chǎn)物檢測可一步完成，不依賴特殊設備，是目前發(fā)展較為成熟的等溫擴增技術(shù)，在禽、羊、豬等動物的病原檢測中都有應用（表1）。與傳統(tǒng)的PCR 擴增反應相比，LAMP 技術(shù)耗時更短，擴增時間大多數(shù)在1 h 以內(nèi)，靈敏度更高。但該方法對引物的設計要求較為復雜，需要的引物數(shù)量多，研發(fā)多重LAMP 檢測方法有很大困難。該方法擴增后的產(chǎn)物呈花椰菜樣結(jié)構(gòu)，不適用于克隆測序，僅適用于結(jié)果的陰陽性判定。此外，若對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，就無法避免開蓋檢測問題，從而會產(chǎn)生氣溶膠污染和結(jié)果假陽性問題，但結(jié)合實時熒光和染料指示劑能做到擴增反應結(jié)束即出檢測結(jié)果，無需開蓋，從而可以有效避免氣溶膠污染問題，且操作簡單，是目前較為常用的兩種形式。例如，常攀峰等[3]建立的羊傳染性膿皰病毒LAMP檢測方法，通過在反應體系中添加染料指示劑，擴增反應結(jié)束時即可肉眼觀察結(jié)果，不需要對產(chǎn)物進行額外操作，簡化了操作流程，避免了氣溶膠污染，靈敏度也是普通PCR 的10 倍以上，可作為羊傳染性膿皰病毒的臨床檢測候選方式。有學者[4]建立了一些病原的RT-LAMP 檢測方法，與已有的熒光RT-PCR 方法比較，兩種檢測方法靈敏度一致，但LAMP 方法特異性更強，耗時更短，陽性檢出率更高，且對儀器依賴性低，更適用于病原的臨床快速篩查。

表1 LAMP 技術(shù)在動物病原檢測中的應用舉例

2 重組酶等溫擴增技術(shù)

2.1 技術(shù)原理

重組酶等溫擴增技術(shù)主要包括重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）和重組酶介導等溫擴增（recombinase aid amplification，RAA）[13-14]。

RPA 是Piepenburg 等[15]在2006 年建立的方法，其擴增原理是先利用T4 類噬菌體中的重組酶蛋白UvsX 與特異性引物結(jié)合，形成重組酶-引物復合體，再對雙鏈DNA 進行掃描和識別，識別到同源序列后，復合體插入雙鏈DNA 形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)；為了防止新鏈和之前的母鏈配對，單鏈結(jié)合蛋白（gp32）與置換出的單鏈DNA 結(jié)合，隨后ATP水解供能，使重組酶-引物復合體分解，在引物3'端與DNA 聚合酶結(jié)合并進行復制和延伸。RAA 擴增原理與RPA 相似，其創(chuàng)新點在于擴增反應中使用的重組酶來自細菌或真菌。這類酶來源更廣泛，對溫度的適應性更強，因而提高了反應穩(wěn)定性，降低了試劑成本。

重組酶等溫擴增技術(shù)的基礎(chǔ)擴增產(chǎn)物可以通過凝膠電泳法進行鑒定，也可以結(jié)合熒光探針或熒光染料，實現(xiàn)擴增反應和結(jié)果判定一步化。此外，該方法還可以結(jié)合膠體金試紙條技術(shù)，實現(xiàn)對病原核酸的快速檢測。

2.2 優(yōu)缺點和臨床應用

重組酶等溫擴增技術(shù)在我國一直擁有很大的研究熱度，研究人員已建立了禽、豬、牛等多種家畜的病原檢測方法（表2）。該技術(shù)在檢測過程中不受場地條件約束，5～30 min 即可完成擴增反應，反應溫度（37～42 ℃）與人體溫接近，甚至可以夾在腋下或握在手中進行反應。該方法操作簡單，靈敏度高，且與LAMP 相比，擴增時間更短，反應溫度更低，更容易實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。此外，RAA 方法將反應過程中用到的多種酶，按照需求量凍干在反應管中，這樣既方便運輸，又保證了酶的活性。

