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    極端中和表型HIV包膜蛋白gp120的高溫分子動(dòng)力學(xué)模擬研究

    2022-12-07 09:59:32張曉玲楊力權(quán)
    關(guān)鍵詞:構(gòu)象中和表型

    李 毅, 李 爽, 張曉玲, 曾 新, 桑 鵬, 楊力權(quán)

    (1.大理大學(xué) 數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)學(xué)院, 大理 671003; 2.大理大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 大理 671003)

    1 引 言

    獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS),俗稱艾滋病,是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起的烈性傳染病. 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),艾滋病在全球廣泛傳播,嚴(yán)重威脅人類健康. 盡管,終生的抗病毒治療可將艾滋病緩解為慢性病的范疇、顯著延長艾滋病患者的生存時(shí)間,但諸如癌癥等長期用藥的副作用仍然給患者造成巨大的負(fù)擔(dān).

    作為唯一暴露在病毒顆粒表面的病毒編碼蛋白,包膜蛋白gp120負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體以觸發(fā)一系列的感染事件[1]. 為使其保守的功能位點(diǎn)免受宿主中和抗體的攻擊,gp120利用其序列變異和結(jié)構(gòu)柔性逃避宿主免疫識(shí)別[2],進(jìn)而促使病毒表現(xiàn)出不同的中和表型[3]. 根據(jù)多種抗體滴定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可將HIV劃分為中和抵抗與中和敏感兩種極端中和表型[4]. 其中,中和抵抗表型毒株主要分離自HIV長期攜帶者的血漿,而中和敏感表型毒株則主要來自實(shí)驗(yàn)室的傳代培養(yǎng)[5].

    2015年,研究人員使用氫氘交換耦合質(zhì)譜的技術(shù)觀測了多種中和抗體與gp120的相互作用[6]. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出,清除病毒效力較高的中和抗體僅在gp120的功能位點(diǎn)引起局部作用,而效力較低的中和抗體則與整個(gè)gp120的精細(xì)變化有關(guān). 以此進(jìn)一步推論,由gp120序列變異引起的構(gòu)象柔性可能是造成HIV不同中和表型的主要分子機(jī)制.

    因此,我們從gp120結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)性的角度探索了極端中和表型HIV的分子機(jī)制[7]. 從實(shí)驗(yàn)標(biāo)定中和表型的HIV譜系中,隨機(jī)選擇了兩株具有極端中和表型的HIV分離株,通過gp120結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建、分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能圖譜分析,初步揭示了HIV中和表型的分子機(jī)制. 中和抵抗比中和敏感g(shù)p120具有更低的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和更高的構(gòu)象柔性. 病毒包膜蛋白中負(fù)責(zé)非共價(jià)相互作用的結(jié)構(gòu)區(qū)域(如layer 1和L1環(huán))在中和敏感g(shù)p120中表現(xiàn)出顯著更高的構(gòu)象柔性. 因此,gp120的構(gòu)象穩(wěn)定性可能會(huì)更易遭到破壞而發(fā)生轉(zhuǎn)換. 此外,中和敏感比中和抵抗gp120具有更多涉及協(xié)同運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)單元. 特別是,在諸如layers 1-2和V1/V2區(qū)域的結(jié)構(gòu)單元,運(yùn)動(dòng)方向上的差異會(huì)使中和敏感g(shù)p120更易發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換. 最后,中和敏感比中和抵抗gp120具有更大、更粗糙和更復(fù)雜的自由能表面,且中和敏感g(shù)p120自由能圖譜中的絕大多數(shù)自由能最小化區(qū)域具有比中和抵抗gp120圖譜中更高的自由能水平,表明前者比后者具有更大的構(gòu)象熵、更豐富的構(gòu)象狀態(tài)和更復(fù)雜的能力學(xué)行為.

    盡管HIV中和表型的潛在分子機(jī)制已被初步探索,但極端中和表型HIV的熱力學(xué)分子基礎(chǔ)仍待進(jìn)一步闡明. 一般認(rèn)為,中和敏感比中和抵抗gp120具有更高的構(gòu)象柔性以便發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換. 但是,極端中和表型HIV包膜蛋白gp120是否具有不同的熱力學(xué)性質(zhì),其折疊或解折疊是否與中和表型相關(guān)等問題仍不清楚. 為此,本文在先前關(guān)于極端中和表型HIV毒株包膜蛋白gp120構(gòu)象柔性差異的研究基礎(chǔ)上,在逐漸升高的溫度下進(jìn)行了高溫分子動(dòng)力學(xué)模擬,以研究二者在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、解折疊和構(gòu)象柔性上的差異. 研究結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了極端中和表型HIV毒株包膜蛋白gp120具有顯著不同的構(gòu)象柔性,還明確了HIV極端中和表型與包膜蛋白gp120熱力學(xué)性質(zhì)的關(guān)聯(lián).

