火龍果水提物對皮膚的安全性及體內抗氧化性評價

方曉彤， 楊 虹， 王 宇， 穆 波， 王前菊， 周俊良*

(1. 貴州省果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006； 2. 貴州中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002)

0 引言

【研究意義】近年來，貴州省火龍果種植面積和產量迅速增加，紫紅龍是其主要栽培品種之一[1]?；瘕埞麨橄扇苏瓶?Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)植物果實，是一種熱帶和亞熱帶氣候水果[2]。火龍果富含維生素和氨基酸、酚類物質等[3-4]，以其色澤好和口感佳受到消費者的歡迎。但由于受產期短、貯藏性較差和肉質纖維容易老化等因素的限制[5]，火龍果采收上市極易造成旺產滯銷。因此，尋求新的加工思路，是促進火龍果保值、增值的重要手段。開展火龍果水提物對皮膚的安全性及其體內抗氧化活性研究，對提高火龍果附加值，促進貴州火龍果產業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】貴州火龍果的加工產品僅為果汁、果酒和果脯等，加工方式較單一，產品影響力較小，市場占比較低。近年來，火龍果中活性物質的提取成為新的研究熱點。目前對火龍果有效成分提取的研究已有文獻報道。何麗芳等[6-7]采用超聲波輔助乙醇法提取紅心火龍果中的原花青素和花色苷。李國勝等[8]采用亞臨界水法提取火龍果莖中的多糖，提取率為20.53%。王雨欣等[9]采用超聲波-微波協(xié)同萃取提取火龍果果皮黃酮，提取率為6.93 mg/g。胡元慶等[10]采用微波輔助法提取火龍果果皮色素，提取率為1.07%。朱玲等[11]采用超聲波輔助提取火龍果果皮中的果膠，提取率為12.65%。另外，火龍果的酚類物質在人體內可以清除自由基，總抗氧化能力為39.02 U/mL，能起到抗氧化的作用[12]；多糖類成分可以有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的活性[13]；甜菜素具有抗炎作用[14]；果汁提取物具有舒化血管的作用[15]；氨基酸具有提高免疫力和改善皮膚敏感性的作用[16]?！狙芯壳腥朦c】隨著貴州火龍果產量與種植面積雙增長，為促進農民增收及產業(yè)良性發(fā)展，亟需提高其商品附加值的加工新思路。目前已有對火龍果花色苷、黃酮和多糖等提取的相關研究，但鮮見對火龍果水提物的研究與應用，因此，以紫紅龍火龍果為研究對象，研究其水提物對皮膚安全性及體內抗氧化性?！緮M解決的關鍵問題】以SPF級大鼠為研究對象，通過皮膚涂抹的方法研究紫紅龍火龍果水提物對大鼠皮膚的急性經皮毒性及其皮膚含水量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的影響，探明紫紅龍火龍果水提物對皮膚的安全性及其體內抗氧化活性，為提高火龍果附加值，擴大其在食品、化妝品等領域開發(fā)應用提供毒理學依據，進而為促進貴州火龍果產業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 火龍果 采自貴州省果樹科學研究所安順市鎮(zhèn)寧縣熱帶亞熱帶果樹科研示范基地，為成熟度適中且無機械損傷的紫紅龍火龍果。

1.1.2 SPF級大鼠 38只，雌雄各半，230～280 g，大鼠及其飼料均購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司。

1.1.3 試劑 冰醋酸(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化岐化酶(SOD)試劑盒，購于南京建成生物工程研究所?；瘕埞嵛铮灾?。

