固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定香辛料中去甲烏藥堿含量*

王 瑋，尤曉惠，鄭小敏，王美鋒，向鵬宇

（重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶 408000）

去甲烏藥堿屬生物堿，存在于許多天然植物中，也是一種β受體激動劑，具有增強心肌收縮力［1］和興奮心肌細胞的作用［2］，被國際反興奮劑機構明確禁用。查閱文獻可知，花椒、胡椒、香葉等香辛料中去甲烏藥堿含量較高［3］，目前對食品、中藥材中該成分含量測定的研究較少［4-6］，其前處理技術主要為QuChERS法和直接提取法［7］，分析方法主要為快速檢測免疫法［8］、高效液相色譜法［9-14］、QuChERS法與液相色譜-質譜聯(lián)用法［15-16］。由于香辛料所含成分復雜，其基質效應會不同程度地影響化合物的電離，且很難找到陰性基質，導致上述方法均不適用于香辛料中去甲烏藥堿的篩查及準確定量。本研究中建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）法，旨在最大限度地消除香辛料中雜質的干擾，降低基質效應，提高檢測的準確度和精密度，為香辛料中去甲烏藥堿的含量測定提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290-AB 4500型高效液相色譜串聯(lián)質譜儀（美國Agilent公司）；XPE204型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司，精度為0.001 g）；VORTEX3型渦旋儀（德國IKA公司）；SR-2DS型強力振蕩器（日本Taitec公司）；Multifuge XIR型冷凍離心機（德國Thermo Fisher公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

甘牛至、歐芹、芝麻、茴香、砂仁、孜然、甘草、薄荷、芫荽、山柰、姜（干）、豆蔻、肉豆蔻、迷迭香、香茅、辣椒、胡蘆巴、姜黃、百里香、甜羅勒、小豆蔻、葛縷子、芹菜籽、蒔蘿、龍蒿、高良姜、香果、草果、香葉、丁香、牛至、花椒、蓽拔、茴香、白胡椒、八角等36種香辛料，均購于重慶盤溪農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場。去甲烏藥堿對照品（上海詩丹德生物技術有限公司，批號為8114，含量98.0%）；去甲烏藥堿-D4對照品（天津阿爾塔科技有限公司，批號為S048107，質量濃度為100 μg/mL）；甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。Bond Elut-PBA固相萃取柱（美國Agilent公司，批號為12102018，規(guī)格為3 mL：100 mg）；陽離子交換柱-MCX固相萃取小柱（日本Shimadzu公司，批號為660314243，規(guī)格為60 mg/3 mL）；親水親脂型-HLB固相萃取小柱（美國Waters公司，批號為158A38150A，規(guī)格為60 mg：

3 mL）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters CSH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3.5 min時5%A→25%A，3.5～4.5 min時25%A→95%A，4.5～5.5 min時95%A，5.5～5.6 min時95%A→5%A，5.6～7.0 min時5%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源ESI（+）；多反應監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力35 psi；碰撞氣體（CAD）為氮氣；離子源溫度550℃。去甲烏藥堿定量離子對質荷比（m/z）272.0/107.0，去簇電壓40 V，碰撞能量26 V；去甲烏藥堿定性離子對m/z272.0/255.0，去簇電壓40 V，碰撞能量20 V；去甲烏藥堿-D4離子對m/z276.0/259.0，去簇電壓40 V，碰撞能量21 V。

2.2 溶液制備

取去甲烏藥堿對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液；精密吸取0.1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質量濃度為1 μg/mL的對照品溶液，于-18℃冷凍保存。精密吸取去甲烏藥堿-D4對照品1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質量濃度為10 μg/mL的內(nèi)標貯備液；精密吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標溶液，于-18℃冷凍保存。取樣品適量，粉碎，過60目篩，取1.0 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入內(nèi)標溶液100 μL，再加入19 mL 0.5%甲酸乙醇-水（80∶20，V/V），振蕩30 min，8 000 r/min離心5 min。取上清液，轉移至20 mL比色管中，用5%氨水調(diào)pH至8.5±0.5，加水定容，搖勻。取5 mL，過PBA固相萃取小柱［依次用乙腈、0.5%甲酸水溶液、0.2 mol/L乙酸銨（pH 8.5）各3 mL活化］后，再用0.2 mol/L乙酸銨（pH 8.5）、水各3 mL依次淋洗，用0.5%甲酸甲醇2 mL洗脫，抽干小柱，收集洗脫液，40℃氮氣吹至近干，加0.5%甲酸水1 mL復溶，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同法制備不含樣品的陰性對照品溶液。

