蛋白降解靶向嵌合體在非小細(xì)胞肺癌治療中的研究進(jìn)展

姜琳 張敬博 胡嘉淇 齊海翔 許恒

肺癌是我國癌癥發(fā)病率第一的腫瘤，其5年生存率低，有巨大的未被滿足的臨床需求[1]。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）占肺癌發(fā)病總數(shù)約85%[2]，在一項1,200例中國NSCLC患者的研究調(diào)查中，大約73.9%的患者至少有一個相關(guān)基因突變[3]。其中鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）是臨床中常見的幾種突變，靶向突變基因的小分子靶向治療藥物已經(jīng)成為治療肺癌的有效方法。同時越來越多的新技術(shù)也不斷涌現(xiàn)，為NSCLC的治療提供了新思路。

1 蛋白降解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimeria,PROTAC）技術(shù)及其優(yōu)勢

2001年，Crews和Deshaies的團(tuán)隊提出了PROTAC的概念，通過利用泛素蛋白酶體途徑實現(xiàn)對靶蛋白降解[4]。PROTAC是一個雙功能分子，由靶蛋白配體和E3泛素連接酶配體通過連接臂相連[5]。PROTAC分子在進(jìn)入細(xì)胞后，其結(jié)構(gòu)中靶向目標(biāo)蛋白的配體可特異性地與靶蛋白結(jié)合，另一端可以募集E3連接酶，形成目標(biāo)靶蛋白-PROTAC-E3連接酶三元復(fù)合物[6]。其中E3連接酶可介導(dǎo)泛素結(jié)合酶E2對目標(biāo)靶蛋白泛素化，經(jīng)過多輪泛素化后就有了多個泛素標(biāo)簽，三元復(fù)合物解離后，多聚泛素化的蛋白會被蛋白酶體識別從而有選擇性地降解靶蛋白的水平[7]。

小分子激酶抑制劑主要通過占據(jù)活性結(jié)合位點使蛋白功能缺失發(fā)揮作用，是占據(jù)驅(qū)動，易出現(xiàn)耐藥性問題[8]。PROTAC不是傳統(tǒng)的抑制靶標(biāo)活性，而是利用泛素調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)靶標(biāo)蛋白降解，因此它是事件驅(qū)動，不需要和靶蛋白的活性位點高強(qiáng)度結(jié)合，可靶向傳統(tǒng)認(rèn)為不可成藥靶點，并有望克服耐藥問題；其次，它在靶蛋白被泛素化之后可以釋放出來，循環(huán)往復(fù)結(jié)合靶蛋白和E3連接酶，具有催化特性，低劑量就可以發(fā)揮作用[9]。目前PROTAC處于快速發(fā)展階段，正在成為腫瘤治療的新策略。

2 PROTAC治療NSCLC的研究進(jìn)展

2.1 靶向降解EGFR治療NSCLC

2.1.1EGFR抑制劑研究進(jìn)展EGFR在10%-15%的NSCLC患者中存在突變[10]。靶向治療已經(jīng)成為肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）也隨之成為藥物研發(fā)的熱點，已上市的EGFR-TKIs主要分為三代：第一代EGFR-TKIs如吉非替尼、厄洛替尼等對EGFR19del、EGFRL858R突變患者有較好的治療效果，但是許多患者用藥后出現(xiàn)獲得性耐藥，影響了后續(xù)的治療效果[11]；第二代EGFR-TKIs如阿法替尼、達(dá)克替尼等，雖然通過引入邁克爾受體加強(qiáng)抑制作用，但是在臨床上仍不能克服T790M突變[11]；第三代EGFRTKIs如奧希替尼，不僅在一定程度上可以克服T790M突變耐藥[12]，對NSCLC腦轉(zhuǎn)移也有顯著的治療效果[13]，已成為NSCLC存在EGFR突變的患者一線用藥。其中第三代EGFR-TKIs莫博替尼（TAK-788）對治療外顯子20插入的EGFR罕見突變效果出眾[14]。值得關(guān)注的是，患者在使用第三代EGFR-TKIs后會出現(xiàn)如C797S新的突變，因此需要研發(fā)對T790M/C797S等突變均有效果的新一代的靶向EGFR通路的治療藥物。目前國內(nèi)外許多研究團(tuán)隊也正在利用PROTAC技術(shù)開展靶向降解EGFR的研究，希望找到一種可以克服EGFR耐藥突變的有效策略。

