化濁解毒方對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、HGF蛋白及其mRNA表達(dá)的影響

李宗濤，魏宏宇，劉豐睿，魏 曼，高 卉，馮 忖，魏曉娜

(1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 石家莊 050091； 2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是由于各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)或功能破壞，主要表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率下降、代謝產(chǎn)物潴留、水-電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)、全身各系統(tǒng)受累等。目前，CRF的治療原則主要以積極治療原發(fā)病，避免和糾正CRF進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，防治并發(fā)癥以及進(jìn)行血液凈化為主[1]。CRF患者的腎臟病變呈進(jìn)行性發(fā)展，多為不可逆。中醫(yī)藥在治療CRF方面具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和明顯的療效，表現(xiàn)在患者臨床癥狀明顯改善、尿蛋白含量減少、腎功能惡化延緩[2]。隨著對(duì)慢性腎臟病的不斷認(rèn)識(shí)，國(guó)醫(yī)大師李佃貴提出從“濁毒”論治CRF并取得一定效果。

“濁毒”既是一種致病因素，同時(shí)也是一種蘊(yùn)積于體內(nèi)的病理產(chǎn)物[3]。濁屬陰邪，濁邪多易阻滯脈絡(luò)，壅塞氣機(jī)；毒屬陽(yáng)邪，性烈善變，易損害氣血營(yíng)衛(wèi)。濁、毒兩者常相互膠結(jié)致病，故?！皾岫尽辈⒎Q。CRF的發(fā)病原因復(fù)雜，病程綿長(zhǎng)，病邪作用于人體，極易發(fā)展為濁毒內(nèi)壅，故臨床治療時(shí)當(dāng)以“濁毒”論治[4]。本課題組以李佃貴的“濁毒”理論為指導(dǎo)，確立了化濁解毒法治療CRF的方案，總結(jié)出具有健脾補(bǔ)腎、化濁解毒功效的化濁解毒方(基礎(chǔ)方)：黃芪、炒白術(shù)、積雪草、土茯苓、水蛭、莪術(shù)、石見穿、萆薢、酒大黃、水牛角。本方可改善患者臨床癥狀，減少尿蛋白，延緩腎功能衰竭進(jìn)展并有效提高患者生存質(zhì)量，但其作用機(jī)制尚不明確，故本研究采用5/6腎切除法復(fù)制CRF大鼠模型，探究化濁解毒方治療CRF的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量約180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房(相對(duì)濕度50%～70%，溫度23～25 ℃，晝夜各半)。本實(shí)驗(yàn)由河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，倫理審查編號(hào)為DWLL2021118。

1.2 主要試劑 抗Actin抗體(批號(hào) GB12001)、抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抗體(批號(hào) GB111876)、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(批號(hào) GB111364)、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào) G2026)、RNA提取液(批號(hào) G3013)、Servicebio?RT First Strand cDNA分析試劑盒(批號(hào) G3330)、2×SYBR Green qPCR反應(yīng)混合物(無ROX)(批號(hào) G3320)、PCR引物：武漢賽維爾生物科技有限公司；抗肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)抗體(批號(hào) A1193)：ABclonal。

1.3 主要儀器 低溫型研磨儀(型號(hào) KZ-Ⅲ-FP)：武漢賽維爾生物科技有限公司；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(型號(hào) D3024R)：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司；熒光定量PCR儀(CFX)：美國(guó)Bio-rad。

1.4 藥物 化濁解毒方(黃芪、積雪草各30 g，土茯苓20 g，炒白術(shù)、莪術(shù)、石見穿、萆薢、水牛角各15 g，酒大黃9 g，水蛭3 g)智能配方顆粒：廣州一方藥業(yè)集團(tuán)有限公司；尿毒清顆粒(批號(hào) 20210404，每袋5 g)：康臣藥業(yè)有限責(zé)任公司；氯沙坦鉀(每片50 mg，批號(hào) T030149)：杭州默沙東制藥有限公司。