2.3 試驗條件優(yōu)化

提取體系優(yōu)化：分別考察了甲醇、乙醇、水、乙腈、甲醇-水、乙醇-水對去甲烏藥堿的提取效果。以陰性樣品（不含去甲烏藥堿）芹菜籽及陽性樣品（含去甲烏藥堿）花椒為考察對象，向樣品中分別加入對照品溶液及內(nèi)標溶液適量，分別用上述體系直接提取，計算絕對回收率。結果見圖1。可見，對于芹菜籽樣品，采用甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水體系較合適，其中乙醇-水提取效率最優(yōu)。

圖1 不同提取體系的加樣回收率Fig.1 Recovery rates of different extraction systems

提取液比例優(yōu)化：另取花椒樣品適量，加入內(nèi)標溶液適量，以含量和基質效應為考察指標，考察20%，40%，60%，80%，100%的乙醇-水體系（含0.5%甲酸）對去甲烏藥堿的提取效率。結果樣品中去甲烏藥堿的含量隨著乙醇體積分數(shù)的升高而增加，當乙醇比例為100%時，樣品含量呈下降趨勢；乙醇比例為40%時，其內(nèi)標的基質效應抑制最強，其他比例時基質效應相當。綜合考慮，本研究中最終選擇乙醇-水（80∶20，V/V，含0.5%甲酸）為提取體系（圖2 A）。

圖2 花椒樣品總離子流圖1.HigenamineA.Before optimizing extraction system B.After optimizing extraction system C.Purification by HLB D.Purification by PBAFig.2 Total ion chromatograms of Zanthoxyli Pericarpium

供試品凈化：為減少復雜基質的干擾和對色譜柱及檢測器的影響，預試驗中采用陽性樣品花椒為考察

對象，以通過HLB小柱凈化后的供試品作為基質溶液，考察在不同梯度流動相條件下，基質溶液對去甲烏藥堿目標峰的干擾情況。結果顯示，優(yōu)化前目標化合物附近會出現(xiàn)基質干擾峰且未完全分離（圖2 B），優(yōu)化后目標成分與基質干擾峰完全分離（圖2 C）。故將條件確定為2.1項下的梯度洗脫程序。

固相萃取柱選擇：去甲烏藥堿為結構中含有苯環(huán)的仲胺化合物，苯環(huán)上帶有2個相鄰的羥基。預試驗中選取芹菜籽和花椒為考察對象，向樣品中分別加入對照品溶液及內(nèi)標溶液適量，分別經(jīng)HLB反相固相萃取柱、MCX陽離子交換固相萃取柱、PBA固相萃取柱凈化，以回收率和凈化效果作為考察指標。結果經(jīng)MCX小柱凈化后，芹菜籽和花椒樣品中去甲烏藥堿的回收率均小于5%；經(jīng)HLB小柱凈化后，芹菜籽樣品去甲烏藥堿的回收率為65%，花椒樣品去甲烏藥堿-D4的回收率為10%，且含量測定的重復性差，凈化后仍存在許多干擾峰；經(jīng)PBA小柱凈化后，芹菜籽中去甲烏藥堿和去甲烏藥堿-D4的回收率分別為80%和94%，花椒中去甲烏藥堿-D4的回收率為88%，凈化后樣品中干擾較少，凈化效果較好（圖2 D）。綜合考慮，選擇PBA固相萃取小柱作為本試驗中的固相萃取柱。見圖2。

樣品篩孔徑：樣品粉碎過程中會出現(xiàn)不易粉碎、粉碎后顆粒大小不均勻的情況。選取3種不同規(guī)格樣品篩（40，60，65目，孔徑0.45，0.30，0.25 mm），考察花椒樣品不過篩及分別過3種篩后對去甲烏藥堿含量的影響，結果見表1?？梢姡S著篩子孔徑的減小，樣品含量逐漸增加，樣品未過篩與過篩后試驗結果存在較大差異，其中過65目篩時含量最高，RSD值最小。

表1 樣品篩孔徑對去甲烏藥堿含量結果的影響（n=6）Tab.1 Effect of different sieve sizes of samples on the content of higenamine（n=6）

