華蟾素注射液抑制小鼠黑色素瘤的作用及機(jī)制研究

劉霞霞，陳 馨，王文君，程 卉，吳 歡

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.教育部新安醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心，安徽 合肥 230038)

黑色素瘤是一種具有強(qiáng)侵襲性的皮膚腫瘤。其發(fā)病率雖低，但惡性程度高、轉(zhuǎn)移發(fā)生早、致死率高，占所有皮膚癌相關(guān)死亡病例的80%以上[1]。近年來，黑色素瘤患者不斷增加，據(jù)估計(jì)2020年黑色素瘤新增癌癥病例超過10萬例[2]。在早期，手術(shù)切除腫瘤可獲得良好的預(yù)后，然而，由于黑色素瘤的強(qiáng)侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，手術(shù)很少能延長(zhǎng)晚期患者的生存時(shí)間。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致黑色素瘤晚期患者死亡的主要原因之一。目前，針對(duì)黑色素瘤高侵襲性特點(diǎn)的藥物有限，且臨床上治療癌癥的有效化學(xué)治療藥物具有嚴(yán)重的毒性和不良反應(yīng)。因此，尋找毒性和不良反應(yīng)小且能有效抑制黑色素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物迫在眉睫。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal trans-formation，EMT)指上皮細(xì)胞通過一定的程序轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，這一過程使細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。黑色素瘤的轉(zhuǎn)移侵襲能力與EMT密切相關(guān)。EMT首先涉及細(xì)胞骨架的重組，使腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移成為可能[3]。越來越多的證據(jù)表明，在EMT期間，與細(xì)胞骨架相互作用的蛋白，如上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)下調(diào)，而間充質(zhì)標(biāo)志物，如Vimentin和神經(jīng)鈣黏蛋白(nervous cadherin,N-cadherin)表達(dá)上調(diào)[4]。此外，在EMT的最后階段，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等蛋白酶的表達(dá)使基膜和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解增加[5]。EMT過程中黑色素瘤細(xì)胞的黏附性減弱，形態(tài)更像間充質(zhì)細(xì)胞，有利于癌細(xì)胞的侵襲，向體內(nèi)不同微環(huán)境遷移，形成轉(zhuǎn)移。

華蟾素是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍干燥表皮的水煎煮提取物，具有清熱解毒、消腫止痛的功效。華蟾素注射液是華蟾素在臨床上使用較為廣泛的一種制劑，其多種有效成分在體內(nèi)可發(fā)揮作用[6]。研究[7-10]表明，華蟾素注射液對(duì)胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤有較好的抑制作用。華蟾素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、抗腫瘤血管生成、調(diào)控免疫應(yīng)答等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[11-12]，但華蟾素對(duì)黑色素瘤的作用及其機(jī)制尚未明確。因此，本研究以黑色素瘤移植瘤小鼠為研究對(duì)象，初步探討華蟾素注射液對(duì)黑色素瘤移植瘤小鼠的作用及其機(jī)制，為華蟾素注射液應(yīng)用于臨床治療黑色素瘤提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試劑與材料

1.1 細(xì)胞株 黑色素瘤細(xì)胞B16F10購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑 華蟾素注射液(批號(hào) 191204-2)：安徽華潤金蟾藥業(yè)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(GP21040160382)、抗Vimentin抗體(GB12192)：武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清(2177370)：美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液(批號(hào) 080421211018)：江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；抗Ki67抗體(ab15580)：Abcam；抗MMP-2抗體(bs-4599R)、抗MMP-9抗體(bs-0397R)：Bioss； 抗E-cadherin抗體(14472)、N-cadherin抗體(Cell Signaling Technology,14215)：美國CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0004]。小鼠經(jīng)預(yù)適應(yīng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室濕度為(55±10)%，溫度為(20±0.5)℃，明暗周期為12 h/12 h。研究方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(動(dòng)物倫理編號(hào)：AHUCM-mouse-2021062)。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱：美墨爾特貿(mào)易有限公司；-80 ℃冰箱：日本Sanyo公司；Olympus CKX41型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；BSC-1000Ⅱ A2型生物安全柜：浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；滅菌鍋：日本Hirayama公司；ZT-12M型自動(dòng)脫水機(jī)：孝感市亞光醫(yī)用電子科技有限公司；YB-7B型石蠟包埋機(jī)：孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；科力飛切片漂烘儀：安徽電子科學(xué)研究所；RM2135型Leica切片機(jī)：德國徠卡儀器有限公司；HIETECH數(shù)字切片掃描儀：濟(jì)南丹吉爾電子有限公司；165-8001 Mini-Protean Tetra型電泳儀、電泳槽：美國Bio-Rad公司；Gel View 6000 Plus凝膠成像系統(tǒng)：廣州博鷺騰生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 黑色素瘤移植瘤模型的復(fù)制 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL，每只C57BL/6小鼠右側(cè)腋下接種100 μL細(xì)胞懸液。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 模型復(fù)制后小鼠腋下注射細(xì)胞部位出現(xiàn)米粒大小的包塊表明模型復(fù)制成功，將模型復(fù)制成功后的小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組，華蟾素注射液低、中、高劑量組，每組10只。華蟾素注射液低、中、高劑量組小鼠分別被腹腔注射156、312、468 mg/mL華蟾素注射液，注射容積均為0.15 mL，連續(xù)15 d；對(duì)照組小鼠被腹腔注射0.15 mL生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中，隔日稱量小鼠體質(zhì)量1次，第16天用10%烏拉坦麻醉小鼠后，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖剝離瘤體并稱質(zhì)量。