表2 重組酶等溫擴增技術(shù)在動物病原檢測上的應用舉例

重組酶等溫擴增技術(shù)一般用于實驗研究。該方法的擴增產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可能會出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，且容易出現(xiàn)氣溶膠污染，因此在檢測前需要對擴增產(chǎn)物進行反應阻斷和純化處理。將重組酶等溫擴增技術(shù)結(jié)合熒光探針法，可以實時顯示擴增結(jié)果，既提高了檢測靈敏度和特異性，又縮短了反應時間，是目前較為常用的方式。但是該方法對引物和探針有特定要求，引物長度一般為30～35 bp，探針長度一般為46～53 個堿基，在探針設計時需要找出適合標記熒光信號、淬滅基團和四氫呋喃分子位點，設計要求較復雜，目前還沒有專門設計這類探針的軟件，只能依靠技術(shù)人員進行人工操作。

3 依賴核酸序列的擴增技術(shù)

3.1 技術(shù)原理

依賴核酸序列的擴增技術(shù)（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）由Compton[24]在1991 年建立，是一種在42 ℃條件下，由1 對特異性引物介導，在禽源成髓細胞瘤逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7 RNA 多聚酶的共同作用下完成的連續(xù)等溫擴增反應。該方法大致包括5 步：（1）引物Ⅰ與RNA 模板鏈3'端結(jié)合；（2）禽源成髓細胞瘤逆轉(zhuǎn)錄酶合成反義的DNA 鏈，形成DNA-RNA 雜交鏈；（3）核糖核酸酶H 降解雜交鏈中的RNA，留下DNA 鏈；（4）引物Ⅱ與DNA 的5'端結(jié)合；（5）噬菌體T7 RNA 多聚酶合成補償鏈，進入第一步，開始循環(huán)反應。

目前擴增產(chǎn)物的初步鑒定主要是在瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳后用染料染色，并在紫外燈下觀察片段長度或進行熒光檢測[25]。在《禽流感病毒NASBA 檢測方法》（GB/T l9440—2004）中，擴增后的產(chǎn)物用Nuclisens 閱讀器進行檢測，其原理是根據(jù)上游引物5'末端含有噬菌體T7 的依賴于DNA 的RNA 聚合酶起動因子序列，下游引物5'末端含有釕標電化學發(fā)光檢測探針互補序列，在擴增過程中既能產(chǎn)生互補RNA 序列的模板，又能特異性結(jié)合檢測步驟中的ECL 探針。此外，還可以使用與酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)合建立的寡核苷酸檢測[26]。

3.2 優(yōu)缺點和臨床應用

NASBA 技術(shù)擴增效率與RT-PCR 相當，保真度高，擴增產(chǎn)物不易污染實驗室環(huán)境和物品，能有效避免交叉污染導致的假陽性。該方法將反轉(zhuǎn)錄和擴增反應合并到一起，縮短了反應時間，適合擴增RNA；如果擴增DNA 模板，則需要在反應過程中添加變性步驟[27]。

在NASBA 技術(shù)的早期發(fā)展過程中，研究者建立了部分畜禽和水生動物病原檢測方法（表3）。我國2004 年發(fā)布了兩項應用該技術(shù)進行病原檢測的國家標準——《H5 亞型禽流感病毒NASBA 檢測方法》（GB/T 19439—20040）和《禽流感病毒NASBA 檢測方法》（GB/T l9440—2004），填補了禽流感病毒快速檢測標準的空白。然而該技術(shù)在反應過程中需要用到3 種酶，因而反應成本偏高。與LAMP 和重組酶等溫擴增技術(shù)相比，該方法耗時更長，并且反應過程中需要2 種溫度，配備2 種反應液，操作過程相對復雜。隨著技術(shù)缺點的逐漸凸顯，利用該技術(shù)進行的疫病檢測研究逐漸減少。