2.4 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：精密吸取2.2項下對照品溶液10 μL，置1 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，取適量，另取2.2項下供試品（以花椒樣品為例）溶液適量，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜（圖2）與對照品溶液色譜（圖3）在相同保留時間處有相應色譜峰，去甲烏藥堿拖尾因子為1.02，半峰寬為0.03，理論板數(shù)為25 843.49。

圖3 對照品溶液的總離子流圖1.HigenamineFig.3 Total ion chromatogram of the reference solution

線性關系考察：取2.2項下對照品貯備液適量，加入內(nèi)標溶液適量，加甲醇稀釋成系列對照品溶液。取2 μL，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以去甲烏藥堿質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、內(nèi)標峰面積和去甲烏藥堿峰面積比值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y=0.247 28X+0.053 27（r=0.999 63）。結果表明，去甲烏藥堿質量濃度在0.25～100 ng/mL范圍內(nèi)與內(nèi)標峰面積和去甲烏藥堿峰面積比值線性關系良好。

檢測限與定量限考察：取陰性樣品芹菜籽、甘牛至、茴香、芝麻適量，加入去甲烏藥堿對照品溶液，按2.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3和10時的待測成分質量濃度作為檢測限和定量限。結果去甲烏藥堿的檢測限為1 μg/kg，定量限為3 μg/kg。

精密度試驗：精密吸取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子強度。結果的RSD為1.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一花椒供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子強度。結果的RSD小于2.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取陽性樣品桂皮適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子強度，并計算含量。結果去甲烏藥堿的平均含量為6.67 μg/kg，RSD為1.33%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取芹菜籽、甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香7個香辛料樣品適量，并分別加入低、中、高（2.0，4.0，20.0 μg/kg）質量濃度的對照品溶液和內(nèi)標溶液各適量，平行制備6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子強度并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.5 基質效應考察

取陰性樣品芹菜籽、甘草、甘牛至、茴香、芝麻、丁香和陽性樣品桂皮、花椒，分別加入2.2項下對照品溶液及內(nèi)標溶液適量進行前處理，其中對陽性樣品用內(nèi)標溶液考察基質效應。分別以陰性對照品溶液配制標準溶液，以試劑溶液配置相同濃度標準溶液。基質效應因子（MEF）=基質標準溶液峰面積/溶劑標準溶液峰面積，當MEF為0.8～1.2時，基質效應不明顯［17-21］。結果甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香、花椒、芹菜籽MEF范圍在0.88～1.24。因此，該試驗采用固相萃取凈化，同位素內(nèi)標法定量以最大程度降低基質效應，凈化雜質。

2.6 樣品含量測定

取36種香辛料樣品各適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子強度并計算含量。結果除花椒、香葉、蓽撥、白胡椒、桂皮5種香辛料中去甲烏藥堿的含量測定結果分別為917.23，1 660.11，307.42，219.32，6.67 μg/kg，其余香辛料均未檢出去甲烏藥堿。

3 討論

香辛料是日常生活中常見食材，品種多，成分復雜，基質干擾嚴重。現(xiàn)有的QuChERS法和直接提取法很難滿足大部分香辛料中去甲烏藥堿的含量測定。與QuChERS法和直接提取法相比，固相萃取技術具有較大優(yōu)勢，既改進了現(xiàn)有研究中提取方法存在的一些缺陷，提高了凈化效果，降低基質效應，又解決了個別樣品因無法找到空白基質溶液導致回收率差的問題，同時，采用UPLC-MS/MS法提高檢測靈敏度，可解決現(xiàn)有研究中液相色譜無法準確定性的劣勢。

綜上所述，本研究中所建方法靈敏度高、結果準確性高、穩(wěn)定性好、干擾小、重復性好。研究中充分考慮了不同樣品基質對結果的影響，并選擇同位素內(nèi)標法定量來解決部分品種含有內(nèi)源性物質以至于無法找到空白基質樣本的問題。該方法不僅適用于香辛料中去甲烏藥堿的含量分析，在食品、中藥材的去甲烏藥堿含量測定中也有一定的應用前景。運用所建立的試驗方法對36種香辛料樣品進行檢測，樣品含量結果可反映出不同品種的香辛料含量差異大，這對以后研究不同產(chǎn)地的同一品種香辛料有較大啟發(fā)，可為今后制訂相關質量標準提供理論依據(jù)。