低溫脅迫高山杜鵑對外源氯化鈣和脫落酸的響應(yīng)

李小玲， 華智銳， 楊文怡， 張 飛

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院， 陜西 商洛 726000； 2.陜西天士力植物藥業(yè)有限責(zé)任公司， 陜西 商洛 726000)

0 引言

【研究意義】高山杜鵑〔Rhododendronlapponicum(L.)Wahl.〕屬杜鵑花科常綠灌木，是我國傳統(tǒng)十大名花之一，與報(bào)春、龍膽屬植物合稱為世界三大高山花卉[1]。高山杜鵑因其花序巨大、色彩艷麗和花姿優(yōu)美等特點(diǎn)有著較高的觀賞價(jià)值，同時(shí)枝葉可入藥，藥用開發(fā)利用價(jià)值高[2]，市場開發(fā)前景廣闊。高山杜鵑多生長于海拔高、山地陰坡、雜林和林緣草坡上，使得植株形成了喜冷涼、對周邊環(huán)境因子要求高的特點(diǎn)，為其產(chǎn)業(yè)化、園藝化和規(guī)模化種植帶來了難題。在自然界中存在各種非生物因子的脅迫，其對植物的生長發(fā)育可造成不同程度的傷害。溫度作為植株生理代謝過程中的主要生態(tài)因子[3]，植物體在低溫逆境中自身的形態(tài)、生理和超微結(jié)構(gòu)均受到不同程度的影響，如其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致相關(guān)的生理指標(biāo)發(fā)生變化，生長發(fā)育受阻甚至損傷[4]等。因此，探索減輕低溫脅迫對高山杜鵑造成傷害的措施對實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化、園藝化和規(guī)?；N植具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鈣離子(Ca2+)作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中主要的第二信使，在生物膜膜完整性和膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面有著重要作用[5]。在參與低溫信息傳導(dǎo)過程中，鈣離子作為低溫信號傳遞分子可參與和調(diào)節(jié)冷害基因的正常表達(dá)以應(yīng)對低溫脅迫[6]。外源氯化鈣(CaCl2)可作為誘導(dǎo)劑用于增強(qiáng)植物抗寒性[7-9]的抗寒性。脫落酸(Abscisic acid，ABA)作為一類脂溶性的小分子植物激素，可抑制種子萌發(fā)，促進(jìn)種子休眠和葉片衰老脫落等；同時(shí)也是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要信號因子，其作用機(jī)制在于可通過保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，維持膜功能和誘導(dǎo)抗冷基因表達(dá)以增強(qiáng)植物抗冷性。因此，向處于逆境中的植物體噴施外源ABA能有效緩解逆境對植物體造成的傷害[10]。王興等[11]研究表明，在低溫脅迫過程中，隨著植物體內(nèi)ABA的積累，植物的抗寒性隨之升高且ABA的含量在抗寒性強(qiáng)的植物體內(nèi)明顯高于抗寒性相對弱的。對植物體噴施外源ABA后，植物體內(nèi)源ABA含量進(jìn)一步上升且抗寒性強(qiáng)的品種增幅更為顯著，研究表明，對植物體噴施外源ABA可以緩解逆境中植物體內(nèi)丙二醛含量和相對電導(dǎo)率的上升，提高可溶性蛋白的含量，減輕低溫脅迫對植株造成的傷害[12]。目前國內(nèi)關(guān)于外源物質(zhì)對低溫脅迫下植物生理特性影響研究多集中在對低溫較敏感的作物上[13-14]，高山杜鵑作為一種適應(yīng)高海撥地區(qū)冷涼氣候的野生花卉，有關(guān)外源物質(zhì)對其生理特性方面的研究多集中于耐熱性方面[15-17]。王浩琪等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高山杜鵑低山引種時(shí)噴施外源抗熱劑可有效緩解高溫對其造成的損傷，其中，均以噴施1 500 mg/L氯化鈣、100 mg/L對氨基水楊酸+600 mg/L海藻酸+800 mg/L氯化鈣對不同規(guī)格的馬纓杜鵑和露珠杜鵑均具有較好緩解效果；噴施100 mg/L對氨基水楊酸+600 mg/L海藻酸+800 mg/L氯化鈣對云錦杜鵑效果最佳；噴施1 500 mg/L氯化鈣對大白杜鵑效果最佳。李小玲等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對高山杜鵑的影響較大，不同高山杜鵑品種的耐熱性存在差異，但其熱傷害指數(shù)均隨溫度和脅迫時(shí)間的增加而增加；高山杜鵑在遭受高溫逆境后其生理生化指標(biāo)會發(fā)生顯著的變化，且變化趨勢與其耐熱性密切相關(guān)?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有的研究主要集中于高山杜鵑耐熱性方面，而對低溫脅迫下高山杜鵑的生理特性研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以秦嶺高山杜鵑幼苗為材料，采用單因素試驗(yàn)研究低溫脅迫下噴施不同濃度外源CaCl2和ABA對高山杜鵑受冷害程度和生理特性的影響，以期為減輕低溫脅迫對高山杜鵑造成的傷害和抗性育種研究提供借鑒和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2021年4月采摘于商洛市鎮(zhèn)安縣木王國家森林公園海拔1 500 m左右的茨溝杜鵑花景區(qū)。