1.1.4 主要儀器設備 JEA501電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；H1850-R型冷凍離心機，湖南湘儀儀器有限公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；KW-100TDV超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電陶爐(2 200 W)及純露精油提取器，成都普檢儀器有限公司；Elx800酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；智顯皮膚測試儀，寧波市瑞爾芭比醫(yī)療設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性經皮毒性試驗 參照《化妝品安全技術規(guī)范》[17]中的急性經皮毒性試驗方法，選擇SPF級大鼠10只(雌雄各半，雌性未孕且未曾產仔)進行1次限量法試驗，適應性飼養(yǎng)，試驗前24 h將其背部去毛30 cm2(5 cm×6 cm)。將0.5 mL水提物均勻涂抹于大鼠背部剃毛區(qū)域，用無刺激膠布固定，避免大鼠舔食，每只大鼠分籠飼養(yǎng)。涂抹受試物24 h后，用清水除去殘留受試物。觀察大鼠死亡情況及中毒表現(xiàn)，包括大鼠的眼睛和黏膜、呼吸、中樞神經系統(tǒng)及四肢活動等，持續(xù)觀察7 d。

1.2.2 皮膚刺激性試驗 參照《化妝品安全技術規(guī)范》[17]中的單次皮膚刺激和多次皮膚刺激方法進行試驗。1)單次。選擇SPF級大鼠6只(雌雄各半)適應性飼養(yǎng)，試驗前24 h將其背部去毛30 cm2(5 cm×6 cm)。將0.5 mL火龍果水提取物均勻涂抹大鼠背部剃毛區(qū)域，用無刺激膠布加以固定，封閉24 h后用清水去除殘留受試物。于去除殘留受試物后1 h、3 h、8 h、24 h、48 h和72 h觀察涂抹部位皮膚反應，并對其皮膚有無紅斑結痂和水腫的形成按照皮膚刺激反應評分標準(表1)進行評分，以受試物動物的積分平均值進行綜合評價。根據積分均值判斷皮膚刺激強度：0～0.5分，無刺激性；0.5～2.0分，輕刺激性；2.0～6.0分，中刺激性；6.0～8.0分，強刺激性。2)多次。選擇SPF級大鼠10只(雌雄各半，雌性未孕且未曾產仔)適應性飼養(yǎng)，試驗前24 h將試驗動物的背部脊柱兩側各去毛4 cm2(2 cm×2 cm)，其中左側皮膚為對照區(qū)(未涂抹火龍果水提物)，右側皮膚為試驗區(qū)。將0.5 mL火龍果水提物均勻涂抹在右側皮膚，每天1次，每次給予前需提前剃毛，連續(xù)涂抹14 d，涂抹1 h后，觀察皮膚狀態(tài)，試驗區(qū)和對照區(qū)按照表1進行評分。14 d后，計算每天每只動物平均積分，根據積分均值判斷皮膚刺激強度。

表1 皮膚刺激反應評分標準

每天每只動物平均積分=(∑紅斑和水腫積分/受試動物數(shù))/14

1.2.3 大鼠背部皮膚的抗氧化能力測定 對皮膚抗氧化能力的影響參照《化妝品安全技術規(guī)范》[17]中的方法，主要通過檢測皮膚含水量、大鼠皮膚組織丙二醛含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性等指標進行評價。

1) 含水量。將12只涂抹火龍果水提物的SPF級大鼠(雌雄各半，體重200.0～250.0 g)飼養(yǎng)5 d后，選取大鼠背部左右對稱皮膚進行剃毛(面積為2.5 cm×2.5 cm)，剃毛24 h后開始試驗。大鼠背部右側剃毛區(qū)給予火龍果水提物，給藥量為600 mg/kg，給藥面積為2 cm×2 cm，連續(xù)給藥30 d，在左側剃毛區(qū)域給予等體積生理鹽水作對照。給藥期間需在給藥前12 h對大鼠背部皮膚進行剃毛清理。分別在給藥 14 d、23 d和30 d采用智顯皮膚測試儀進行皮膚含水量測定。

