保山香料煙功能組分的提取分離與應(yīng)用

蔣美紅，李 仙， 弓新國(guó)， 吳長(zhǎng)偉， 黃志強(qiáng)， 吳明美， 普興偉， 張 勃， 鄭 琳

(云南斯莫特生物技術(shù)有限公司， 云南 昆明 650106)

0 引言

【研究意義】近年來(lái)，煙草制品的發(fā)展環(huán)境發(fā)生了重大而深刻變化，煙草制品結(jié)構(gòu)正朝著多樣化和無(wú)煙化的方向調(diào)整[1-4]。近十年，新型煙草在歐、美、日等發(fā)達(dá)國(guó)家迅速崛起并發(fā)展，國(guó)際煙草業(yè)巨頭紛紛進(jìn)入新型煙草市場(chǎng)[5-6]。在我國(guó)，新型煙草制品同樣取得了快速發(fā)展。但由于新型煙草制品不直接參與燃燒，卷煙的抽吸感受遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)卷煙，存在煙味變淡、香氣減弱、卷煙產(chǎn)品失去原有風(fēng)格等品質(zhì)缺陷。因此，提高煙氣濃度和香味、提升口感、彰顯風(fēng)格成為卷煙工作者亟待解決的問(wèn)題。香料煙(Oriental tabacco)是生產(chǎn)混合型卷煙的重要原料，云南保山的香料煙品質(zhì)優(yōu)良，僅次于希臘、土耳其的香料煙，充分挖掘其功能組分在新型煙草中的應(yīng)用意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國(guó)香料煙生產(chǎn)開(kāi)發(fā)趨于種植規(guī)模化和加工產(chǎn)業(yè)化，理論和應(yīng)用技術(shù)研究不斷深入，煙葉質(zhì)量顯著提高，部分指標(biāo)已接近或達(dá)到國(guó)際優(yōu)質(zhì)煙水平[7]。趙銘欽等[8-10]研究了香料煙浸膏提取的工藝條件，并分析其在混合型和烤煙型卷煙中的應(yīng)用效果以及在香料煙浸膏中檢測(cè)出包括脂肪酸類、酯類、氮硫雜環(huán)類和醛類共21種香氣成分?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于香料煙提取物作為煙用香料的研究主要集中在烤煙型和混合型卷煙中，鮮見(jiàn)其用于新型煙草的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以保山香料煙為原料，通過(guò)超聲波輔助萃取，采用響應(yīng)面進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)化獲得粗提物，再利用膜分離得到高品質(zhì)功能組分，研究其應(yīng)用于新型煙草的作用效果，為保山香料煙開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙葉 保山香料煙選自2019年云南保山市的一類煙葉。

1.1.2 試劑 95%乙醇(工業(yè)級(jí)，市售)；石油醚(工業(yè)級(jí)，市售)；無(wú)水硫酸鈉(AR，廣東汕頭市西隴化工廠)；二氯甲烷(AR，天津市博迪化工有限公司)。

1.1.3 儀器 超聲波萃取裝置(濟(jì)寧奧超電子設(shè)備有限公司)，AB204-S型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，ZNHW型電熱套(鞏義市英峪予華儀器廠)，自制抽濾裝置；SHZ-1型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪豫華儀器廠)，LABOROTA-4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)HEIDOLPH公司)，YP2001N型電子天平(0.1 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，KBF240恒溫恒濕箱(德國(guó)BINDER公司)，TG/DSC1型熱重/差熱綜合熱分析儀(瑞士Mettler Toledo公司)，Agilent 7890A/5975c氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó) Agilent公司)，Pyroprobe 5250T型熱裂解儀(美國(guó)CDS公司)，GERSTEL冷進(jìn)樣系統(tǒng)(德國(guó)GERSTEL公司)，防爆型超濾試驗(yàn)機(jī)(1812型，北京清大漠科膜技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 保山香料煙初提物制備 保山香料煙粉碎后置于圓底燒瓶中，加入一定濃度的乙醇，超聲提取，收集提取液；殘?jiān)糠植捎孟嗤姆椒ㄔ俅翁崛?，收集?次提取液，合并2次提取液過(guò)濾，濾液減壓濃縮，即得初提物。

1.2.2 初提物制備工藝優(yōu)化 按照1.2.1方法，運(yùn)用 Design Export中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]，選取乙醇提取濃度A(50%、70%和95%)、提取溫度B(40℃、50℃和60℃)和提取時(shí)間C(30 min、45 min和60 min)3個(gè)因素，以感官評(píng)價(jià)分值為響應(yīng)值，進(jìn)一步考察不同提取因素對(duì)初提物品質(zhì)的影響，確定最佳工藝條件。