2.1.2 EGFR蛋白降解靶向嵌合體（EGFR-PROTAC）研究進(jìn)展 2018年，Crews團(tuán)隊[15]首次利用PROTAC技術(shù)對EGFR受體酪氨酸激酶進(jìn)行了蛋白降解研究，驗證了利用PROTAC技術(shù)靶向降解EGFR的可行性。其中一個PROTAC分子在HCC827細(xì)胞系上可有效降解外顯子19缺失的EGFR，在H3255細(xì)胞系上可完全降解L858R突變的EGFR。另一個PROTAC分子在H1975細(xì)胞系上可降解L858R/T790M突變的EGFR。該研究首次實現(xiàn)了PROTAC降解突變EGFR。

PROTAC分子由靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和連接臂組成，分子量普遍較大，其口服生物利用度以及體內(nèi)的有效性是PROTAC藥物研究中非常值得關(guān)注的問題。2019年，Jin團(tuán)隊[16]發(fā)現(xiàn)了有較好生物利用度的EGFRPROTAC分子，在小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗中以50 mg/kg的劑量腹腔注射給藥8 h后依然可以保持較高的血藥濃度。該PROTAC分子對突變型EGFR和野生型EGFR有較高的選擇性。

2020年，Gray團(tuán)隊[17]以第四代變構(gòu)EGFR抑制劑作為配體，進(jìn)行了靶向降解EGFR的PROTAC藥物研究。其中一個分子可以有效抑制攜帶三突變EGFRL858R/T790M/C797S和EGFRL858R/T790M/L718Q的Ba/F3細(xì)胞的增殖，其增殖抑制的半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration, IC50）分別為0.041 μmol/L和0.028 μmol/L。同時在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)該PROTAC分子和奧希替尼聯(lián)合使用時可以增強(qiáng)抑制細(xì)胞增殖的能力，說明通過激酶抑制劑和蛋白降解劑的雙機(jī)制調(diào)節(jié)可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

PROTAC分子在靶蛋白泛素化以后，可循環(huán)往復(fù)地結(jié)合發(fā)揮作用，具有催化特性，相比于小分子抑制劑有望減少給藥次數(shù)。在靶向降解EGFR的研究中，一些研究團(tuán)隊也證實了PROTAC這一優(yōu)勢。2021年，Jiang團(tuán)隊[18]在研究中發(fā)現(xiàn)PROTAC分子在細(xì)胞水平上停止給藥后的72 h內(nèi)仍然可以持續(xù)降解L858R/T790M突變的EGFR。Zhang團(tuán)隊[19]在2021年的一項研究中也證實了這一現(xiàn)象，在停止給藥后48 h內(nèi)其PROTAC分子可持續(xù)降解Del19和L858R/T790M突變的EGFR。

值得關(guān)注的是美國C4 Therapeutics公司研發(fā)的靶向降解EGFRL858R的PROTAC分子CFT8919已進(jìn)入到臨床前研究階段，該化合物口服有效、可以透過血腦屏障、對中樞神經(jīng)和EGFR耐藥突變均有較好效果，有望近期進(jìn)入臨床研究[20]。

