靈武長棗果實發(fā)育過程中阿拉伯半乳糖蛋白組織化學(xué)分布

王 靜 章英才 陶珊珊

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

阿拉伯半乳糖蛋白（Arabinogalactan proteins，簡稱AGPs）廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、果實和種子，是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，由多糖支鏈和蛋白質(zhì)核心鏈組成［1-3］，糖基部分通常占整個AGPs分子的90%以上，主要由阿拉伯糖和半乳糖構(gòu)成，屬于富含羥脯氨酸的糖蛋白（HRGPs）家族［4］。作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的糖蛋白，AGPs 參與了植物營養(yǎng)生長［5］、生殖生長和發(fā)育［6］的各個環(huán)節(jié)。以往的研究集中于認(rèn)識這些大分子糖蛋白在植物營養(yǎng)生長的功能和有性生殖中對于雌雄配子的發(fā)育［3］、成熟花粉粒在柱頭上萌發(fā)以及花粉管在體內(nèi)和體外生長的影響［4］，集中于研究AGPs 在根形態(tài)建成、細(xì)胞增殖與程序性死亡、雌雄配子體的發(fā)育、花藥發(fā)育與花粉管生長、體細(xì)胞胚胎發(fā)生以及植物激素信號傳導(dǎo)等方面的功能［7-8］，但對植物果實發(fā)育中AGPs 的研究較少［9］，且主要集中在寧夏枸杞（Lycium barbarum）等。現(xiàn)有資料表明，寧夏枸杞多糖是一種以-O-連接的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的阿拉伯半乳聚糖AGPs 糖蛋白，枸杞果實的多糖具有典型的AGPs糖蛋白特征［10-11］。根據(jù)寧夏枸杞多糖的化學(xué)組成和糖鏈結(jié)構(gòu)特征，認(rèn)為枸杞多糖屬于type Ⅱ類 型 的 阿 拉 伯 半 乳 聚 糖 蛋 白AGPs［12］。Redgwell 等［10］認(rèn)為寧夏枸杞果實的細(xì)胞壁多糖具有典型的阿拉伯半乳聚糖蛋白特征，AGPs 大量地分布在果肉細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的質(zhì)體膜上［11］。此外，AGPs 糖鏈組成主要以阿拉伯糖和半乳糖為主，枸杞糖蛋白被證實是枸杞子中提高免疫活性和抗衰老的藥用有效成分［12］。值得注意的是，果實內(nèi)的AGPs 具有免疫調(diào)節(jié)的功能，能激活動物的免疫系統(tǒng)或補體系統(tǒng)［11-12］，這與已報道的長棗多糖的藥理功能［13］相一致，也與靈武長棗（Ziziphus jujuba‘Lingwu Changzao’）不同發(fā)育時期的果實里精制多糖的10 種單糖中阿拉伯糖、半乳糖含量較高的研究結(jié)果［13］一致。因此，果實AGPs多糖蛋白積累在靈武長棗品質(zhì)形成中占有十分重要的地位。

AGPs 可能分布在植物各種組織和細(xì)胞的細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞器和胞外基質(zhì)等部位［14］。一般來說，對AGPs 的鑒定常采用人工合成的苯基偶氮染色劑βGlcY（β-D-glucosyl-Yariv reagent）與AGPs 發(fā)生特有的反應(yīng)，形成棕紅色絮狀沉淀，βGlcY 是鑒定AGPs 的常用染色劑［2］。βGlcY 不僅可用來對組織和器官中的AGPs 進(jìn)行分布與定位［14-15］、定量分析［14］，還可以通過與AGPs 結(jié)合而研究其功能［15］。近年來與AGPs 進(jìn)行特異性反應(yīng)的單克隆或多克隆抗體，成為研究AGPs 的重要手段［3］。由于單克隆抗體的特異性較高，絕大多數(shù)識別的是AGPs 的糖基部位，成為研究AGPs 分布與特性的良好工具［6］。Bao 等 通 過Western blot 分 析 證 實JIM8、JIM13、MAC204、JIM94 為抗枸杞果實AGPs 的抗體，并對果實AGPs進(jìn)行了免疫組化定位［11］；Leszc?zuk 等通過JIM13、JIM15、MAC207 抗體研究了低溫對雛菊（Bellis perennis）胚珠和花藥發(fā)育過程中AGPs 分布變化的影響［16］；利用特異性抗體對細(xì)胞中抗原的時空分布進(jìn)行精準(zhǔn)定位的免疫定位技術(shù)，是研究結(jié)構(gòu)與功能極其復(fù)雜且呈動態(tài)變化的AGPs的理想選擇。目前，通過βGlcY試劑對AGPs染色、單克隆抗體與AGPs 反應(yīng)，以及通過分子生物學(xué)與生物化學(xué)方法等手段，可以對不同植物中不同部位AGPs 的分布和表達(dá)進(jìn)行定位［3，17］。這為靈武長棗果實內(nèi)AGPs 的組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)定位提供了很好地借鑒和支撐。

