威寧短柱油茶MKK3基因克隆及生物信息學(xué)分析

鄭慶梅， 徐嘉娟， 楊 冰， 霍 達(dá)， 朱亞艷， 許 杰， 王 港*

(1.赤水市木司國(guó)有林場(chǎng)， 貴州 赤水 564700； 2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院， 貴州 貴陽(yáng) 550005)

0 引言

【研究意義】威寧短柱油茶(CamelliasaluenensisStapf.)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)的常綠灌木或小喬木[1-3]。其株形緊湊，樹姿優(yōu)美，花色艷麗，可作為園林觀賞樹種；同時(shí)，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄，抗逆性強(qiáng)，出籽率高，種仁含油率高，油質(zhì)優(yōu)等特性，是優(yōu)良的木本食用油料樹種。因此，威寧短柱油茶具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是支撐貴州省西部高寒山區(qū)林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)良樹種之一。對(duì)其在長(zhǎng)期適應(yīng)高寒山區(qū)環(huán)境過程中形成的抗逆機(jī)制進(jìn)行研究，有利于用基因工程技術(shù)手段改善油茶的抗性和適應(yīng)性。對(duì)威寧短柱油茶MAPKK基因家族成員進(jìn)行分離克隆，可為進(jìn)一步研究威寧短柱油茶該基因家族的功能、挖掘威寧短柱油茶抗逆相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】外界環(huán)境脅迫下，植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級(jí)聯(lián)途徑、Ca2+依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Ca2+依賴的鹽過敏感信號(hào)通路和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路4種類型[4-5]。MAPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在真核生物中高度保守[6]。MAPK級(jí)聯(lián)途徑由絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK/MEKK)-絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK/MEK/MKK)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3種功能上連續(xù)作用的蛋白激酶組成[7-9]，MAPKKK位于整個(gè)反應(yīng)的上游，可受Ras、Rho等信號(hào)激活，進(jìn)而通過磷酸化下游的MAPKK將信號(hào)傳遞，被激活的MAPKK同樣磷酸化并激活下游的MAPK，從而完成信號(hào)的傳遞，調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫響應(yīng)[6,9-12]。已有研究表明，植物中MAPK在生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫響應(yīng)、激素信號(hào)傳導(dǎo)及防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。YDA-MKK4/MK5-MPK3/MPK6級(jí)聯(lián)在RGF1-RGI配體-受體對(duì)的下游和PLT1/PLT2的上游發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)擬南芥中的干細(xì)胞數(shù)量和初生根生長(zhǎng)[13]；MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級(jí)聯(lián)在調(diào)控植物側(cè)根形成過程中具有關(guān)鍵作用[14]；OsMKK10-OsMKK4-OsMAPK6信號(hào)通路正調(diào)控水稻的粒徑和重量[15]；ZmMKK4是植物耐鹽耐寒性的正向調(diào)節(jié)因子[7,16]；擬南芥AtMEKK1-MKK2-MPK4/6級(jí)聯(lián)通路可提高鹽脅迫耐受性[17]；過表達(dá)玉米ZmMKK1基因可提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫脅迫的抗性[17]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)威寧短柱油茶的研究主要集中在生物學(xué)特性、資源分布、良種選育、栽培技術(shù)等方面，對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究尚少，不能充分挖掘其資源優(yōu)勢(shì)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆分離威寧短柱油茶MAPKK基因家族相關(guān)基因，獲取MKK3基因全長(zhǎng)cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為今后開展該基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料于2020年3月采自貴州省畢節(jié)市威寧彝族回族苗族自治縣花果山油茶示范基地。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的威寧短柱油茶植株，采集盛花期無(wú)病蟲害、發(fā)育正常的花蕾，取樣后立即液氮速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因克隆

取威寧短柱油茶花蕾，利用RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)前期試驗(yàn)得到的威寧短柱油茶MKK3基因序列，利用Primer 6.0設(shè)計(jì)特異性引物，正向引物5′TTAGTGGAGCTGTTAAGATGGT3′，反向引物5′ACAAAGGTCCCTTGGATGAG3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件(表1)對(duì)獲得的威寧短柱油茶MKK3基因編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析。