以感官得分(Y)為指標(biāo)，以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)為因素，按照響應(yīng)面法的Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)方案進(jìn)行3因素3水平15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)，15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中包括12個(gè)析因點(diǎn)(1～12)及3個(gè)中心點(diǎn)(13～15)，中心點(diǎn)重復(fù)的目的是估計(jì)純?cè)囼?yàn)誤差，以感官分值Y作為響應(yīng)面分析的響應(yīng)值[11-12]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 功能組分的分離純化 將初提物稀釋30倍后充分?jǐn)嚢瑁鋬龇蛛x后抽濾，濾液進(jìn)行膜分離，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整溫度、操作壓力等參數(shù)。

1.2.4 常規(guī)化學(xué)成分含量測(cè)定 提取物中的總糖及還原糖、總植物堿、總氮、淀粉、蛋白質(zhì)含量按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)參考《煙草及煙草制品水溶性糖的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》(YC/T 159—2002)、《煙草及煙草制品總植物堿的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》(YC/T 160—2002)、《煙草及煙草制品總氮的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》(YC/T 161—2002)、《煙草及煙草制品淀粉的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》(YC/T 216—2007)、《煙草及煙草制品蛋白質(zhì)的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》(YC/T 249—2008)利用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.2.5 致香成分檢測(cè) 致香成分按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)參考《煙草及煙草制品致香成分的測(cè)定同時(shí)蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法》(TCJC-ZY-Ⅳ-014-2012)利用氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

GC-MS分析測(cè)試條件：色譜柱HP-5MS(60 m×0.132 mm×0.125 μm)，載氣為He，流速1 mL/min，進(jìn)樣溫度240℃，接口溫度250℃，質(zhì)譜掃描范圍35～455 m/z，離子源為EI源，電子能量70 eV。按此分析測(cè)試條件，對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，各化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定為面積歸一化法?；衔锒ㄐ苑治鍪歉鶕?jù)GC-MS聯(lián)用所得質(zhì)譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)用Wiley、NISt 98譜庫(kù)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、解析，確認(rèn)其中的化學(xué)成分。

1.2.6 熱重分析方法 樣品分析前，設(shè)置熱重分析儀在800℃條件下保持10 min，以排凈爐體內(nèi)雜質(zhì)。熱天平靈敏度為 1 μg，以空坩堝為參比物。稱取(5.00±0.05)mg典型加熱不燃燒卷煙煙草材料置于熱重鉑坩堝內(nèi)，在 80 mL/min空氣流量下，升溫程序以10℃/min速率由30℃升至800℃后保持10 min。

1.2.7 熱裂解試驗(yàn)條件及分析方法

1) GC-MS條件。利用GC/MS，設(shè)置色譜質(zhì)譜條件：毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度240℃；載氣為He；流速1 mL/min；GC-MS接口溫度250℃；升溫梯度為50℃保持1 min后以2℃/min速度升至100℃保持1 min，然后以8℃/min速度升至260℃保持5 min；離子源為EI源；電子能量為70 eV；掃描范圍35～455 m/z；標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)為NIST、WILEY譜庫(kù)。

2) 熱裂解條件。新型煙草電加熱溫度低于350℃，因此試驗(yàn)在50～350℃進(jìn)行熱裂解研究。利用PYROPROBE 2000，設(shè)置條件：初始溫度30℃，升溫速率20.00℃/ms，裂解溫度350℃，持續(xù)時(shí)間10 s，裂解氛圍為10%氧氣、大氣環(huán)境或氮?dú)?氣體流量：2.5 mL/s)。

3) 固相微萃取條件。當(dāng)香原料與添加劑、對(duì)照(空白，無(wú)添加劑)在大氣環(huán)境中進(jìn)行熱裂解時(shí)，采用黑色萃取頭從自行設(shè)計(jì)的裂解瓶中對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為10 min、溫度為70℃，然后將SPME進(jìn)樣針頭插入氣相色譜高溫汽化室中進(jìn)行解吸附，時(shí)間為2 min。