2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察移植瘤的組織形態(tài) 取出各組固定在4%多聚甲醛磷酸緩沖液的黑色素瘤體，先用濃度梯度遞增的乙醇進(jìn)行脫水，然后用二甲苯進(jìn)行透明，最后利用石蠟對(duì)瘤體包埋后做切片，片厚為4 μm，對(duì)移植瘤組織進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察黑色素瘤移植瘤的組織形態(tài)。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平 將取出的各組黑色素瘤體的石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化處理后，再用抗原修復(fù)，之后加入3%過氧化氫溶液除去內(nèi)源性過氧化氫酶，再滴加3% BSA進(jìn)行封閉，取出，置于相應(yīng)的一抗中，于4 ℃環(huán)境下孵育過夜。二抗室溫孵育50 min后，加入DAB顯色，最后用蘇木精復(fù)染后進(jìn)行脫水封片。 采用Image J軟件測(cè)定免疫組織化學(xué)染色照片的平均光密度值，計(jì)算陽性蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將凍存在-80 ℃冰箱中的黑色素瘤組織取出，放置在冰上，取出一小部分組織，置于研磨器中，加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分研磨裂解，超聲破碎，-4 ℃離心(12 000 r/min)20 min，收集上清液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用裂解液將蛋白濃度稀釋配平至20 μg/mL，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸。用10%聚丙烯酰胺凝膠將蛋白電泳分離，冰浴，濕轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉，TBST洗膜3次，將不同蛋白區(qū)域剪開，分別加入一抗稀釋液的Vimentin(稀釋度1∶1 000)、N-cadherin(稀釋度1∶1 000)、MMP-9(稀釋度1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，用相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行條帶曝光。采用Image J軟件測(cè)定條帶的灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 4組小鼠黑色素瘤移植瘤質(zhì)量比較 與對(duì)照組比較，華蟾素注射液低、中、高劑量組小鼠黑色素瘤移植瘤質(zhì)量均顯著降低(P<0.05)，華蟾素注射液高劑量組小鼠移植瘤質(zhì)量最低。見圖1。

注：A.對(duì)照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組；與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.2 不同時(shí)點(diǎn)4組小鼠體質(zhì)量比較 小鼠腋下移植黑色素瘤細(xì)胞B16F10后第11天開始，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量逐漸降低，至移植術(shù)后第15天，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量顯著低于華蟾素注射液低、中、高劑量組；各時(shí)點(diǎn)華蟾素注射液高劑量組小鼠體質(zhì)量高于華蟾素注射液中、低劑量組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.3 華蟾素注射液對(duì)黑色素瘤移植瘤組織形態(tài)的影響 對(duì)照組小鼠移植瘤細(xì)胞具有明顯的黑色素瘤的組織形態(tài)特征，胞漿邊界清楚、呈玻璃樣，細(xì)胞核偏置，核仁突出，黑色素瘤細(xì)胞可以是多形性的，呈上皮樣、成角、小而圓；病變中黑色素細(xì)胞真皮處可形成巢，細(xì)胞密度增加。而華蟾素注射液低、中、高劑量組小鼠移植瘤中黑色素細(xì)胞形成的巢較少見，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞體積較對(duì)照組增大，細(xì)胞核深染現(xiàn)象得到緩解。見圖3。