2) 丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。于皮膚含水量測定試驗停止給藥24 h后(第31天)對大鼠背部左右兩側皮膚進行取材，采用脊椎脫臼法將大鼠處死，取背部左右兩側皮膚(1 cm×1 cm)，放入-80℃冰箱保存。采用分析天平稱取皮膚組織，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入生理鹽水，將組織剪碎并用手握式勻漿器進行冰浴勻漿，勻漿后3 000 r/min離心10 min，取上清液于-80℃冰箱保存。采用試劑盒檢測丙二醛含量，按說明書將測試樣品與其余試劑依次加入，混勻后95℃水浴加熱40 min，冷卻后放入離心機，3 500 r/min離心10 min。取上清液放入細胞培養(yǎng)板中，蓋上防塵蓋，放入酶標儀中測量吸光度，測定波長為532 nm。采用試劑盒測定SOD活性，按照說明書將待測勻漿上清液與其余試劑依次加入，混勻后37℃恒溫孵育20 min，使用酶標儀測定吸光度，測定波長為450 nm。計算丙二醛含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。

MDA含量(nmol/mg prot)=[(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)]/[標準品濃度(10 nmol/mL)/待測樣本蛋白濃度(mg prot/mL)]

SOD活性(U/mg prot)=[SOD抑制率×待測樣本蛋白濃度(mg prot/mL)]/反應體系稀釋倍數(shù)

1.3 數(shù)據統(tǒng)計與分析

數(shù)據采用SPSS 20.0進行鄧肯氏差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 皮膚刺激性

2.1.1 急性經皮毒性 對試驗大鼠給予火龍果水提物后，分別于1 h、3 h、8 h、24 h觀察，大鼠一般生活狀況無明顯變化，呼吸、肢體、行為活動等正常，未出現(xiàn)震顫、抽搐、腹瀉、昏迷等現(xiàn)象。連續(xù)觀察7 d均未出現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡現(xiàn)象。

2.1.2 單次皮膚刺激性 觀察發(fā)現(xiàn)，單次給藥后，個別大鼠因為舔舐抓撓形成皮膚局部紅斑，但均未出現(xiàn)水腫。因此，評分時僅對紅斑情況進行評分。從表2看出，平均總積分為0.17～0.50分，且隨處理時間延長平均總積分呈增加趨勢，但在觀察時段內皮膚刺激強度均表現(xiàn)為無刺激性，且所有大鼠均未出現(xiàn)水腫現(xiàn)象。

表2 火龍果水提物給予大鼠單次皮膚刺激反應不同時段的評分

2.1.3 多次皮膚刺激性 觀察發(fā)現(xiàn)，給予火龍果水提物連續(xù)14 d期間，大鼠無毒性癥狀和死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。各組大鼠外觀及行動正常，皮毛光澤，眼、耳、口、鼻未見異常分泌物。大鼠皮膚形成局部紅斑，均未出現(xiàn)水腫，未見刺激性，與對照無明顯差異。從表3看出，多次給予大鼠火龍果水提物后，給藥處理和對照均在給予火龍果水提物第2天出現(xiàn)癥狀且刺激反應評分呈先升后降趨勢。其中，給藥處理于給予火龍果水提物第2天出現(xiàn)輕微紅斑，第4～6天時紅斑癥狀最嚴重，第7天時紅斑開始消退，隨著時間推移癥狀減輕，在給予火龍果水提物第10天時紅斑消失；對照于第2天出現(xiàn)紅斑，第4天時紅斑最嚴重，第11天時紅斑消失。給藥處理和對照每天每只動物積分均值分別為0.179分和0.221分，積分均低于0.5分，表明，火龍果水提物外用對大鼠的完整皮膚無刺激作用。

表3 火龍果水提物多次皮膚刺激反應不同時段的評分

2.2 火龍果水提物處理大鼠皮膚的含水量

從表4看出，對照大鼠皮膚的含水量隨時間推移呈先降后升趨勢，但差異不顯著；給藥處理大鼠皮膚含水量呈逐漸上升趨勢，23～30 d含水量較14～23 d增加迅速，第30天較第14天時顯著增加73.6%；給藥處理在第23天和第30天分別較對照顯著提高56.8%和30.5%。觀察發(fā)現(xiàn)，對照大鼠背部皮膚光滑柔軟，但觸感略為粗糙，而給藥處理大鼠皮膚表面光滑柔軟且觸感較細致。