表1 生物信息學(xué)分析軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 威寧短柱油茶MKK3基因的克隆及序列

以威寧短柱油茶花蕾RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得威寧短柱油茶MKK3基因cDNA序列全長(zhǎng)2 219 bp(圖1)。根據(jù)NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(圖2)，該基因編碼的蛋白含有1個(gè)MAPKK保守結(jié)構(gòu)域，因此，推測(cè)該基因?qū)儆贛APKK基因家族，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與茶(Camelliasinensis)、木薯(Manihotesculenta)和橡膠樹(Heveabrasiliensis)的mitogen-activated protein kinase kinase 3(MKK3)基因具有較高的相似性，相似度分別為99.23%、89.00%和88.80%，將其命名為CsMKK3。

2.2 威寧短柱油茶MKK3蛋白的基本理化性質(zhì)

根據(jù)NCBI的ORFfinder預(yù)測(cè)結(jié)果，CsMKK3基因包含1個(gè)1 557 bp的開放閱讀框，以ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子，位于398～1 954 bp，編碼518個(gè)氨基酸。利用ExPasy Prot Param對(duì)編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析表明，蛋白的相對(duì)分子量為57 524.61 Da，理論等電點(diǎn)為5.44，氨基酸組成中亮氨酸(Leu)含量最高，為10%，酸性氨基酸殘基(Asp, Glu)63個(gè)，堿性氨基酸殘基(Arg, Lys)48個(gè)，親水性平均值為-0.162，不穩(wěn)定指數(shù)42.83，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 威寧短柱油茶MKK3蛋白的親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽

由圖3可見，CsMKK3蛋白第71位氨基酸殘基的親水性最強(qiáng)，親水性值為-2.60，第269位氨基酸殘基的疏水性最強(qiáng)，親水性值為2.044。蛋白質(zhì)親水區(qū)域多于疏水區(qū)域。因此，推測(cè)CsMKK3蛋白為親水性蛋白。對(duì)CsMKK3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽進(jìn)行分析表明(圖4～5)，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，屬于非分泌型蛋白。

2.4 威寧短柱油茶MKK3蛋白的亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)

對(duì)CsMKK3蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于細(xì)胞核。由圖6可見，對(duì)CsMKK3蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在63個(gè)特異性激酶位點(diǎn)，包括28個(gè)絲氨酸(S)磷酸化位點(diǎn)、15個(gè)蘇氨酸(T)磷酸化位點(diǎn)、10個(gè)酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)植物蛋白激酶分組，CsMKK3蛋白特異性激酶有AGC組的以cAMP(環(huán)腺苷酸)依賴的蛋白激酶PKA、cGMP(環(huán)鳥苷酸)依賴的蛋白酶PKG、鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC及蛋白激酶B(PKB)等14種；屬于CMGG組的p38MAPK、cdc2、GSK3和cdk5等。

2.5 威寧短柱油茶MKK3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)

經(jīng)SOPMA分析表明(圖7)，α螺旋(Alpha helix)和無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)是CsMKK3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分，均占比38.42%，另外伴有17.37%的延伸鏈(Extended strand)和5.79%的β轉(zhuǎn)角(Beta turn)。利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)威寧短柱油茶CsMKK3的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖8)，該蛋白的主要空間結(jié)構(gòu)由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.6 威寧短柱油茶MKK3蛋白的互作關(guān)系

對(duì)CsMKK3蛋白與相關(guān)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析表明(圖9)，CsMKK3蛋白與MAPK蛋白激酶家族的MPK2、MPK14、MPK1、MPK8、MPK5、MPK7、MPK6等蛋白存在相互作用，這些蛋白均為MAPK級(jí)聯(lián)途徑中被MAPKK激活的下游蛋白激酶。MKK處于MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑中間位置，而其在MAPK相關(guān)基因家族中基因數(shù)目最少，可以與多個(gè)MAPK反應(yīng)，從而形成多個(gè)準(zhǔn)確、特定的信號(hào)通路。

