桔梗皂苷D經(jīng)CYP的代謝活化在抑制A549細(xì)胞活性中的作用研究

宋丹妮,陳蘇勤,管文燕,周徐陳,張正光,郭園園

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院,江蘇 南京 211100；2. 南京鼓樓醫(yī)院,江蘇 南京 210008；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計(jì), 2018年約有209萬(wàn)肺癌新病例和176萬(wàn)死亡病例,分別占癌癥病例總數(shù)的11.6 %和癌癥死亡總數(shù)的18.4 %[1]。在肺癌多種治療手段中,中藥治療已成為我國(guó)治療肺癌的特色，中藥成分在體內(nèi)的代謝與激活機(jī)制逐步引起重視[2]。桔梗皂苷D是從桔梗中分離得到的一種三萜化合物,其具有潤(rùn)肺、化痰、排膿的功效，是桔梗中最重要的抗腫瘤成分。桔梗皂苷D作為一種潛在的抗腫瘤藥物，其在機(jī)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化與代謝效應(yīng)尚缺乏研究。細(xì)胞色素P450酶(CYP450s)作為I相反應(yīng)代謝酶，是關(guān)鍵的藥代動(dòng)力學(xué)因素之一[3]。CYP450s中CYP1A1、1A2、2B6、2E1在肺癌組織中含量豐富，在肺癌的發(fā)生發(fā)展與抗肺癌藥物的代謝作用中起著重要作用[4-7]，其對(duì)桔梗皂苷D的代謝及作用的影響尚不明確，因此本研究進(jìn)行了相關(guān)探討，旨在為桔梗皂苷D作為肺癌的靶向治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞、質(zhì)粒以及細(xì)菌 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)、用于慢病毒包裝的293T細(xì)胞株由實(shí)驗(yàn)室保存。pCDH-CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒pMD2、psPAX、載體質(zhì)粒pCDH均購(gòu)自擎科生物科技有限公司。

1.2試劑 桔梗皂苷D購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自GIBCO公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自Amersham Bioscience公司；一抗CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1購(gòu)自Millipore公司；二抗兔抗羊抗體購(gòu)自KPL公司；轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 2000 Transfection Reagent)購(gòu)自Invitrogen公司；甲醇購(gòu)自Merck(Darmstadt,Germany)。

1.3儀器 VS-1300L細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)購(gòu)自美國(guó)AIR TECH公司；BioPhotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Model 680型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Fresco21高速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Electron公司；RS-232型CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)HERA CELL公司；125-BR垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；LC-MS/MS TSQ8000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.4慢病毒載體構(gòu)建 A549細(xì)胞、293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液中,在37 ℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞消化傳代至培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)使其生長(zhǎng)到80%的融合度，將3 μg pMD2、6 μg psPAX 和7.5 μg載體質(zhì)粒加到150 μL OPTI-MEM內(nèi)混勻；取25 μL Lipofectamine 2000加入到500 μL OPTI-MEM內(nèi)混勻,室溫靜置 5 min,將質(zhì)粒混合物加入Lipofectamine 2000,混勻后室溫靜置15 min,逐滴加入到培養(yǎng)皿內(nèi),充分混勻。6 h后更換為含10% FBS的DMEM新鮮培養(yǎng)液。

1.5穩(wěn)定表達(dá)CYP450s的A549細(xì)胞株的制備 當(dāng)A549細(xì)胞達(dá)到80%～90%的融合度時(shí),將收集到的病毒液加入培養(yǎng)皿中，每隔24 h重復(fù)感染1次,共感染3次。經(jīng)過嘌呤霉素篩選出純化的細(xì)胞系,用蛋白和mRNA表達(dá)水平鑒別細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功。

1.5.1蛋白表達(dá)檢測(cè)方法 采用Western blot法檢測(cè)：取細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,加入Tris裂解液,裂解細(xì)胞1 min后,超聲進(jìn)一步破解。離心后取上清,-20 ℃保存，用BCA法測(cè)定蛋白含量。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜后，將膜轉(zhuǎn)移到封閉液中，1 h后加入一抗,4 ℃孵育過夜,用1×TBST洗膜5次(每次5 min)。加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1～2 h,1×TBST洗膜3次(每次10 min)?，F(xiàn)配發(fā)光液,進(jìn)行曝光及拍照。

1.5.2mRNA表達(dá)檢測(cè)方法 采用PCR法檢測(cè)：Trizol Reagent提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以其為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1.5 min，變性退火及延伸進(jìn)行40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 CYP450s擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.6檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 在96孔板中加入A549細(xì)胞,放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取穩(wěn)定表達(dá)CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1的細(xì)胞系，并設(shè)置空載對(duì)照組。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí),與含不同濃度的(0，1，2，4 μmol/L)桔梗皂苷D孵育24 h后,每個(gè)孔加入10 μL CCK-8溶液,并置于培養(yǎng)箱中1 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)。