受到小分子雙重抑制劑啟發(fā)，2021年Li團(tuán)隊[21]設(shè)計合成出可同時靶向降解EGFR和PARP兩個蛋白的Dual PROTAC分子，該項研究也為PROTAC技術(shù)開拓了新的研究方向。乏氧是許多腫瘤細(xì)胞的特征之一，利用腫瘤細(xì)胞乏氧的特性開發(fā)有針對性的藥物，可以提高藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性。2021年，Zhang團(tuán)隊[22]將帶有乏氧激活的離去基團(tuán)HALG引入到PROTAC中，設(shè)計出的乏氧激活PROTAC分子可在腫瘤組織中被激活而釋放出活性降解劑。實驗結(jié)果顯示，在正常氧的環(huán)境中，該化合物對HCC4006細(xì)胞內(nèi)的EGFR 19del沒有降解作用，而在乏氧條件下可實現(xiàn)對EGFR19del的部分降解，從而提高了藥物治療的精準(zhǔn)性。

2.2 靶向降解ALK治療NSCLC

2.2.1 ALK抑制劑研究進(jìn)展 約4%的NSCLC伴有ALK融合基因[23]。棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm microtubule associated protein like 4,EML4）-ALK融合基因是肺癌中最主要的ALK融合基因，有研究[24]證實EML4-ALK融合蛋白能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生。目前已有三代ALK抑制劑上市，克唑替尼是首個獲得FDA批準(zhǔn)上市的ALK抑制劑[25]。第二代ALK抑制劑阿來替尼是治療ALK陽性NSCLC的首選藥物，并且改善了克唑替尼治療腦轉(zhuǎn)移不佳的問題[26]。此外，常見的第二代ALK抑制劑還有布加替尼和塞瑞替尼。在臨床上第三代ALK抑制劑勞拉替尼已經(jīng)成為克服ALK耐藥突變的最后保障[27]。當(dāng)前有研究團(tuán)隊正在利用PROTAC技術(shù)開發(fā)靶向ALK的降解劑，有望為ALK耐藥突變的患者尋找一份新的屏障。

2.2.2 ALK蛋白降解靶向嵌合體（ALK-PROTAC）研究進(jìn)展 2018年，Gray團(tuán)隊[28]報道了首個可靶向降解ALK的PROTAC分子，開啟了ALK蛋白降解領(lǐng)域的新篇章。實驗結(jié)果表明，該PROTAC分子在H3122細(xì)胞系上對ALK的半數(shù)降解濃度（50% degradation concentration, DC50）僅為10 nmol/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該分子除了降解ALK蛋白，對其他靶點蛋白如PTK2、FER、RPS6KA1和Aurora A也有一定的降解能力，但是對表達(dá)有L1196M、C1156Y和G1202R耐藥突變的EML4-ALK的降解能力還有待提高。選擇合適的ALK配體，提高對ALK蛋白的選擇性和對耐藥突變的降解效果，是未來ALK-PROTAC研究中需要重點關(guān)注的方向。

2018年，Jin團(tuán)隊[29]對發(fā)現(xiàn)的靶向降解ALK的PROTAC分子在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了藥代動力學(xué)研究。該PROTAC分子以50 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射給藥12 h后仍然有較高的血漿暴露量。2018年，Hwang團(tuán)隊[30]報道了可在體內(nèi)降解ALK的PROTAC分子，該分子在H3122小鼠異體移植瘤模型中通過注射給藥的方式顯著抑制腫瘤的生長，且對動物體重沒有明顯的影響。2021年，Jiang團(tuán)隊[31]開發(fā)了口服體內(nèi)有效的ALK-PROTAC分子。該化合物在大鼠藥代動力學(xué)研究中，以10 mg/kg口服給藥后，4 h血藥濃度達(dá)到最高，口服生物利用度為16%。PROTAC分子雖然具有強(qiáng)大的催化特性但也存在潛在的問題，例如除了降解腫瘤中的靶蛋白，也可能會導(dǎo)致正常細(xì)胞中的靶蛋白不受控制地降解。光作為一種無創(chuàng)、時空可控的外源刺激，近年來在腫瘤的診治領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注[32]。2020年，Wei團(tuán)隊[33]報道了一種光誘導(dǎo)激活的PROTAC分子。實驗結(jié)果表明，該分子在體外不經(jīng)紫外光照射時不能降解ALK蛋白，而經(jīng)過紫外光照射后光敏基團(tuán)脫除， 則可靶向降解ALK蛋白。