2 方法

2.1 CRF大鼠模型復(fù)制與分組 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取12只作為對(duì)照組，其余大鼠作為手術(shù)組。采用5/6腎切除法[5]復(fù)制CRF模型，在10%水合氯醛麻醉下分兩次手術(shù)共切除5/6腎組織。術(shù)后2周，從手術(shù)組、對(duì)照組各隨機(jī)抽取3只大鼠，檢測(cè)血清肌酐(serum creatinine, SCr)，以SCr>53.93 μmol/L[6]作為模型復(fù)制成功的依據(jù)。隨后將手術(shù)組隨機(jī)分為化濁解毒組(11只)、尿毒清組(11只)、氯沙坦鉀組(11只)、模型組(12只)。

2.2 給藥方法 按照大鼠用藥劑量是70 kg成人臨床用藥劑量6.3倍的換算系數(shù)[7]，化濁解毒組、尿毒清組的用藥劑量分別為2.35、2.63 g/(kg·d)，氯沙坦鉀組的用藥劑量為5.25 mg/(kg·d)；對(duì)照組及模型組給予等量純凈水。連續(xù)灌胃給藥12周。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 大鼠一般情況 觀察各組大鼠的活動(dòng)情況、精神狀況、攝食量和飲水量、皮毛狀態(tài)、尿量、死亡數(shù)量等，并記錄體質(zhì)量變化。

2.3.2 取材 給藥12周后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈采血6～8 mL，置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于4 ℃冰箱中保存，用于測(cè)定腎功能。采血后采用頸椎脫臼法處死大鼠，并盡快取出腎臟組織。

2.3.3 腎功能檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠SCr、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

2.3.4 腎組織形態(tài)學(xué)變化 將腎組織用4%多聚甲醛固定液充分浸泡48 h，取出，沖洗，用不同梯度的乙醇進(jìn)行脫水處理，在二甲苯中透明，浸蠟，石蠟包埋固定，用切片機(jī)切成2 μm左右厚度的薄片，梯度乙醇脫水，用中性樹膠封片，蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3.5 RT-PCR法檢測(cè)腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達(dá)水平 提取各組大鼠腎臟組織總RNA，稀釋成相同濃度，以GAPDH為內(nèi)參；以特異性引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。程序：42℃ 15 min，85 ℃ 5 s，以cDNA為模板擴(kuò)增基因片段；95 ℃ 10 min預(yù)變性，后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列(5′→3′)：GAPDH 上游引物為CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG，下游引物為GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT；HGF上游引物為CTCCTGCTTCCTGTCACCATC，下游引物為TTTCTGATGCACCTGTTGGC；TGF-β1上游引物為CACTCCCGTGGCTTCTAGTG，下游引物為CATAGATTGCGTTGTTGCGGT；α-SMA上游引物為ACCATCGGGAATGAACGCTT，下游引物為CTGTCAGCAATGCCTGGGTA。

2.3.6 Western blot法檢測(cè)腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA蛋白表達(dá)水平 以裂解液(使用前加入蛋白酶抑制劑)提取冰凍腎組織蛋白質(zhì)，并用BCA法測(cè)定其含量。將蛋白溶液按照4∶1的比例加入5倍還原型蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉、一抗(α-SMA、HGF、TGF-β1、Actin的稀釋比例均為1∶1 000)孵育過夜、熒光二抗(1∶3 000)孵育后，TBST清洗顯影。應(yīng)用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，并以目的蛋白與Actin灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)照組大鼠反應(yīng)敏捷，皮毛密集有光澤，精力旺盛，進(jìn)食、活動(dòng)無明顯異常，尿量正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)較其他組明顯。模型組大鼠精神不振，皮毛枯槁蓬松無光澤，進(jìn)食、活動(dòng)均減少，尿量明顯減少，體質(zhì)量降低?；瘽峤舛窘M、尿毒清組、氯沙坦鉀組大鼠反應(yīng)均較模型組靈敏，進(jìn)食及活動(dòng)量無明顯減少，尿量較模型組稍增多，體質(zhì)量均有所增加，其中化濁解毒組大鼠一般情況改善較為明顯。對(duì)照組大鼠無死亡，模型組死亡4只，化濁解毒組死亡2只，尿毒清組死亡3只，氯沙坦鉀組死亡3只。