表3 NASBA 技術(shù)在動物病原檢測上的應用舉例

4 交叉引物等溫擴增技術(shù)

4.1 技術(shù)原理

交叉引物等溫擴增技術(shù)（crossing priming amplification，CPA）由杭州優(yōu)思達生物公司研發(fā)，是我國第一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴增技術(shù)[33]。該方法在63 ℃條件下，通過BstDNA 聚合酶、甜菜堿和交叉引物進行擴增，按照交叉引物數(shù)量的不同，可分為雙交叉引物擴增（2 條交叉引物、2 條剝離引物）和單交叉引物擴增（1 條交叉引物，2 條剝離引物和2 條普通引物）。雙交叉引物擴增是2 條交叉引物與模板互補結(jié)合并延伸后，由2 條剝離引物通過BstDNA 聚合酶剝離新合成的單鏈，被剝離的新單鏈成為模板并生成大量擴增產(chǎn)物。單交叉引物擴增是1 條交叉引物與模板結(jié)合并延伸形成雙鏈，隨后2 條剝離引物通過BstDNA 聚合酶剝離新合成的單鏈，2 條普通引物以被剝離的新單鏈為模板合成2 條長度不等的單鏈DNA，最后以這2 條單鏈DNA 為模板進行大量擴增。擴增產(chǎn)物通過膠體金試紙條技術(shù)可實現(xiàn)快速檢測，也可通過添加染料指示劑或瓊脂糖電泳進行檢測。

4.2 優(yōu)缺點和臨床應用

CPA 技術(shù)操作相對簡單，靈敏度高，特異性好，在63 ℃左右反應1 h 即可完成擴增。該技術(shù)的反應時間和反應溫度與LAMP 方法相似，自問世以來，已經(jīng)在禽、牛、豬等多種動物的病原檢測中得到應用（表4）。但CPA反應體系配制過程相對繁瑣，通過添加染料指示劑實現(xiàn)可視化結(jié)果判定時，對弱陽性結(jié)果存在一定的主觀誤差，容易造成假陽性或假陰性。

表4 CPA 技術(shù)在動物病原檢測上的應用舉例

5 賴解旋酶擴增技術(shù)

5.1 技術(shù)原理

賴解旋酶擴增技術(shù)（helicase dependent amplification，HDA）是由美國New Englang Biolabs 公司發(fā)明的一種模擬動物體內(nèi)DNA 復制的新技術(shù)[41]。HDA 技術(shù)擴增反應主要包含5 個階段：（1）利用解旋酶打開DNA 雙鏈，使其變成游離的單鏈形式；（2）結(jié)合蛋白與解旋后的DNA 單鏈結(jié)合，以阻止互補鏈再結(jié)合；（3）利用2 條特異性引物和單鏈靶DNA 雜交，通過DNA 聚合酶延伸和模板退火的引物生成雙鏈DNA；（4）新合成的雙鏈DNA 作為DNA 解旋酶的底物進行下一步的擴增和循環(huán)，實現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴增；（5）擴增完成后，可通過瓊脂糖凝膠電泳、熒光DNA 結(jié)合劑、熒光和電化學等方法進行檢測。

5.2 優(yōu)缺點和臨床應用

與其他等溫擴增技術(shù)相比，HDA 技術(shù)僅需要2 條普通引物，且引物設計相對簡單。但該方法的反應體系較為復雜，方法優(yōu)化會受體系限制，且反應過程大部分需要分兩步在2 個不同溫度條件下完成，反應時間多為1～2 h，并不具備優(yōu)勢。該方法主要用于環(huán)狀DNA 擴增，可以同時完成基因擴增和基因篩選[42]，且擴增產(chǎn)物是均一的，可以直接用于測序，但是反應體系中解旋酶解旋的速度是有限制的，因此不適合擴增長序列。