4) 熱裂解試驗(yàn)方法。稱取約2 mg樣品加入裂解專用石英管中，然后將石英管置于熱裂解儀的加熱絲中，在不同裂解氛圍中的350℃下進(jìn)行熱裂解，固相微萃取頭置于自行設(shè)計(jì)的裂解瓶中對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行萃取，時(shí)間為10 min、溫度為70℃，之后將SPME進(jìn)樣針插在氣相色譜的高溫汽化室中進(jìn)行解吸附，時(shí)間為2 min，裂解產(chǎn)物進(jìn)入氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)進(jìn)行分離與鑒定，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，若不特別說(shuō)明裂解產(chǎn)物的匹配度均大于60。

2 結(jié)果與分析

2.1 初提物制備工藝優(yōu)化

2.1.1 最佳萃取條件 運(yùn)用Design Expert 8.0.6對(duì)表2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及感官得分進(jìn)行多元回歸擬合，得感官分值與各因素的二次多項(xiàng)式回歸模型：

Y=-1.30+0.64A+2.48B-0.25C-5.56×10-3AB+5.19×10-3AC+8.33×10-3BC-4.40×10-3A2-2.22×10-2B2-5.44×10-3C2

由圖1可知，該二次回歸方程模型極顯著(P=0.0004<0.01)，同時(shí)模型的決定系數(shù)為0.961 1，表明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。在選取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)結(jié)果的影響為提取溫度(B)>乙醇濃度(A)>提取時(shí)間(C)。一次項(xiàng)A(P=0.0140<0.05)、B(P=0.0002<0.01)和C(P=0.0449<0.05)差異顯著或極顯著，說(shuō)明乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)保山香料煙初提物感官分值有顯著影響，提取溫度有極顯著影響。二次項(xiàng)A2、B2和C2均達(dá)顯著或極顯著水平，說(shuō)明提取溫度、乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)感官分值的影響不是線性關(guān)系。AC交互項(xiàng)差異極顯著(P<0.01)，AB、BC交互項(xiàng)差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明3個(gè)因素的交互作用對(duì)保山香料煙初提物感官分值有顯著影響。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的感官得分

2.1.2 最佳萃取條件 通過(guò)Design Expert 8.0.6對(duì)回歸方程求解，在試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)預(yù)測(cè)超聲波萃取的最佳條件為乙醇濃度67.44%、提取溫度57.11℃、提取時(shí)間52.64 min。為方便生產(chǎn)操作，將微波萃取的最佳條件修正為乙醇濃度65%、提取溫度55℃、提取時(shí)間55 min。采用優(yōu)化后的最佳提取工藝：樣品粉碎后置于圓底燒瓶中，加入8倍65%乙醇，在55℃條件下用超聲提取55 min，收集第1次濾液，殘?jiān)糠植捎孟嗤姆椒ㄔ俅翁崛?，收集?次提取液，合并濾液后提取率為45.61%。

2.2 功能組分的分離純化

經(jīng)多次試驗(yàn)考察，采用分子量為10 000～30 000超濾膜、3 000～5 000超濾膜，在室溫、操作壓力為0.16～0.18 MPa條件下進(jìn)行分離精制，將分離物減壓濃縮至密度指標(biāo)為1.250 0±0.008半流體。由表3可見(jiàn)，通過(guò)膜分離后的提取物得率有所降低，嗅香略有改變。經(jīng)過(guò)分子量為3 000～5 000超濾膜分離后，初提物品質(zhì)有明顯改善，應(yīng)用于新型煙草中吸味改善明顯，刺激性略有，煙香豐富性提升。因此，選擇分子量為3 000～5 000超濾膜進(jìn)行分離，得到保山香料煙功能組分。

表3 保山香料煙初提物與膜分離精制物收率、外觀、嗅香及感官評(píng)吸

2.3 功能組分的應(yīng)用

2.3.1 常規(guī)化學(xué)成分 由表4看出，經(jīng)過(guò)膜分離后，各成分含量均有不同程度的變化，功能組分的總糖、淀粉和蛋白質(zhì)較初提物降低，分別降低16.07%、20.83%和43.64%，而還原糖、煙堿和總氮變化較小，經(jīng)過(guò)膜分離后仍保留。

表4 保山香料煙初提物及功能組分的常規(guī)化學(xué)成分

2.3.2 致香成分 由圖2可見(jiàn)，初提物及功能組分致香成分對(duì)比，通過(guò)膜分離后美拉德反應(yīng)物含量增加，苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、類西柏烷類降解產(chǎn)物和類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物變化較小，新植二烯略有降低?？傮w來(lái)說(shuō)，通過(guò)膜分離后較好地保留了提取物中的功能性成分。