    2 材料和方法

    2.1結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建

    極端中和表型HIV分離株從實(shí)驗(yàn)標(biāo)定的中和表型譜系中隨機(jī)選取,其氨基酸序列取自蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫UniProt(http://www.uniprot.org). 中和抵抗毒株H061.14與中和敏感毒株R2的索引號(hào)分別為A4ZPW8和Q9WPZ4. 構(gòu)建gp120結(jié)構(gòu)模型所用模板選自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org)中冷凍電鏡解析的代表性HIV包膜蛋白結(jié)構(gòu)(索引號(hào)為5FYJ,分辨率為3.4 ?)[8]. 利用軟件包MODELLER V9.15進(jìn)行同源模建(homology modeling)[9]. 所選模板與靶序列具有高度的序列一致性. 以分子概率密度函數(shù)值最小為標(biāo)準(zhǔn),從構(gòu)造的20個(gè)候選模型中選取具有最佳立體化學(xué)質(zhì)量的結(jié)構(gòu)作為最終模型.

    2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

    以上述構(gòu)建的中和抵抗與中和敏感g(shù)p120結(jié)構(gòu)模型為初始,使用GROMACS V 5.1.4軟件包[10]和AMBER99SB-ILDN力場[11]進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬. 將初始結(jié)構(gòu)放置于具有周期邊界條件的十二面體盒子中,保證蛋白質(zhì)中任意原子與盒子邊界的距離不小于10 ?. 然后,加入由TIP3P模型[12]描述的水分子,添加Na+、Cl-離子以使蛋白質(zhì)-水系統(tǒng)在呈電中性的同時(shí)還具有150 mM的鹽濃度. 為了消除原子間立體化學(xué)沖突,并使蛋白質(zhì)充分浸潤于水溶劑中,依次進(jìn)行了最陡下降法能量最小化和固定蛋白質(zhì)重原子運(yùn)動(dòng)的位置限制性模擬. 最后,為保證模擬系統(tǒng)的穩(wěn)定性,進(jìn)行了由1 ns的等容等溫(NVT)系綜和1.5 ns的等壓等溫(NPT)系綜組成的預(yù)模擬.

    對(duì)于中和抵抗與中和敏感g(shù)p120,分別在300 K、373 K和473 K進(jìn)行了三次30 ns的多復(fù)本分子動(dòng)力學(xué)模擬. 每個(gè)復(fù)本的初始原子速度由相應(yīng)溫度下的麥克斯韋分布隨機(jī)分配. 具體模擬參數(shù)如下:采用LINCS算法[13]約束共價(jià)鍵長,積分時(shí)間步長為2 fs;結(jié)構(gòu)快照的輸出頻率為10 ps;恒壓器耦合壓強(qiáng)為1 atm,耦合時(shí)間常數(shù)τp為2 ps;溶質(zhì)(蛋白質(zhì))和溶劑(水分子與抗衡離子)的溫度被分別耦合于對(duì)應(yīng)溫度下,耦合時(shí)間常數(shù)τt均為0.1 ps;使用PME算法[14]處理長程靜電相互作用,內(nèi)插階為4、傅立葉網(wǎng)格為0.16 nm;庫倫力的截?cái)喟霃綖? nm;使用雙程截?cái)喾桨柑幚矸兜氯A相互作用,其中短程和長程的截?cái)喟霃椒謩e為1nm和1.4 nm;非鍵相互作用的更新頻率設(shè)為10個(gè)積分步長.

    2.3 軌跡分析

    軌跡的讀取、骨架原子均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)的計(jì)算,以及解折疊含量Q的測算均使用MDTraj軟件包[15]. 使用GROMACS內(nèi)置的gmx rmsf工具計(jì)算殘基Cα原子的均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation, RMSF).

    3 結(jié) 果

    3.1 序列和結(jié)構(gòu)比較

    圖1 極端中和表型HIV包膜蛋白gp120的序列和結(jié)構(gòu).

    3.2 全局結(jié)構(gòu)波動(dòng)

    通過計(jì)算軌跡中g(shù)p120骨架原子相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的RMSD值,可評(píng)估模擬過程中g(shù)p120的全局結(jié)構(gòu)波動(dòng)[18]. 從圖2可以看出,在所有溫度下,盡管中和抵抗與中和敏感g(shù)p120在模擬初期具有相似的RMSD值. 但隨著模擬的進(jìn)行,中和敏感比中和抵抗gp120表現(xiàn)出顯著更高的RMSD值,說明中和敏感比中和抵抗gp120發(fā)生了相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)更大的構(gòu)象偏差.

    圖2 不同溫度下,中和抵抗(藍(lán)線)與中和敏感(綠線)gp120三個(gè)復(fù)本(R1-3)相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)骨架原子均方根偏差隨時(shí)間變化的曲線.