3.2 5組大鼠SCr、BUN水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠BUN、SCr水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組BUN、SCr水平均顯著降低(P<0.05)；化濁解毒組BUN、SCr水平顯著低于氯沙坦鉀組及尿毒清組(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠SCr、BUN水平比較

3.3 5組大鼠腎組織病理變化比較 對(duì)照組大鼠腎小球與腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病理變化。模型組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)異常，異常區(qū)域內(nèi)腎小球消失，腎小管極度擴(kuò)張，內(nèi)含大量漿液樣物質(zhì)，同時(shí)上皮細(xì)胞扁平化，基底膜增厚，間質(zhì)內(nèi)膠原纖維增生伴淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。尿毒清組大鼠腎小球硬化，腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)增生伴淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。氯沙坦鉀組腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多，間質(zhì)增生，腎小管纖維化?；瘽峤舛窘M腎血管瘀血，間質(zhì)增生伴淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見腎小管纖維化。與模型組比較，尿毒清組、氯沙坦鉀組、化濁解毒組纖維化均有不同程度減輕。見圖1。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.尿毒清組；D.氯沙坦鉀組；E.化濁解毒組；示正常的腎小管和擴(kuò)張的腎小管，示正常的腎小球和肥大的腎小球，示間質(zhì)纖維化，示腎血管，示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

3.4 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒組大鼠腎組織 TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，HGF mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒方組大鼠腎組織 TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA

3.5 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組TGF-β1、HGF、α-SMA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒組腎組織TGF-β1、α-SMA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，α-SMA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒方組TGF-β1、HGF、α-SMA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

表3 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA

注：A. 對(duì)照組；B.模型組；C.尿毒清組；D.氯沙坦鉀組；E.化濁解毒組

4 討論

CRF屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“腎風(fēng)”“腎勞”“溺毒”“癃閉”和“關(guān)格”等范疇，其基本病機(jī)為“本虛標(biāo)實(shí)”[8]?！皾岫尽奔仁且环N對(duì)人體經(jīng)絡(luò)氣血臟腑陰陽(yáng)均造成損傷的致病因素，亦是蘊(yùn)積于體內(nèi)的病理產(chǎn)物。濁毒之邪重在“濁”，濁邪久蘊(yùn)，凝聚成毒，“濁”邪遷延不愈，易生變端，“毒”邪阻滯脈絡(luò)，損害氣血，兩者常相兼致病，濁毒內(nèi)蘊(yùn)，損傷機(jī)體。病情遷延不愈，傷及脾腎。腎為先天之本，脾為后天之本，腎如薪火主水，脾如鼎釜主土，“水為萬物之源，土為萬物之母，二臟安和，一身皆治，百疾不生”(《醫(yī)宗必讀·虛勞》)。脾喜燥惡濕，而濁為陰邪，其性重濁黏膩，易阻滯氣機(jī)流動(dòng)，治當(dāng)健脾化濁；濁毒之邪內(nèi)蘊(yùn)日久，陽(yáng)氣被遏，腎陽(yáng)衰微，毒邪損害機(jī)體，治當(dāng)補(bǔ)腎解毒[4]。故CRF以脾腎兩虛為本，濁毒內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo)。