1.1.2 試劑 ABA購自上海藍(lán)季生物有限公司，含量≥98%(AR級)，分析純；無水氯化鈣(CaCl2)為購自廊坊乾耀科技有限公司，含量≥96%，分析純。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理 選取株高25～30 cm的高山杜鵑幼苗移栽至盆中，單盆單株栽于腐葉土與松針土體積比為1∶2的盆栽基質(zhì)中。每天下午取0.2%硫酸亞鐵溶液100 mL噴灑幼苗，7 d后選取生長基本一致的幼苗開展試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 外源CaCl2和ABA噴施對低溫脅迫高山杜鵑幼苗受冷害程度的影響。2種外源物各設(shè)5個(gè)處理，分別噴施CaCl20 mg/L(T0，CK)、600 mg/L(T1)、800 mg/L(T2)、1 000 mg/L(T3)、1 200 mg/L(T4)；ABA 0 mg/L(N0，CK)、5 mg/L(N1)、10 mg/L(N2)、15 mg/L(N3)、20 mg/L(N4)，CK均為噴灑蒸餾水。具體操作參照石如意等[10]的方法進(jìn)行，即采用不同濃度的CaCl2和ABA分別連續(xù)噴施3 d后，將各處理杜鵑幼苗置于人工氣候箱中，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h，0℃低溫脅迫處理2 d，然后對高山杜鵑幼苗冷害程度進(jìn)行分級統(tǒng)計(jì)，篩選2種外源物的最佳噴施濃度。后續(xù)試驗(yàn)將采用篩選出的CaCl2和ABA最佳濃度進(jìn)行。杜鵑幼苗的冷害程度分為1～5級：1級，無冷害癥狀；2級，1～2片葉邊有輕度萎蔫；3級，1/2以下的葉片萎蔫死亡；4級，1/2以上葉片萎蔫死亡；5級，整株幼苗死亡。

2) 外源CaCl2和ABA噴施對低溫脅迫高山杜鵑幼苗生理機(jī)制的影響。共設(shè)4個(gè)處理，即以幼苗受冷害程度試驗(yàn)篩選出的CaCl2和ABA最適濃度作為處理?xiàng)l件分別對高山杜鵑幼苗進(jìn)行噴施，在經(jīng)過常溫培養(yǎng)3 d后對高山杜鵑幼苗進(jìn)行0℃低溫連續(xù)脅迫，對照為噴灑蒸餾水+常溫25℃(CK1)和蒸餾水+0℃低溫脅迫(CK2)。處理后5 d內(nèi)每天采摘稱取高山杜鵑植株健康葉片0.5 g去主脈，進(jìn)行剪碎、研磨、離心，將提取酶液保存以測定高山杜鵑相關(guān)的生理指標(biāo)，連續(xù)測5 d，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.3 指標(biāo)測定 采用茚三酮法[18]測定脯氨酸含量，硫代巴比妥酸法[19]測定MDA含量，氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[20]和愈創(chuàng)木酚顯色法[21]分別測定超氧化物歧化酶(SOD)活性及過氧化物酶(POD)活性，電導(dǎo)儀法[22]測定相對電導(dǎo)率，考馬斯亮藍(lán)G-250法[18]測定可溶性蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施外源CaCl2和ABA高山杜鵑幼苗受冷害程度