1.6.2體外代謝實(shí)驗(yàn) 分別用CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1 P450重組酶在體外進(jìn)行代謝,設(shè)置CYP1A1組、CYP1A2組、CYP2B6組、CYP2E1組。孵育體系：終濃度為0.06 mg/mL桔梗皂苷D,終濃度為0.06 mg/mL重組酶,終濃度為50 mmol/L TrisHCl(pH 7.4),終濃度為5 mmol/L MgCl2,終濃度為1 mmol/L EDTA,加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)并繼續(xù)37 ℃孵育, 直接甲醇終止反應(yīng)為作用0 min,經(jīng)過120 min孵育后加入甲醇終止反應(yīng)為作用120 min，計(jì)算各組作用0 min和120 min時(shí)桔梗皂苷D的含量。超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)條件:檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；色譜柱:Welchrom-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm,Welch Material,Inc,ΜSA)；以水和甲醇為流動(dòng)相,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為2 μL,柱溫25 ℃,10%甲醇(0～15 min)。質(zhì)譜條件:噴霧電壓3 200 V，鞘氣流速50 Bar，輔助氣流速15 Bar，毛細(xì)管溫度350 ℃，分辨率70 000,ESI負(fù)離子檢測(cè)。桔梗皂苷D分子式:C57H92O28,[M-H]-:1223.5686。

1.6.3分子對(duì)接模型預(yù)測(cè) 使用分子對(duì)接模型預(yù)測(cè)桔梗皂苷D與CYP450s的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合力。利用PDB(https://www.rcsb.org/)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下獲得CYP450s的蛋白受體的晶體結(jié)構(gòu)文件,將桔梗皂苷D的SMILES字符串轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)文件。使用Autodock4對(duì)桔梗皂苷D及CYP450s蛋白進(jìn)行處理,運(yùn)行Vina進(jìn)行分子對(duì)接,使用PyMOL將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpadprism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1穩(wěn)定表達(dá)CYP450s細(xì)胞株的建立與鑒定 高表達(dá)CYP450s的A549細(xì)胞系蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，A549-CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1中的代謝酶表達(dá)水平與各空載對(duì)照組相比明顯升高,見圖1；高表達(dá)CYP450s的A549細(xì)胞系mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,表達(dá)CYP450酶的細(xì)胞系出現(xiàn)特征條帶,空載對(duì)照組未出現(xiàn)，見圖2。

注：A549為空載細(xì)胞；A-1A1為穩(wěn)定表達(dá)CYP1A1的A549細(xì)胞系；A-1A2為穩(wěn)定表達(dá)CYP1A2的A549細(xì)胞系； A-2B6為穩(wěn)定表達(dá)CYP2B6的A549細(xì)胞系；A-2E1為穩(wěn)定表達(dá)CYP2E1的A549細(xì)胞系

注：A549為空載細(xì)胞；A-1A1為穩(wěn)定表達(dá)CYP1A1的A549細(xì)胞系；A-1A2為穩(wěn)定表達(dá)CYP1A2的A549細(xì)胞系； A-2B6為穩(wěn)定表達(dá)CYP2B6的A549細(xì)胞系；A-2E1為穩(wěn)定表達(dá)CYP2E1的A549細(xì)胞系；M1為D15000 Marker；M為D2000 Marker

2.2桔梗皂苷D對(duì)A549-CYP450s細(xì)胞系活性的影響 與CYP1A2組、CYP2B6組、CYP2E1組相比，CYP1A1組細(xì)胞活性隨桔梗皂苷D濃度的增加而降低(P均<0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度桔梗皂苷D對(duì)A549-CYP450s細(xì)胞系活性的影響

2.3CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1對(duì)桔梗皂苷D的代謝作用 與作用0 min相比,CYP1A1組作用120 min時(shí)桔梗皂苷D的含量顯著降低(P<0.05),CYP1A2組、CYP2B6組、CYP2E1組作用120 min時(shí)桔梗皂苷D含量與作用0 min時(shí)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 A549細(xì)胞中 CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1作用0 min和120 min對(duì)桔梗皂苷D的代謝效應(yīng)

2.4分子對(duì)接情況 桔梗皂苷D中23-C原子上的-OH與靶點(diǎn)活性位點(diǎn)鐵卟啉中心鐵離子形成穩(wěn)定的螯合鍵，桔梗皂苷D與CYP1A1之間的主要作用力是氫鍵與疏水相互作用，其中桔梗皂苷D與氨基酸殘基F384、S230、T497、K499、D320、F224、N222分別形成氫鍵，與氨基酸殘基I386、L496、F112、F123、V218、G229、V228、Y494、I493形成疏水相互作用。相互作用模式見圖5。