靈武長棗是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）栽培作物，原產(chǎn)于寧夏靈武市，為藥食同源鮮食棗品種，其中長棗多糖（糖蛋白）是靈武長棗果實中最重要的藥用生物活性成分之一，是篩選優(yōu)良品種資源的關(guān)鍵因素［13］。近年來，在靈武長棗果實采后貯藏保鮮、生理變化及關(guān)鍵技術(shù)、品種選育、栽培技術(shù)等方面有了較多的研究成果［18］，而有關(guān)果實多糖重要組成AGPs 糖蛋白的分布和與果實品質(zhì)影響的研究尚鮮見報道。因此，本研究以靈武長棗不同發(fā)育時期的果實為研究材料，應(yīng)用組織化學(xué)和免疫熒光定位技術(shù)，揭示AGPs 糖蛋白在果實發(fā)育過程中的分布特征，為進(jìn)一步研究該成分在亞細(xì)胞分布及其在品質(zhì)調(diào)控方面的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗基地6年生靈武長棗為供試材料，采用隨機設(shè)計，3次重復(fù)，每次重復(fù)選擇生長發(fā)育良好、樹勢適中、長勢和花期相似、栽培管理水平一致的5～10 株植株。用毛線于2021 年6 月10 日標(biāo)記同一天開放的花朵，每個重復(fù)標(biāo)記3 000朵。

在靈武長棗開花坐果到果實成熟的發(fā)育過程中共設(shè)計4 次試驗，具體分別在果實膨大前期（2021 年7 月10 日）、果實快速膨大期（2021 年8 月9 日）、果實著色期（2021 年9 月8 日）、果實完熟期（2021年9月28日），每次試驗時間均設(shè)定于09：00—11：00 進(jìn)行，按所標(biāo)記植株從樹冠的東、西、南、北4 個方位以及上、中、下、里、外各個方向選擇標(biāo)記花朵的枝條上果實作為試驗對象，采摘后用冰壺4 ℃冷藏帶回實驗室。

熔點為35～37 ℃的石蠟Steedman’s wax 由聚乙二醇-400二硬脂酸酯和1-十六烷醇（均購自Sig?ma-Aldrich）按9∶1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在50 ℃左右溫箱熔化并充分混勻而成；βGlcY 和βManY 購自Biosup?plies Australia Pty Ltd.；AGPs 單克隆抗體MAC204購自美國喬治亞大學(xué)，其相應(yīng)二抗Anti-mouse-IgG-FITC購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 糖蛋白βGlcY試劑定位

1.2.1.1 石蠟切片

選取不同發(fā)育時期的果實，用解剖刀將材料切成帶外果皮的0.6 cm×0.4 cm×0.5 cm 的小塊，立即放入4% 多聚甲醛-0.5% 戊二醛的PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）固定液中，蓋緊瓶蓋后注射器多次抽氣至樣品沉落瓶底，在室溫下固定12 h 或過夜。樣品用PBS 磷酸緩沖液（10 mmol·L-1，pH=7.4）清洗3 次，每次15 min。在4 ℃下依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水，每次60 min，100%乙醇3～4 次，60 min/次。樣品在恒溫箱中37 ℃用V（純乙醇）∶V（石蠟）=1∶1 滲透過夜，次日更換V（純乙醇）∶V（石蠟）=1∶3 滲透2.5 h，再用純石蠟繼續(xù)滲透3 次，每次2 h。將樣品用純石蠟在牛皮紙盒中包埋，常溫凝固后即可。將樣品蠟塊固著在小木塊上，在25 ℃左右環(huán)境中，用LEI?CA RM 2255切片機切片，厚度為10 μm，光面朝下放在較低溫的瓷盤中。先在涂有0.2%聚乙烯亞胺的載玻片上加一兩滴蒸餾水，用鑷子將蠟帶光滑面朝下輕放在載玻片水滴中，按順序排好，在25 ℃左右室溫下可自然展片，切片自然展片后將多余的水吸去，晾干一周后備用。

1.2.1.2 βGlcY和βManY標(biāo)記

將粘有蠟帶的載玻片切片放入裝有純乙醇的染色缸中，中間換2 次純乙醇，30 min/次，切片完全脫蠟后，依次放入體積分?jǐn)?shù)為90%、70%、50%乙醇的染色缸中逐級復(fù)水，每級10 min。直接在載玻片上滴1 滴配置好的Yariv reagent（1 mg·mL-1溶解于0.15 mol·L-1的NaCl）染色60 min。對照組采用βManY（1 mg·mL-1溶解于0.15 mol·L-1的NaCl），即陰性對照切片用βManY 代替βGlcY；然后用dd H2O沖洗2～3次，每次1 min。稍微晾干后，取體積分?jǐn)?shù)為100%甘油少許滴在切片上封片。吸去多余的封片劑后用指甲油將蓋玻片的四周封固，OLYMPUS IX73顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 糖蛋白免疫熒光定位