由表1可知，噴施外源CaCl2和ABA后高山杜鵑幼苗受冷害的程度存在差異。

表1 噴施不同濃度外源ABA(N)和CaCl2(T)高山杜鵑幼苗受冷害程度

2.1.1 噴施CaCl2噴施外源CaCl2后，第1天時(shí)各處理高山杜鵑幼苗的受冷害程度為2～4級，第2天時(shí)為3～5級，均隨CaCl2濃度升高呈先降后升趨勢。其中，T2(800 mg/L CaCl2)第1天和第2天的冷害級別分別為2級和3級，較CK(3級和4級)的冷害級別低；T1和T3冷害級數(shù)與CK一致，T4(4級和5級)的冷害級數(shù)最高，且均較CK高。

2.1.2 噴施ABA 噴施外源ABA后，第1天時(shí)各處理高山杜鵑幼苗的受冷害程度為1～3級，第2天時(shí)為2～4級，均隨ABA濃度升高呈先降后升趨勢。其中，N2(10 mg/L ABA)第1天和第2天的冷害級別分別為1級和2級，低于CK及其余處理；N1和N3冷害級別均為2級和3級，均低于CK；T4(4級和5級)的冷害級別最高，與CK一致。

綜上看，噴施外源800 mg/L CaCl2和10 mg/L ABA 處理效果最佳，可明顯降低高山杜鵑幼苗冷害程度及減少低溫對高山杜鵑幼苗造成的威脅，且ABA處理稍優(yōu)于CaCl2處理；同時(shí)，受冷害程度與外源物質(zhì)的濃度有關(guān)，在一定濃度下能緩解冷害級別，促進(jìn)高山杜鵑幼苗生長；但隨著外源物質(zhì)濃度升高，緩解效應(yīng)會受到抑制。

2.2 噴施外源CaCl2和ABA高山杜鵑生理指標(biāo)的變化

2.2.1 相對電導(dǎo)率及丙二醛(MDA)含量 由圖1可知，隨處理時(shí)間延長，除CaCl2的MDA含量呈先增后減再升趨勢外，各處理高山杜鵑的相對電導(dǎo)率和MDA含量均呈逐漸增加趨勢。

1) 相對電導(dǎo)率。CaCl2處理為29.78%～50.11%，ABA處理為31.13%～53.99%，CK127.72%～39.11%，CK234.33%～60.12%；不同時(shí)段各處理的相對電導(dǎo)率均呈CK2>ABA>CaCl2>CK1。其中，第2～3天時(shí)CK2相對電導(dǎo)率的升幅較其余處理高；處理第5天時(shí)，各處理的相對電導(dǎo)率分別第1天增加41.09%、75.12%、68.27%和73.43%，CK2的增加幅度較其他處理最為顯著。各時(shí)段CK2的相對電導(dǎo)率上升趨勢高于CK1；而低溫脅迫下ABA和 CaCl2處理的高山杜鵑幼苗體內(nèi)相對電導(dǎo)率上升較慢，說明高山杜鵑噴施外源ABA和CaCl2可有效緩解低溫脅迫對其造成的傷害。

2) 丙二醛(MDA)含量。CaCl2處理為6.8～11.9 μmol/g，ABA處理為7～13.2 μmol/g，CK16.1～8.2 μmol/g，CK29.3～17.9 μmol/g；不同時(shí)段各處理的MDA含量均呈CK2>ABA>CaCl2>CK1。其中，第2～3天時(shí)CK2的MDA含量上升幅度較其余處理高；處理第5天時(shí)，各處理的MDA含量分別較第1天增加34.43%、92.47%、75.00%和88.57%，CK2增加幅度較其他處理最為顯著。各時(shí)段CK2的MDA含量上升趨勢顯著高于CK1；而低溫脅迫下ABA和 CaCl2處理的高山杜鵑幼苗體內(nèi)MDA含量上升較慢，說明噴施外源ABA和CaCl2對低溫脅迫下高山杜鵑所受的冷害有緩解作用。