化濁解毒方補(bǔ)腎健脾化濁，既固本以清源，又解毒以澄流。方中黃芪、白術(shù)補(bǔ)腎健脾、利水消腫，黃芪大補(bǔ)肺氣以益腎水之上源，兼以達(dá)表固衛(wèi)，白術(shù)健脾益氣，使脾燥濕相濟(jì)，兩者共用，固本清源。積雪草、土茯苓、萆薢、水牛角四味共用，清熱利濕、化濁解毒，腎衰日久，腎絡(luò)瘀阻，以莪術(shù)、石見穿活血化瘀，又以水蛭破血通經(jīng)、祛瘀生新；酒大黃通腑泄?jié)?，給濁毒以出路，同時(shí)活血逐瘀、推陳致新。諸藥合用，以達(dá)到緩解臨床癥狀，保護(hù)殘存腎功能，延緩CRF進(jìn)展的作用。

CRF的主要病理機(jī)制為腎臟的纖維化，包括腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。其中腎間質(zhì)纖維化與慢性腎臟病的發(fā)展與預(yù)后密切相關(guān)[9]。腎間質(zhì)纖維化可由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)、多通道信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)生，其主要病理改變?yōu)槟I臟中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量沉積，是其合成增多及降解減少共同作用的結(jié)果[10]。

TGF-β1主要在病變的腎臟組織中表達(dá)，是最重要的促纖維化因子，可促進(jìn)ECM的合成，刺激上皮細(xì)胞分化，抑制ECM降解和在受損部位自我誘生，從而產(chǎn)生瀑布效應(yīng)[11-12]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的代表性蛋白[13]，在正常腎臟組織中很少表達(dá)，然而在病理情況下，在腎小球系膜區(qū)、腎小球周圍間質(zhì)、萎縮的腎小管周圍纖維化區(qū)與血管周邊明顯表達(dá)與增生，并參與腎臟纖維化的形成[14]。實(shí)驗(yàn)[15]證明，腎小管間質(zhì)損傷常常與α-SMA表達(dá)水平呈正相關(guān)，故α-SMA的過量表達(dá)可致腎臟纖維化不斷加重。HGF是一種負(fù)性調(diào)節(jié)纖維化的因子，其不僅作用于肝細(xì)胞，也存在于多種臟器中，可作為一種親腎因子在腎臟中表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移，影響細(xì)胞的增殖與分化，最終促進(jìn)ECM降解[14,16-17]。此外，多項(xiàng)研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的特定階段，TGF-β1與HGF存在著互逆平衡的關(guān)系。即在慢性腎臟病發(fā)展的早期，TGF-β1和HGF的表達(dá)水平均上升，但HGF的表達(dá)水平升高時(shí)又會(huì)減緩TGF-β1的上升趨勢(shì)；反之，當(dāng)慢性腎臟病不斷進(jìn)展加重時(shí)，這種平衡被打破，腎臟的自我保護(hù)作用亦逐漸降低，TGF-β1不斷升高，HGF的抑制作用減弱，并不斷被TGF-β1抑制，從而降低自身表達(dá)水平。

本研究結(jié)果提示，伴隨著CRF大鼠腎臟組織中TGF-β1的增高，HGF呈逐漸下降趨勢(shì)，同時(shí)大鼠腎功能下降、腎臟纖維化程度加重，說明伴隨著HGF的表達(dá)不斷被TGF-β1抑制，其抗纖維化作用亦逐漸減弱，證明可通過促進(jìn)HGF表達(dá)、抑制TGF-β1表達(dá)從而延緩腎功能衰竭的進(jìn)展。但在CRF發(fā)展早期，TGF-β1與HGF的表達(dá)水平是否存在共同上升階段，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

總之，本實(shí)驗(yàn)提示，TGF-β1的下降及HGF的升高可使α-SMA水平減少，說明化濁解毒方可能是通過抑制CRF大鼠腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)并上調(diào)HGF的表達(dá)，從而起到抑制α-SMA表達(dá)的作用，達(dá)到改善CRF進(jìn)展的目的。