在動物病原檢測方面，已建立了一些HDA 檢測方法（表5）。但是受多種因素影響，該技術(shù)在病原檢測方面沒有得到廣泛應用。

表5 HDA 技術(shù)在動物病原檢測上的應用實例

6 小結(jié)

5 種等溫擴增技術(shù)，在不同方面都有自己的特點。在引物設計方面，LAMP 和CPA 技術(shù)需要設計2 條以上引物，引物設計難度與要求相對于其他3 種更高。在配制體系方面，NASBA 技術(shù)在反應過程中需要中途加入酶反應液，HDA 技術(shù)需要配制A、B 兩種反應體系，其他3 種技術(shù)只需要配制1 種即可進行反應。在反應溫度方面，LAMP、RPA、RAA、CPA 技術(shù)在整個擴增反應過程中僅需要1 個恒定溫度即可，而NASBA 和HDA 技術(shù)需要2 個甚至3 個反應溫度，反應過程相對復雜。在反應時間方面，RPA 和RAA 技術(shù)最具有優(yōu)勢，5～20 min 即可完成擴增檢測，而其他3 種等溫擴增技術(shù)反應時間普遍在1 h 左右。在產(chǎn)物檢測方面，5 種技術(shù)均可通過瓊脂糖凝膠進行擴增產(chǎn)物檢測，但是這種方式容易產(chǎn)生氣溶膠污染。RPA 和RAA技術(shù)可以結(jié)合熒光探針法，通過熒光信號進行實時檢測，反應過程無需開蓋，避免了污染問題。LAMP 和CPA 技術(shù)可通過在反應管蓋上加入染料指示劑，反應結(jié)束后來回翻轉(zhuǎn)使反應液與指示劑混合均勻，通過顏色變化來判斷反應陰陽性，從反應開始到結(jié)果判定全程封閉，可避免氣溶膠污染并且降低假陽性概率。NASBA 可以通過ECL 閱讀器來判斷反應是否擴增。5 種等溫擴增技術(shù)也可以通過試紙條、膠體金和核酸擴增物快速檢測板等檢測方法實現(xiàn)肉眼可視化檢測，但是把產(chǎn)物加入到試紙條檢測并等待結(jié)果這一階段時間容易產(chǎn)生氣溶膠污染，因此市面上也出現(xiàn)了獨立封閉的試紙條容器，反應管無需開蓋直接放入容器進行檢測，這樣可有效降低檢測結(jié)果假陽性概率，但其成本高于普通的試紙條，主要用于寵物或經(jīng)濟價值較高動物的疫病快速檢測。

7 前景與展望

在動物疫病防控工作中，快速、高效、簡單、便捷的病原檢測方法，可以及早發(fā)現(xiàn)疫病并減少因疫病造成的損失，對促進我國養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展起重要作用。等溫擴增技術(shù)自問世以來，因其特有的技術(shù)優(yōu)勢而備受關(guān)注。近年來，等溫擴增技術(shù)得到不斷發(fā)展和創(chuàng)新，相關(guān)病原檢測方法也層出不窮。

至今，我國已開發(fā)出多種商業(yè)化等溫擴增檢測試劑盒，并申請了相關(guān)專利[48-51]，使等溫擴增技術(shù)得到了進一步推廣和應用。但是等溫擴增技術(shù)作為一種新興技術(shù)，雖然具備許多優(yōu)點，也面臨著諸多挑戰(zhàn)，仍需要不斷改進，例如在反應成本、反應過程穩(wěn)定性、操作簡便性等方面。因此，基于何種情況選擇何種檢測技術(shù)，需要根據(jù)不同需求和場景條件來選擇。此外，等溫檢測技術(shù)還可以借助自身優(yōu)勢，與微流體芯片、納米金、CRISPR 等技術(shù)聯(lián)合應用，建立更加快捷、準確、簡便的檢測方法，從而為動物疫病檢測提供更好的服務。