2.7 威寧短柱油茶MKK3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化

由圖10可見，威寧短柱油茶CsMKK3和茶MKK3(Camelliasinensis, XP_028069657.1)的遺傳距離最近，聚類為同一小支，而后與洋薊MKK3(Cynaracardunculusvar. Scolymus, XP_024981482.1)和小蓬草MKK3(Erigeroncanadensis, XP_043632042.1)以及河岸葡萄MKK3(Vitisriparia, XP_034707953.1)聚類為一大類。大戟科的3種植物聚為一類，薔薇科的4種植物聚為一類，錦葵科的4種植物和錦葵目木棉科的榴蓮聚為一類，十字花科的擬南芥單獨(dú)聚為一類且與其他科植物的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明MKK3基因具有較高的保守性。

3 討論

植物在進(jìn)化過程及整個(gè)生命周期中，特別是對(duì)不利條件的抵御，形成了復(fù)雜有效的防御機(jī)制，并在分子水平、細(xì)胞水平和生理水平等方面對(duì)各種信號(hào)作出響應(yīng)，從而維持正常的生長(zhǎng)和發(fā)育[9,18]。MAPK級(jí)聯(lián)是抗逆途徑的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，在植物對(duì)各種生物和非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。MEKK1-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級(jí)聯(lián)在擬南芥免疫信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用，賦予擬南芥對(duì)細(xì)菌和真菌病原體的抗性[18]；MAPKKK18-MAPKK3-MAPK1/2/7/13/14參與擬南芥干旱脅迫調(diào)控[19]；過表達(dá)ZmMKK3的轉(zhuǎn)基因煙草植株抗氧化能力明顯改善[20]。MAPKK(MKK)位于MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的中心位置，是接受上游信號(hào)刺激并激活下游信號(hào)的樞紐，已有研究表明，擬南芥中有10個(gè)MKK基因，水稻中有8個(gè)MKK基因，玉米中有9個(gè)MKK基因[9,11-12,18]。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，CsMKK3蛋白定位于細(xì)胞核，而茶CsMAPKK3和玉米ZmMKK3均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[21]。研究表明，MAPKK在細(xì)胞的各亞細(xì)胞區(qū)域均有分布，玉米ZmMKK4、擬南芥AtMKK9定位于細(xì)胞核中發(fā)揮功能，擬南芥AtMKK4在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，油菜(Brassicanapus) BnMKK2、BnMKK3和BnMKK4同時(shí)存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，擬南芥AtMKK7和AtMKK9在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有分布[17]。CsMKK3蛋白不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非分泌蛋白，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsMKK3蛋白與茶MKK3和木薯MKK3蛋白的相似性分別為99.23%和89.00%，結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CsMKK3蛋白包含1個(gè)MAPKK保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其屬于MAPKK家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，威寧短柱油茶CsMKK3與茶MKK3遺傳距離最近，與洋薊、小蓬草和河岸葡萄聚在一大類，而與其他植物遺傳距離較遠(yuǎn)，總體上不同植物MKK3蛋白的聚類與植物系統(tǒng)分類相一致。蛋白互作分析表明，MKK3與MPK2、MPK7及MPK14等相互作用從而參與信號(hào)傳導(dǎo)。

磷酸化是植物體內(nèi)常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程參與植物溫度脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、養(yǎng)分脅迫和激素調(diào)控等代謝和生理途徑[22]。MAPKKK、MAPKK(MKK)及MAPK組成的MAPK級(jí)聯(lián)通過逐級(jí)的磷酸化完成信號(hào)傳遞，對(duì)威寧短柱油茶MKK3基因磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析為其功能研究提供參考。

4 結(jié)論

研究從威寧短柱油茶花蕾中克隆獲得1個(gè)MAPKK基因(CsMKK3)，ORF長(zhǎng)1 557 bp，編碼518個(gè)氨基酸，蛋白的相對(duì)分子量為57 524.61 Da，理論等電點(diǎn)5.44，是無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的不穩(wěn)定蛋白，亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、蛋白互作等預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化分析均表明其符合MAPKK基因家族特征。對(duì)威寧短柱油茶MKK3基因的克隆分離及生物信息學(xué)分析，可為進(jìn)一步研究其功能及深入挖掘威寧短柱油茶抗逆相關(guān)基因提供參考。