表4 火龍果水提物處理不同時段大鼠皮膚的含水量

2.3 火龍果水提物處理大鼠皮膚組織的MDA含量和SOD活性

從表5看出，給藥處理大鼠皮膚組織中MDA含量為0.92 nmol/mg，較對照(3.04 nmol/mg)顯著降低69.7%；給藥處理大鼠皮膚組織中SOD活性為3.04 U/mg，較對照(2.77 U/mg)提升20.6%，但差異不顯著。

表5 火龍果水提物處理大鼠皮膚的MDA含量和SOD活性

3 討論

紫紅龍火龍果是貴州省主要栽培的品種之一，其不僅營養(yǎng)豐富且具有一定藥用價值[18]，其有效成分具有抑菌、抗炎、調節(jié)免疫、降血糖、降血脂及抗癌等功效[19-21]，且不具有毒性[22]。研究采用的水蒸氣蒸餾法常用于植物果實、果皮及中藥材有效成分的提取[23-25]，主要提取成分為揮發(fā)性物質、小分子生物堿及部分酚類物質等。火龍果水提物為液體且無色無味，經急性經皮毒性試驗，所有大鼠均未出現(xiàn)中毒癥狀及死亡現(xiàn)象，對大鼠進行單次、多次皮膚刺激后，個別大鼠因為舔舐抓撓形成皮膚局部紅斑，但均未出現(xiàn)水腫，給藥組和對照組每天每只動物積分均值分別為0.179分和0.221分，積分均低于0.5分，表明火龍果水提物外用對大鼠的完整皮膚無刺激作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，中華獼猴桃水提液對羥自由基的清除率可達95.57%[26]；通過飲用百香果果殼水提物，肉兔血清中SOD活性可達172.45 U/mL，有效降低氧化應激[27]；通過給小鼠灌服600 mg/mL的西番蓮水提物，可以降低股四頭肌中MDA的含量，具有防止肌肉疲勞的作用[28]。該研究大鼠皮膚涂抹火龍果水提物后其表面光滑柔軟且觸感較為細致，在第23天和第30天時皮膚含水量分別顯著高于對照56.8%和30.5%，表明水提物對大鼠皮膚的水和作用有幫助。目前多數(shù)學者認為，機體發(fā)生膜質過氧化會導致新陳代謝失常及免疫力降低，而發(fā)生膜質過氧化主要是由于機體內活性氧大量生成，體內抗氧化系統(tǒng)與之失調[25]所致。自由基-氧化應激是導致皮膚衰老的重要原因，當活性氧含量超過機體自身抗氧化系統(tǒng)所能平衡的范圍后就會導致抗氧化系統(tǒng)失調并破壞細胞膜的完整結構，引發(fā)細胞凋亡等結果[29]。MDA的含量可反應體內膜質過氧化的程度，SOD是對抗活性氧的酶之一，抑制MDA含量，增強SOD活性，從而清除多余的氧自由基，使機體內氧化與抗氧化處于動態(tài)平衡狀態(tài)。研究結果表明，給藥處理30 d后大鼠MDA含量較對照顯著降低69.7%，SOD活性較對照提升20.6%，表明，涂抹火龍果水提物能提升大鼠皮膚的抗氧化能力。

4 結論

急性經皮毒性試驗、單次皮膚刺激性試驗和多次皮膚刺激性試驗的個別大鼠皮膚形成局部紅斑，但均未出現(xiàn)水腫，總體評分顯示火龍果水提物對大鼠皮膚無刺激性；連續(xù)給藥30 d，火龍果水提物可顯著提高大鼠背部皮膚含水量，顯著降低大鼠皮膚組織的MDA含量并可提高SOD活性；火龍果水提物對大鼠皮膚無刺激作用，且有一定的抗氧化作用。