2.2.2 SOD及POD活性 由圖2可知，隨處理時(shí)間延長，除CK1外其余處理高山杜鵑的SOD及POD活性均呈先增后減趨勢，而CK1的SOD活性和POD活性變化總體呈緩慢上升趨勢。

1) SOD活性。CaCl2處理為 36.11～45.98 U/g，ABA處理為34.89～47.31 U/g，CK126.92～35.11 U/g，CK232.14～36.92 U/g；第2天各處理的SOD活性呈CaCl2>ABA>CK2>CK1，之后均呈ABA>CaCl2>CK2>CK1。其中，第4天時(shí)CK2、ABA和CaCl2處理的SOD活性均達(dá)最高值，分別較第1天增加35.53%、51.82%和37.97%；CaCl2和ABA處理較CK2和CK1分別提高14.37%和45.54%，21.60%和54.75%；CK1在處理第5天時(shí)達(dá)最高值，較第1天增加30.42%。說明，噴施外源ABA和CaCl2可提高低溫脅迫下高山杜鵑的SOD活性，增強(qiáng)其抗寒性。

2) POD活性。CaCl2處理為T 23.15～33.97 U/g，ABA處理為21.66～34.54 U/g，CK120.23～24.96 U/g，CK220.44～26.31 U/g；不同時(shí)段各處理的POD活性均呈CaCl2>ABA>CK2>CK1。其中，ABA和 CaCl2的POD活性在處理第4天時(shí)達(dá)最高值，分別較第1天增加75.21%和51.71%；CK2和CK1分別在處理第3天和第5天時(shí)達(dá)最高值，分別較第1天增加43.88%和23.38%；CaCl2和ABA處理較CK2和CK1分別提高25.03%和50.92%，35.10%和63.09%。表明，噴施適宜濃度的外源ABA和CaCl2可提高低溫脅迫下高山杜鵑的POD活性，增強(qiáng)其抗寒性。

2.2.3 可溶性蛋白和游離脯氨酸含量 從圖3看出，隨處理時(shí)間延長各處理高山杜鵑的可溶性蛋白含量呈逐漸升高趨勢，游離脯氨酸含量除CK1呈逐漸上升趨勢外，其余處理均呈先增后減趨勢。

1) 可溶性蛋白含量。CaCl2處理為11.57～22.98 mg/g，ABA處理為12.12～25.79 mg/g，CK110.49～15.12 mg/g，CK212.12～21.319 mg/g；不同時(shí)段各處理的可溶性蛋白含量均呈ABA>CaCl2>CK2>CK1；隨著脅迫時(shí)間延長，可溶性蛋白含量均在處理第5天時(shí)達(dá)最大值。其中，CK2高山杜鵑幼苗可溶性蛋白含量的升幅顯著高于CK1，CaCl2和ABA處理高山杜鵑幼苗的可溶性蛋白含量也呈上升趨勢且顯著高于CK2。說明，施加外源ABA和CaCl2可明顯提高低溫脅迫下高山杜鵑幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成能力，從而增強(qiáng)其耐寒性。

2) 游離脯氨酸含量。CaCl2處理為145.9～176.5 μg/g，ABA處理為139.5～197.6 μg/g，CK196.5～126.9 μg/g，CK2121.1～151.3 μg/g；第2天時(shí)各處理的游離脯氨酸含量呈CaCl2>ABA>CK2>CK1，之后均呈ABA>CaCl2>CK2>CK1；隨著脅迫時(shí)間延長，CK2、ABA和CaCl2處理的游離脯氨酸含量均在第4天時(shí)達(dá)最大值；CK1的游離脯氨酸含量最大值則出現(xiàn)在第5天。由此可知，高山杜鵑幼苗在低溫下施加外源CaCl2和ABA能使得游離脯氨酸的含量在植株體內(nèi)得以積累，從而增強(qiáng)抗寒性。

3 討論

研究結(jié)果表明，噴施外源800 mg/L CaCl2和10 mg/L ABA可明顯緩解低溫逆境對高山杜鵑幼苗造成的損傷，且ABA稍優(yōu)于CaCl2，同時(shí)在一定程度上也能促進(jìn)高山杜鵑幼苗生長；逆境脅迫下的高山杜鵑幼苗受冷害程度與外源物質(zhì)的濃度有關(guān)，但隨著外源物質(zhì)濃度升高，緩解效應(yīng)會受到抑制。