2.3 靶向降解KRAS治療NSCLC

2.3.1 KRAS成為治療NSCLC的新靶點KRAS在細(xì)胞的生存和周期進(jìn)程等方面發(fā)揮重要作用，是NSCLC中最常發(fā)生突變的基因之一[34]。KRAS突變在肺腺癌中的發(fā)生概率約為30%，在肺鱗癌中發(fā)生的概率約為5%[35]。在肺癌中常發(fā)生的顛換型突變有G12C、G12V、G12A、G12R，轉(zhuǎn)換型突變有G12D和G12S。KRAS突變會引起突變RAS蛋白生成，誘導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長、增殖和存活[36]。

RAS蛋白表面光滑，缺乏傳統(tǒng)的可成藥口袋，RAS蛋白與GTP的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于ATP，這些都是研發(fā)KRAS抑制劑的難點，KRAS也一直以來被認(rèn)為是不可成藥靶點[37,38]。近年來針對KRAS突變的小分子抑制劑研發(fā)取得突破性進(jìn)展，美國安進(jìn)公司的AMG510已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)上市，它通過與突變的半胱氨酸共價結(jié)合，來達(dá)到抑制KRAS G12C的目的[39,40]。

2.3.2 KRAS蛋白降解靶向嵌合體（KRAS-PROTAC）研究進(jìn)展 開發(fā)靶向KRAS的蛋白降解劑可以作為調(diào)節(jié)突變KRAS的補(bǔ)充策略。2020年，Crews團(tuán)隊[41]報道了首個可降解KRASG12C的PROTAC分子并在肺癌細(xì)胞上進(jìn)行了深入研究。該化合物在NCI-H2030細(xì)胞系上可有效降解KRASG12C。此外，他們還在5種不同的KRASG12C突變細(xì)胞系中測試了該化合物的降解能力，DC50值均在0.25 μmol/L-0.76 μmol/L之間。實驗結(jié)果說明PROTAC分子可以降解突變的KRAS，是PROTAC技術(shù)靶向不可成藥蛋白領(lǐng)域一項重要突破。

3 PROTAC技術(shù)治療NSCLC的展望

PROTAC技術(shù)現(xiàn)已知可以降解80多個靶點的100多種蛋白，在治療腫瘤、病毒感染以及神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域均有深入的研究。PROTAC技術(shù)作為一種新興的蛋白降解技術(shù)，具有靶向不可成藥靶點、克服耐藥性等小分子抑制劑不可比擬的潛在優(yōu)勢，正處于快速發(fā)展時期。同時值得關(guān)注的是，相比于小分子藥物，PROTAC分子的分子量普遍較大，理化性質(zhì)以及口服生物利用度等通常不夠理想，對腫瘤組織內(nèi)異常蛋白的特異性降解還有待提高等，這些方面也是PROTAC技術(shù)正需克服的一些挑戰(zhàn)。由美國Arvinas公司研發(fā)的靶向降解雄激素受體PROTAC分子ARV-110和雌激素受體ARV-471已進(jìn)入臨床II期試驗階段，初步證實了PROTAC分子在人體上的基本安全性和有效性，對整個PROTAC藥物研發(fā)領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展起到了重要促進(jìn)作用。目前針對EGFR、ALK以及KRAS等NSCLC治療中的重要靶點都已研發(fā)出具有體內(nèi)外活性的PROTAC分子，基于這些分子進(jìn)一步的優(yōu)化以及系統(tǒng)的臨床前評價，相信不久就會有靶向降解上述靶點蛋白的PROTAC藥物進(jìn)入到臨床研究階段，有望為NSCLC患者提供一種全新的治療手段。