注：A.對(duì)照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組

3.4 4組小鼠移植瘤組織中Ki-67蛋白表達(dá)水平比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞核若無染色或淡黃色則表示Ki-67蛋白低表達(dá)，若染色為黃褐色或棕色則表示Ki-67蛋白高表達(dá)。與對(duì)照組比較，華蟾素注射液中、高劑量組小鼠黑色素瘤移植瘤中Ki-67蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5。

注：A.對(duì)照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組

注：A.對(duì)照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組；與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.5 4組小鼠移植瘤組織遷移相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，棕褐色越深表明蛋白表達(dá)水平越高。與對(duì)照組比較，華蟾素注射液中、高劑量組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，華蟾素注射液低、中、高劑量組N-cad-herin、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；華蟾素注射液中、高劑量組MMP-2、Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖6、圖7。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，華蟾素注射液低、中、高劑量組移植瘤中N-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖8、圖9。

圖6 4組小鼠移植瘤中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(10×20倍)

圖7 4組小鼠移植瘤中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較

注：A.對(duì)照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

4 討論

黑色素瘤是一種轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)、病死率極高的皮膚惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤較為顯著的特征之一，腫瘤細(xì)胞一方面可以在原發(fā)部位生長(zhǎng)，另一方面能夠通過多種途徑蔓延、擴(kuò)散、定植到其他部位。在黑色素瘤的特征中，高侵襲性是阻礙黑色素瘤治療的關(guān)鍵。因此，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖能力是治療腫瘤的基本途徑之一。

EMT在許多癌癥生物學(xué)行為中起著至關(guān)重要的作用，如腫瘤的遷移和侵襲，抑制EMT的發(fā)生能夠抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。有關(guān)侵襲性MMPs的研究表明，MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，其中MMP-2和MMP-9與惡性腫瘤的遠(yuǎn)處播散密切相關(guān)。MMPs通過分解基底膜蛋白，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，被認(rèn)為是癌癥細(xì)胞侵襲的重要促進(jìn)因子。黑色素瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移之前通常會(huì)經(jīng)歷EMT，這使得腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遷移和侵襲。Vimentin是中間纖維蛋白最主要的組成成分，與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞骨架，參與調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞形狀變化和遷移速度。N-cadherin是一種黏附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)黏附。N-cadherin表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)多種上皮癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力。EMT的發(fā)生伴隨著一系列變化，細(xì)胞會(huì)抑制一些上皮細(xì)胞黏附分子，如E-cadherin的表達(dá)水平降低，而增加間充質(zhì)細(xì)胞黏附分子如Vimentin的表達(dá)水平，獲得遷移和侵襲能力[14]。黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力也影響著腫瘤的治療。Ki-67蛋白是一種半衰期短的非組蛋白核蛋白，是臨床上檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性的常見指標(biāo)。此外，邢芳林等[15]研究認(rèn)為，Ki-67蛋白的表達(dá)水平能夠反映患者惡性腫瘤增殖率，其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，能一定程度上反映腫瘤進(jìn)展[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素注射液可以緩解黑色素瘤移植瘤對(duì)小鼠造成的功能損傷，可抑制黑色素瘤移植瘤質(zhì)量的增加，光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)華蟾素注射液組移植瘤的組織形態(tài)特征發(fā)生明顯變化，結(jié)果說明華蟾素注射液可以抑制移植瘤的生長(zhǎng)。通過對(duì)移植瘤組織Ki-67蛋白表達(dá)情況的研究，發(fā)現(xiàn)華蟾素注射液可抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力，但其是否與抑制黑色素瘤的高侵襲性有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。免疫組織化學(xué)和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，華蟾素注射液組可上調(diào)黑色素瘤移植瘤中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，這有助于維持細(xì)胞連接而抑制間充質(zhì)蛋白的表達(dá)；可下調(diào)Vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞與纖維連接蛋白的黏附而抑制EMT進(jìn)程[17]；可降低MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平，從而抑制ECM蛋白降解和細(xì)胞侵襲而抑制EMT的發(fā)生。以上結(jié)果表明，華蟾素注射液可通過抑制黑色素瘤移植瘤EMT的發(fā)生，抑制黑色素瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移能力，但其具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。