生物法制備煙酸關(guān)鍵技術(shù)研究

煙酸又稱尼古丁酸、維生素B3、吡啶-3-甲酸，是維持人體生理機(jī)能所必需的維生素，在醫(yī)藥、化工、食品領(lǐng)域具有廣闊的市場前景。目前煙酸的合成主要為化學(xué)合成和生物合成兩種?；瘜W(xué)合成法是目前市場上所采用的主要生產(chǎn)手段，但環(huán)境污染嚴(yán)重、能耗高、產(chǎn)能偏低、產(chǎn)業(yè)技術(shù)先進(jìn)性嚴(yán)重不足、在國際市場上缺乏競爭力，而且產(chǎn)量無法滿足市場需求。生物催化合成法是近年來快速發(fā)展的可替代性顛覆技術(shù)，具有環(huán)境友好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。

江南大學(xué)、浙江工業(yè)大學(xué)等對生物法制備煙酸關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了深入研究，開展了高產(chǎn)菌株選育、高表達(dá)菌株構(gòu)建及分子改造等工作，實(shí)現(xiàn)了高底物濃度生物轉(zhuǎn)化工藝的構(gòu)建與放大優(yōu)化等。如中國專利CN201710580770.1涉及一種腈水解酶組成型表達(dá)體系的構(gòu)建及其在煙酸合成中的應(yīng)用，所述的腈水解酶組成型表達(dá)載體是通過在pET-3b質(zhì)粒導(dǎo)入惡臭假單胞菌Pseudomonas putida腈水解酶基因編碼序列構(gòu)建而成，得到重組質(zhì)粒pET-3b-NIT，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中得到無需進(jìn)行體外誘導(dǎo)的組成型重組腈水解酶表達(dá)菌株，命名為大腸埃希氏菌Escherichia coliNIT-1，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.14254。進(jìn)一步采用pH-stat補(bǔ)料策略進(jìn)行精確調(diào)控以提升菌體密度和腈水解酶產(chǎn)量，并以大腸埃希氏菌游離細(xì)胞為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，通過批次投料的方式進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸。CN201710593822.9公開了一種高產(chǎn)腈水解酶的重組枯草芽孢桿菌及其在煙酸合成中的應(yīng)用，該方法通過PCR擴(kuò)增惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaCGMCC 3830腈水解酶基因編碼序列并與pMA5質(zhì)粒相連，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pMA5-NIT，轉(zhuǎn)化至Bacillus subtilisWB600中得到可高效表達(dá)腈水解酶的重組菌B.subtilisWB600(pMA5-NIT)，命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNIT-2，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.14255。以重組枯草芽孢桿菌游離細(xì)胞為催化劑，可將3-氰基吡啶完全轉(zhuǎn)化生成煙酸。CN201710666240.9提供一種含腈水解酶的惡臭假單胞菌Pseudomonas putida突變體mut-D3的細(xì)胞復(fù)合固定化方法及其在煙酸制備中的應(yīng)用。該發(fā)明具體是將海藻酸鈉溶液與PVA(聚乙烯醇)按照一定比例混合，作為固定材料，再與制備好的菌懸液混合，滴入預(yù)冷的固化液中進(jìn)行固定。獲得的固定化細(xì)胞對高濃度底物耐受性大大增強(qiáng)，可應(yīng)用于煙酸的高效轉(zhuǎn)化合成，相比于游離細(xì)胞煙酸產(chǎn)量提高約2倍。CN201310570085.2涉及一種將產(chǎn)腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia，CGMCC No.4903）用聚乙烯醇-殼聚糖、海藻酸鈉-明膠復(fù)合材料固定化并分別用戊二醛和京尼平進(jìn)行交聯(lián)處理后用于制備煙酸的方法。研究發(fā)現(xiàn)，用京尼平交聯(lián)處理的殼聚糖-聚乙烯醇固定化細(xì)胞保留活力和重復(fù)利用性比戊二醛交聯(lián)處理的固定化細(xì)胞要好，并且比海藻酸鈉-明膠復(fù)合材料活力高。可以重復(fù)利用多次，有較高的底物耐受性，能提高單位菌體的生產(chǎn)能力。CN201210386670.2公開了一種再育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）ZJB-09150及在生物合成煙酸中的應(yīng)用，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No.M2011472，保藏日期2011年12月15日。所述合成煙酸的方法為：以再育鐮刀菌ZJB-09150發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶濕菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，于pH 7.0～10.0的緩沖溶液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，在35～55℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液即為含煙酸的混合液，混合液分離純化獲得所述煙酸。商玉婷等采用氨基化核殼結(jié)構(gòu)磁性Fe3O4納米粒子對重組腈水解酶進(jìn)行固定化并對制備條件進(jìn)行優(yōu)化。并通過考察磁性固定化細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性、底物耐受性和初始底物濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響，確定磁性固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶為煙酸的工藝條件,以進(jìn)一步增強(qiáng)重組腈水解酶的煙酸生產(chǎn)能力。李禾研究了敏捷嗜酸菌來源腈水解酶的分子改造及在煙酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，從敏捷嗜酸菌Acidovorax facilis72W中克隆腈水解酶編碼基因，實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效異源表達(dá)，并對腈水解酶NitA的酶學(xué)性質(zhì)與生物催化性質(zhì)進(jìn)行表征。進(jìn)一步針對腈水解酶NitA催化活性低、熱穩(wěn)定性差等問題，通過定點(diǎn)突變與隨機(jī)突變等手段篩選到酶活力提高與穩(wěn)定性增強(qiáng)的突變體NitA-C2和H135A。

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，我國對煙酸及其衍生物的需求將迅速增加。研究人員應(yīng)大力開發(fā)和研制新的煙酸及其衍生物的合成路線，尋求生產(chǎn)工藝簡單、環(huán)境友好、綠色化學(xué)的發(fā)展方向，合成更高效的醫(yī)藥、食品添加劑等方面的精細(xì)化工產(chǎn)品。