    在常溫下,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的RMSD值在0-15ns模擬期間幾乎一致. 此后,中和敏感g(shù)p120的兩個(gè)復(fù)本表現(xiàn)出比中和抵抗gp120更高的RMSD值,直至模擬結(jié)束. 隨著模擬溫度的升高,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的RMSD值均逐漸增大. 盡管如此,中和敏感g(shù)p120的RMSD曲線抬升速度要大于中和抵抗gp120,最終導(dǎo)致了前者更大的結(jié)構(gòu)偏差.

    以上結(jié)果表明,在同一溫度下,中和敏感比中和抵抗gp120表現(xiàn)出更大的結(jié)構(gòu)偏差或更高的全局結(jié)構(gòu)波動(dòng),說明中和抵抗比中和敏感g(shù)p120具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).

    3.3 解折疊程度

    為了比較中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的解折疊程度,不同溫度下gp120相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的天然接觸含量Q[19]隨時(shí)間的變化顯示在圖3中. 在常溫下,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120均含有90%左右的天然接觸含量. 中和抵抗gp120三個(gè)復(fù)本的天然接觸含量分布較為集中,而中和敏感g(shù)p120各個(gè)復(fù)本則分布在92%至88%之間的區(qū)域中,總體上較中和抵抗gp120具有更多的天然接觸含量.

    圖3 不同溫度下,中和抵抗(藍(lán)線)與中和敏感(綠線)gp120三個(gè)復(fù)本(R1-3)天然接觸含量Q隨時(shí)間變化的曲線.

    圖4 中和抵抗(藍(lán)色)與中和敏感(綠色)gp120在RMSD和Q空間中的群體分布.

    圖5 不同溫度下,中和抵抗(藍(lán)線)與中和敏感(綠線)gp120的Cα原子均方根波動(dòng)曲線.

    隨著溫度的升高,中和敏感和中和抵抗gp120的天然接觸含量均逐漸降低,并在473 K下低至70%左右. 在373 K溫度下,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120具有非常相似的天然接觸含量曲線,說明中和抵抗與中和敏感g(shù)p120在該溫度下具有相似的解折疊程度. 在473 K模擬溫度下,中和抵抗gp120能較快到達(dá)較低的天然接觸水平,說明中和抵抗gp120的解折疊程度較高.

    比較中和抵抗與中和敏感g(shù)p120之間天然接觸含量的差異可以看出,中和抵抗gp120的天然接觸含量總比中和敏感g(shù)p120的稍低. 但兩者差異較小,說明相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的天然接觸含量在中和抵抗與中和敏感g(shù)p120之間不具備顯著差異,也就是中和抵抗與中和敏感g(shù)p120具有相似的解折疊程度.

    3.4 構(gòu)象群體分布

    為了比較中和抵抗與中和敏感g(shù)p120在構(gòu)象群體分布上的差異,各個(gè)溫度下的軌跡被投射到由RMSD和Q組成的空間中. 如圖4所示,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120具有相似的構(gòu)象群體分布范圍,均位于RMSD從0.2至1 nm和Q從95%至70%之間的區(qū)域. 但是,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120具有不同的構(gòu)象群體分布形態(tài). 對(duì)于中和抵抗gp120,其構(gòu)象群體可被劃分為兩個(gè)主要區(qū)域,即RMSD約0.3 nm、Q約85%的區(qū)域和RMSD約0.8 nm、Q約75%的區(qū)域. 而中和敏感g(shù)p120則至少具有四個(gè)主要的構(gòu)象群體,即RMSD約0.2 nm、Q約88%的區(qū)域;RMSD約0.4 nm、Q約83%的區(qū)域;RMSD約0.8 nm、Q約83%的區(qū)域和RMSD約0.8 nm、Q約75%的區(qū)域.

    上述結(jié)果說明,中和敏感比中和抵抗gp120在模擬過程中經(jīng)歷了更大的構(gòu)象變化,因而具有更高的構(gòu)象熵. 中和敏感比中和抵抗gp120具有更多樣的構(gòu)象群體分布,即具有更豐富的構(gòu)象多樣性.

    3.5 局部構(gòu)象柔性

    通過計(jì)算中和抵抗與中和敏感g(shù)p120每個(gè)殘基Cα原子的均方根波動(dòng)RMSF值,可定量描述蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)區(qū)域的波動(dòng)[20]. 此外,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的RMSF平均值,以及等同殘基位置上中和抵抗gp120的RMSF值減去中和敏感g(shù)p120的RMSF值所得到的差值,能進(jìn)一步反應(yīng)各個(gè)溫度下中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的局部構(gòu)象柔性.