2.3.3 新型煙草中的熱重 由圖3可知，添加功能組分的樣品與對(duì)照相同，熱失重均分為4個(gè)階段，且熱失重較大的均在第2、第3階段，在第2失重階段，失重比較劇烈，DTG曲線上有較大峰；在第3失重階段，失重最為劇烈，DTG曲線上呈大的尖峰。對(duì)照在第1階段失重溫度區(qū)間為50～237℃，添加了功能組分的樣品為100～210℃，從第2階段起添加功能組分的樣品熱失重溫度較對(duì)照有所提前，且加入功能組分的樣品在第2、第3階段熱失重比達(dá)65%，而對(duì)照為54%。說(shuō)明，加入功能組分后能改變新型煙草煙氣生成狀態(tài)，主要的熱失重集中于新型煙草加熱溫度區(qū)間，有利于提升吸食舒適性。

2.3.4 新型煙草中的熱裂解 由圖4可見(jiàn)，由于裂解溫度較低，檢測(cè)物質(zhì)相對(duì)較少，其中對(duì)照共檢測(cè)出20種物質(zhì)，主要為糠醛(18.24%)、5-甲基-2-糠醛(6.33%)、煙堿(5.96%)等；添加功能組分的樣品共檢測(cè)出34種物質(zhì)，主要為糠醛(12.94%)、煙堿(9.21%)、5-甲基-2-糠醛(6.77%)、4-環(huán)戊烯-1,3-二酮(5.21%)。可見(jiàn)，加入功能組分能增加新型煙草煙氣豐富性，從而提高其感官品質(zhì)。

3 討論

采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定最佳提取工藝已有廣泛的研究報(bào)道[11-12]，而對(duì)最佳工藝得到的成分進(jìn)行膜分離精制尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究為便于對(duì)比分析，依據(jù)中性香氣物質(zhì)的前體物特征，將經(jīng)過(guò)膜分離后的香氣物質(zhì)中主要的香氣成分分為美拉德反應(yīng)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、類西柏烷類降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物和新植二烯共五大類[13]。該研究分析發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)物含量有增加，美拉德(Maillard)反應(yīng)是烤煙香氣成分形成的重要過(guò)程之一。在煙葉調(diào)制過(guò)程中，氨基酸可直接與糖類物質(zhì)發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)，形成特有濃郁香氣的阿馬杜里(Amadori)化合物，該反應(yīng)產(chǎn)物是構(gòu)成加工食品和煙草等香味成分的重要來(lái)源。苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物及類西柏烷類降解產(chǎn)物變化小，煙草中苯丙氨酸類致香物質(zhì)能產(chǎn)生典型的杏仁香、櫻桃香、甜香、玫瑰花香、醇香等清爽香氣，是煙草中含量較豐富的香味成分。類胡蘿卜素致香物質(zhì)是構(gòu)成煙葉香氣質(zhì)量的重要組分，其中，巨豆三烯酮、β-大馬酮、法尼基丙酮等物質(zhì)含量較大，是形成烤煙細(xì)膩、高雅和清香的主要成分，其產(chǎn)生的香味閾值相對(duì)較低，對(duì)煙葉香氣質(zhì)量的貢獻(xiàn)率大。類西柏烷類致香物質(zhì)主要存在于煙葉的角質(zhì)層上，是煙葉腺毛分泌物的主要成分，以茄酮及其衍生物為主。茄酮具有香氣，而且可轉(zhuǎn)化為茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等香味物質(zhì)[14]。將功能組分應(yīng)用于新型煙草后進(jìn)行熱失重和熱裂解分析發(fā)現(xiàn)，加入功能組分能改變新型煙草煙氣生成狀態(tài)，在低溫條件下熱裂解產(chǎn)物增多，這也與感官評(píng)吸的吸味改善明顯、煙香豐富性提升相吻合。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定保山香料煙最佳提取工藝以及膜分離最佳工藝參數(shù)，產(chǎn)品得率為37.64%，將膜分離精制得到的功能組分應(yīng)用于新型煙草中能明顯改善吸味，提升煙香豐富性；分離精制后的功能組分總糖、蛋白質(zhì)和淀粉含量大幅下降，煙堿、還原糖和總氮變化較小，主要致香物質(zhì)得到較好保留；加入功能組分后能改變新型煙草煙氣生成狀態(tài)，主要的熱失重集中于新型煙草加熱溫度區(qū)間，有利于提升吸食舒適性；加入功能組分能明顯增加新型煙草煙氣豐富性。該提取分離工藝可從保山香料煙中獲取能改善新型煙草吸食效果的功能組分。