低溫對植物造成冷害的原因可能是細(xì)胞膜膜系統(tǒng)的損傷。細(xì)胞膜透性的變化可引起植株相對電導(dǎo)率的改變，膜脂過氧化后丙二醛的含量明顯升高，所以用相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化可以直觀地反映出植物細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的損傷程度[23]。研究表明，低溫(0℃)條件下高山杜鵑幼苗的相對電導(dǎo)率與丙二醛含量較常溫(對照)顯著上升，而噴施外源CaCl2和ABA后對比低溫未噴施外源物質(zhì)的高山杜鵑幼苗，其相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均有不同程度的下降，與李淑順等[24]的研究結(jié)果類似，說明低溫脅迫下噴施外源CaCl2和ABA對植物膜系統(tǒng)有積極作用，能夠緩解冷害，提高高山杜鵑幼苗的抗寒性。

低溫逆境中，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基大量積累，當(dāng)活性氧含量超過防御系統(tǒng)的清除能力即會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。植物體細(xì)胞內(nèi)特有能清除由膜損傷產(chǎn)生活性氧自由基的相應(yīng)保護(hù)酶，此特性可以減輕低溫對幼苗造成的傷害，主要包括SOD和POD，SOD是通過消除活性氧維持細(xì)胞膜的完整性；POD能消除對植物自身有毒害的過氧化物[25]。研究表明，低溫脅迫下，噴施外源CaCl2和ABA對高山杜鵑幼苗SOD和POD活性緩解趨勢相似，均呈先升再降趨勢，隨著植物受損程度增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡關(guān)系被打破，SOD和POD活性隨之升高。且噴施外源ABA和CaCl2的高山杜鵑幼苗體內(nèi)SOD和POD活性相較對照顯著增強(qiáng)，說明，ABA和CaCl2具有提高高山杜鵑幼苗SOD與POD活性的作用，從而提高高山杜鵑幼苗代謝強(qiáng)度，緩解逆境對幼苗造成的氧化損傷。

可溶性蛋白含量可說明植物體的代謝狀況，其可維持細(xì)胞膜穩(wěn)定和保護(hù)植株自身活力。因此，其含量越高植物的抗逆性越強(qiáng)?？扇苄缘鞍资羌?xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量升高可降低低溫對細(xì)胞膜造成的損傷，增強(qiáng)植株抵御不良環(huán)境的能力。研究結(jié)果表明，外源噴施ABA和CaCl2可以使高山杜鵑的可溶性蛋白含量升高，與黃杏等[25-27]的研究結(jié)果一致。

脯氨酸作為細(xì)胞質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能調(diào)節(jié)和維持結(jié)凍前凍融后原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，在低溫逆境中，植株體內(nèi)脯氨酸的含量積累增多，脯氨酸對于保持細(xì)胞組織含水量，保護(hù)質(zhì)膜完整性發(fā)揮重要的作用[26]。在逆境脅迫條件下，抗冷性植物體內(nèi)積累的脯氨酸含量明顯較高，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞水分的變化從而增強(qiáng)植物對低溫脅迫的抗性。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，噴施一定濃度的外源ABA溶液和CaCl2溶液明顯提高高山杜鵑幼苗的脯氨酸含量，與伍寶朵等[27]的研究結(jié)果一致，說明對低溫脅迫下植株噴施外源氯化鈣和脫落酸能提高游離脯氨酸的含量，提高高山杜鵑幼苗的抗寒性。但在低溫條件下使用濃度設(shè)置、外源物種類及大田栽培方面還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低溫脅迫下高山杜鵑幼苗噴施10 mg/L ABA和800 mg/L CaCl2可明顯降低其受冷害程度，其中，噴施10 mg/L ABA緩解冷害的(1級和2級)效果優(yōu)于800 mg/L CaCl2(2級和3級)。噴施ABA和CaCl2后，低溫脅迫下高山杜鵑的SOD和POD活性隨噴施濃度增加呈先升后降趨勢，且均在第4天時(shí)達(dá)最高，SOD活性分別為52.97 U/g和49.82 U/g，POD活性分別為37.95 U/g和35.12 U/g，相較于低溫(0℃)脅迫噴施蒸餾水(CK2)，噴施ABA和CaCl2的POD活性分別升高35.10%和25.03%，SOD活性分別升高21.60%和14.37%，可溶性蛋白在達(dá)最高值時(shí)分別提升20.97%和7.79%，相對電導(dǎo)率達(dá)最高值時(shí)分別降低10.20%和16.65%，丙二醛達(dá)最高值時(shí)分別降低26.26%和33.52%。噴施10 mg/L ABA和800 mg/L CaCl2能明顯緩解低溫(0℃)對高山杜鵑造成的冷害。