    在常溫下,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的RMSF平均值分別為0.12和0.15 nm,表明中和敏感g(shù)p120具有更高的構(gòu)象柔性. 除少數(shù)區(qū)域外,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的絕大部分結(jié)構(gòu)區(qū)域均具有相似RMSF曲線,說明兩者具有相似的構(gòu)象柔性分布特征. 兩者構(gòu)象柔性差異明顯的區(qū)域主要集中在V1/V2區(qū)域和V4-5環(huán).

    隨著溫度的升高,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120的RMSF值均隨之增大,說明全局構(gòu)象柔性也相應(yīng)增大. 但是,中和敏感總比中和抵抗gp120具有更大的RMSF平均值,中和抵抗與中和敏感g(shù)p120在373 K下的RMSF均值分別為0.13和0.15 nm,在473 K下的RMSF均值分別為0.21和0.23 nm. 對(duì)于在常溫下就比中和抵抗gp120較高的區(qū)域,V1/V2區(qū)域在373 K下仍然維持中和敏感高于中和抵抗gp120的趨勢,但在473 K翻轉(zhuǎn);V4-5環(huán)則在兩個(gè)高溫下均呈現(xiàn)出中和敏感g(shù)p120較高的RMSF值.

    4 討 論

    作為唯一暴露在外的病毒編碼蛋白,包膜蛋白gp120在HIV病毒侵染和免疫逃逸中扮演著關(guān)鍵角色[21]. 實(shí)驗(yàn)[5]和理論[7]研究都指出其與抗體的相互作用在很大程度上決定了HIV的中和表型. 在我們前期的研究中,極端中和表型HIV的包膜蛋白gp120的結(jié)構(gòu)模型呈現(xiàn)出高度的相似性[7]. 經(jīng)過分子動(dòng)力學(xué)模擬后,極端中和表型在結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)性、構(gòu)象柔性、大尺度分子運(yùn)動(dòng)和自由能水平上均表現(xiàn)出差異[22]. 該研究從包膜蛋白gp120動(dòng)態(tài)性的角度初步揭示了HIV中和表型的分子機(jī)制.

    在本文中,我們進(jìn)一步研究了包膜蛋白gp120熱力學(xué)性質(zhì)與HIV中和表型的關(guān)系. 在高溫分子動(dòng)力學(xué)模擬中,包膜蛋白gp120表現(xiàn)出與HIV極端中和表型呈正相關(guān)的熱力學(xué)性質(zhì),即中和敏感g(shù)p120在各溫度下均相較中和抵抗gp120具有更大的全局結(jié)構(gòu)波動(dòng)、更多樣的構(gòu)象群體分布和更高的局部構(gòu)象柔性. 但是,從天然接觸含量可以看出,中和抵抗和中和敏感g(shù)p120在各溫度下均具有相似的解折疊程度,說明HIV中和表型與其包膜蛋白gp120的解折疊程度無關(guān).

    與球狀蛋白的解折疊[23]不同,gp120由于除核心結(jié)構(gòu)外,還具有伸展在外的可變環(huán)區(qū). 其構(gòu)象柔性和解折疊程度并不像球狀蛋白那樣呈現(xiàn)出嚴(yán)格的正相關(guān)關(guān)系. 而且,gp120高度變異的序列很可能不存在諸如鹽橋[24]等強(qiáng)相互作用,以維持其熱力學(xué)性質(zhì). 蛋白質(zhì)的解折疊可以被記作其折疊成天然構(gòu)象的逆過程,本研究從高溫解折疊熱力學(xué)的角度明確了極端中和表型HIV背后的分子基礎(chǔ).

    5 結(jié) 論

    在本研究中,延續(xù)我們前期關(guān)于極端中和表型HIV包膜蛋白gp120的分子動(dòng)力學(xué)模擬,以中和抵抗H061.14與中和敏感R2兩個(gè)極端中和表型HIV的gp120結(jié)構(gòu)模型為研究對(duì)象,通過比較中和抵抗和中和敏感g(shù)p120在全局結(jié)構(gòu)波動(dòng)、天然接觸含量、構(gòu)象群體分布、局部構(gòu)象柔性等方面的差異,以期闡釋HIV中和表型與其包膜蛋白gp120熱力學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系. 主要結(jié)果為:(1)HIV中和表型與gp120的熱力學(xué)性質(zhì)呈正相關(guān);(2)中和敏感比中和抵抗gp120表現(xiàn)出更大的結(jié)構(gòu)波動(dòng)、更多的構(gòu)象狀態(tài)和更高的全局構(gòu)象柔性;(3)二者具有相似的天然接觸含量溫度,說明HIV中和表型與gp120解折疊程度無關(guān). 總之,本文的研究結(jié)果從熱力學(xué)的角度闡釋了HIV包膜蛋白gp120的“結(jié)構(gòu)-熱力學(xué)性質(zhì)-表型”三者間的關(guān)系,明確了HIV中和表型背后的分子基礎(chǔ).

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