糖蛋白免疫熒光定位參照Bao 等［11］、Xu 等［19］的方法，略有改動。

1.2.2.1 石蠟切片

4 個發(fā)育時期果實用解剖刀切成帶外果皮的0.6 cm×0.4 cm×0.5 cm 的小塊，立即放入含有體積分?jǐn)?shù)3.7%甲醛的2F4 固定液中，蓋緊瓶蓋后注射器抽氣至樣品下沉瓶底，室溫固定4 h。更換固定液3 次，每次30 min。然后用PBS 磷酸緩沖液（10 mmol·L-1，pH=7.0）清洗3 次，每次15 min。樣品在4 ℃下用為0.05% Toluidine blue（甲苯銨藍(lán)）染色15 min。后續(xù)乙醇梯度脫水、浸蠟、包埋、蠟塊的固著、整修、切片、貼片和展片與前述石蠟切片步驟相似。

1.2.2.2 免疫熒光標(biāo)記

將貼片后的載玻片放入裝有純乙醇的染色缸中，中間換2 次純乙醇，30 min/次，切片即可全部脫蠟。切片依次放入體積分?jǐn)?shù)為90%、70%、50%乙醇的染色缸中逐級復(fù)水，每級10 min。將載玻片上切片在PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）培養(yǎng)皿中浸泡10 min，然后用含50 mmol·L-1甘氨酸的PBS溶液封閉30 min，PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）浸泡10 min，然后用質(zhì)量體積濃度為2% BSA 的PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）溶液室溫封閉10 min，PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）浸泡10 min。然后用PBS（含質(zhì)量體積濃度1%BSA）以1∶100比例稀釋后的AGPs 單克隆抗體MAC204，4 ℃下孵育過夜（陰性對照切片采用含質(zhì)量體積濃度1% BSA 的PBS 溶液代替一抗孵育），次日用PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，以去除多余抗體，再用PBS（含質(zhì)量體積濃度1%BSA）以1∶300 比例稀釋后的Anti-mouse-IgG-FITC 二抗36 ℃黑暗條件下孵育1 h。標(biāo)記后，PBS 淋洗浸泡3 次，每次10 min，除去未標(biāo)記的二抗，用質(zhì)量體積濃度為0.01% Toluidine blue 染色10 min，以去除植物本身的自發(fā)熒光。切片用PBS（10 mmol·L-1，pH=7.4）淋洗（浸泡）10 min，稍微晾干后，取甘油少許滴在切片上，用蓋玻片封片，避免產(chǎn)生氣泡，吸去多余的封片劑后用指甲油將蓋玻片的四周封固，盡快在OLYMPUS IX73 熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨大前期果實AGPs的βGlcY定位

由于βGlcY 與AGPs 發(fā)生特有的反應(yīng)，形成棕紅色絮狀沉淀。膨大前期果實外果皮由單層外壁角質(zhì)化的細(xì)胞組成，AGPs 形成的棕紅色沉淀在細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布，緊鄰?fù)夤さ臄?shù)層排列較為緊密以及內(nèi)部相鄰數(shù)層排列較疏松大型中果皮細(xì)胞內(nèi)外均分布AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖1：A～B）。大小不同的中果皮維管束分布較多，直到內(nèi)果皮處，維管束主要以圓形或橢圓形為主，維管束或單個發(fā)育或多個維管束背靠背式發(fā)育，木質(zhì)部和韌皮部沒有固定的分布方向（見圖1：A～D）；木質(zhì)部導(dǎo)管或管胞木質(zhì)化程度較低，韌皮部比較發(fā)達(dá)，由排列較為緊密的篩管、伴胞及韌皮薄壁細(xì)胞組成，在維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖1：A～E）。中間部分的中果皮薄壁細(xì)胞排列較疏松，形成大小不等的空腔，維管束數(shù)量和外部的中果皮相差不大，除了空腔之外，大部分薄壁細(xì)胞和組成維管束的各細(xì)胞都分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖1：A～E）。βManY 在果實相應(yīng)部位均沒有棕紅色沉淀（見圖1：F）。