圖5 桔梗皂苷D與CYP450s的分子對(duì)接模型

3 討 論

目前肺癌是癌癥患者死亡的主要原因,肺癌患者5年相對(duì)生存率平均為19%[8]。外科手術(shù)切除通常僅適用于早期肺癌的治療,晚期肺癌的治療策略包括手術(shù)切除、放療、細(xì)胞毒性化學(xué)療法以及光動(dòng)力療法。盡管化學(xué)療法和放射療法的結(jié)合可以提高生存率,但大多數(shù)患者死于疾病進(jìn)展期,通常由于對(duì)化學(xué)治療藥物的獲得性或固有耐藥性引起[9]。因此,抗癌藥物的開發(fā)與作用機(jī)制、生物轉(zhuǎn)化等方面的研究是確保藥物安全使用的前提，也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

天然草藥包含各種酚類化合物、維生素、類胡蘿卜素和類黃酮,具有抗氧化、抗過敏、抗癌等各種藥理作用。作為著名藥用植物,桔梗中的桔梗皂苷D被發(fā)現(xiàn)可以通過多途徑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用[10]。Li等[14]研究證實(shí),桔梗皂苷D可以通過破壞熱休克蛋白90/細(xì)胞分裂周期蛋白37復(fù)合物(Hsp90/Cdc37)的相互作用,反饋?zhàn)钄嘟K止mTOR抑制誘導(dǎo)的存活信號(hào)而發(fā)揮抗癌作用。Zhao等[15]發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、激活JNK和p38 MAPK信號(hào)通路,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬。Han等[16]和Huang等[17]報(bào)道桔梗皂苷D可觸發(fā)肺癌細(xì)胞中程序性死亡配體1(PD-L1)的細(xì)胞外釋放，減少癌細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)，促進(jìn)IL-2分泌和T細(xì)胞活化，恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)。Park等[18]報(bào)道桔梗皂苷D可直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和免疫刺激作用,控制癌癥相關(guān)惡病質(zhì)。

CYP450s是一類血紅蛋白耦聯(lián)單加氧酶，在藥物生物轉(zhuǎn)化、外源性物質(zhì)的解毒、細(xì)胞代謝和體內(nèi)平衡中起著關(guān)鍵作用，是類固醇、脂溶性維生素、致癌物及藥物等物質(zhì)代謝的重要酶，其中CYP1、CYP2、CYP3 和 CYP4族主要參與藥物的代謝。許多中草藥及其活性成分可以通過CYP450s和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響，從而導(dǎo)致藥理作用增強(qiáng)或減弱。因此，明確代謝酶與中藥代謝之間的相互作用，對(duì)于明確藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、活化、代謝和排泄過程有重要意義。

CYP1A1是CYP450s的主要代謝酶之一，主要存在于氣管、肺等呼吸系統(tǒng)組織，代謝包括脂肪酸花生四烯酸、氟喹諾酮類抗生素雙氟沙星和藥物茶堿等底物[19]。在中藥方面，CYP1A1可代謝吳茱萸堿、脫氫吳茱萸堿和蕓香堿等傳統(tǒng)上用于治療高血壓和胃腸道疾病的藥物[20]。盡管大多數(shù)研究集中在CYP1A1的致癌作用上，但越來越多的研究表明這種酶在抗癌藥物的代謝中也起著重要作用。 Wilsher等[21]和Ren等[22]報(bào)道，在CYP1A1的作用下黃酮醇高良姜素(3’,5,7三羥基黃酮) 被羥基化和去甲基化，產(chǎn)生代謝物山柰酚，山柰酚是一種抗非小細(xì)胞肺癌的黃酮類化合物。

為了探究肺癌細(xì)胞中桔梗皂苷D的主要代謝酶,本實(shí)驗(yàn)選擇人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行研究。首先通過分子生物學(xué)手段穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CYP代謝酶基因建立細(xì)胞模型,并通過蛋白和mRNA檢測(cè)證明該細(xì)胞系的成功構(gòu)建。鑒于細(xì)胞活性與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān),細(xì)胞活性的改變可以直接反映細(xì)胞損傷狀態(tài),影響腫瘤抑制基因的失衡，故使用CCK-8試驗(yàn)初步評(píng)估桔梗皂苷D在CYP代謝酶激活后對(duì)A549細(xì)胞活性的影響，并通過體外孵育實(shí)驗(yàn)篩選出桔梗皂苷D在呼吸系統(tǒng)的主要代謝酶。結(jié)果顯示桔梗皂苷D經(jīng)CYP1A1代謝活化抑制了A549細(xì)胞活性,CYP1A1是A549細(xì)胞中的桔梗皂苷D主要代謝酶,桔梗皂苷D經(jīng)CYP1A1代謝活化增強(qiáng)了對(duì)肺癌細(xì)胞活性的抑制作用。另外分子對(duì)接模型預(yù)測(cè)提示桔梗皂苷D與CYP1A1有較強(qiáng)的結(jié)合力。

綜上所述，桔梗皂苷D在肺癌細(xì)胞中經(jīng)CYP1A1可以有效活化代謝,對(duì)肺癌細(xì)胞有明顯抑制作用，本研究結(jié)果為CYP1A1基因功能的豐富及桔梗皂苷D在肺癌治療作用方面的合理應(yīng)用和臨床藥理研究提供了理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。