圖1 膨大前期果實AGPs的βGlcY定位A～B.外果皮及內(nèi)部組織AGPs定位；C.近外果皮維管束及周圍組織AGPs定位；D.中部中果皮維管束及周圍組織AGPs定位；E.近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織AGPs定位；F.外果皮及內(nèi)部組織，示βManY處理后均沒有棕紅色沉淀；P.AGPs形成的棕紅色沉淀；VB.維管束；Ex.外果皮；En.內(nèi)果皮；下同F(xiàn)ig.1 βGlcY distribution of AGPs during the early bulking period A-B.AGPs distribution in exocarp and internal tissues；C.AGPs distribution in vascular bundles and surrounding tissues close to exocarp；D.AGPs distribution in vascular bundles and surrounding tissues in mid mesocarp；E.AGPs distribution in vascular bundles and surrounding tissues of meso?carp near endocarp；F.Exocarp and internal tissues，showed no brown red precipitate after treatment with βManY；P. AGPs brown red precipitate；VB.Vascular bundle；Ex.Exocarp；En.Endocarp；The same as below

2.2 快速膨大期果實AGPs的βGlcY定位

快速膨大期果實外果皮壁明顯增厚，AGPs 形成的棕紅色沉淀在細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布，外果皮內(nèi)由數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞組成，AGPs 形成的棕紅色沉淀均明顯分布于細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部（見圖2：A）。內(nèi)部數(shù)層大型卵圓形薄壁細(xì)胞AGPs 形成的棕紅色沉淀均主要分布于細(xì)胞壁上，大部分細(xì)胞內(nèi)部無分布（見圖2：A）。維管束主要分布在中果皮的中部和內(nèi)部（見圖2：A～D）；由于果實快速膨大，中果皮的空腔隨著果實的發(fā)育有不同程度的增大，單位面積維管束的數(shù)量隨著果實體積的快速增大逐漸減少；維管束或單個存在，或二到三個維管束的木質(zhì)部彼此相互連接，木質(zhì)部導(dǎo)管呈輻射狀緊密排列在維管束內(nèi)側(cè)，而韌皮部排列在維管束外側(cè)與木質(zhì)部并生成束；在維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞內(nèi)外均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖2：B～E）。除了空腔之外，維管束周圍的中果皮薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁都分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀，細(xì)胞內(nèi)部分布較少，部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂現(xiàn)象（見圖2：B～E）。維管束導(dǎo)管分子數(shù)量逐漸增多，韌皮部的篩管、伴胞清晰，薄壁細(xì)胞豐富，近內(nèi)果皮維管束數(shù)量較少（見圖2：E），在近內(nèi)果皮維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞內(nèi)外均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀，而維管束周圍薄壁細(xì)胞的部分細(xì)胞內(nèi)外也都分布AGPs形成的棕紅色沉淀（見圖2：E）。βManY在維管束及薄壁細(xì)胞等部位均沒有棕紅色沉淀（見圖2：F）。

圖2 快速膨大期果實AGPs的βGlcY定位A～E.按果實結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)的順序排列；A.外果皮及內(nèi)部組織AGPs定位；B.近外果皮維管束及周圍組織AGPs定位；C～D.中部中果皮維管束及周圍組織AGPs 定位；E.近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織AGPs 定位；F.中果皮維管束及周圍組織，示βManY 處理后均沒有棕紅色沉淀Fig.2 βGlcY distribution of AGPs during the rapid enlargement period A-E.According to the order of fruit structure from outside to inside；A.AGPs distribution in exocarp and internal tissues；B.AGPs distribution in vas?cular bundles and surrounding tissues close to exocarp；C-D.AGPs distribution in vascular bundles and surrounding tissues in mid mesocarp；E.AGPs distribution in vascular bundles and surrounding tissues of mesocarp near endocarp；F.Vascular bundles and surrounding tissues of meso?carp，showed no brown red precipitate after treatment with βManY

2.3 著色期果實AGPs的βGlcY定位

著色期果實外果皮壁依然較厚，外果皮內(nèi)由數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞組成，AGPs 形成的棕紅色沉淀在細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布（見圖3：A）。內(nèi)部數(shù)層大型卵圓形薄壁細(xì)胞間隙拉大拉長排列松散，圍成空腔的薄壁細(xì)胞拉長，而且由于部分細(xì)胞的破裂，果實的中果皮空腔數(shù)量增多，空腔的體積進(jìn)一步增大，除空腔之外，AGPs形成的棕紅色沉淀均主要在薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞內(nèi)部均較少分布，AGPs 形成的棕紅色沉淀有所減少（見圖3：A～B）。同一視野中分布的維管束數(shù)目逐漸明顯變少，外部中果皮維管束數(shù)量相對較多（見圖3：A），果實內(nèi)部中果皮維管束數(shù)量較少（見圖3：B～E）；維管束的排列與快速膨大期相似，主要有多個維管束相連進(jìn)而形成多分支結(jié)構(gòu)，木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞發(fā)育成熟，除空腔之外，在維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖3：A～E）。維管束周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀，但大部分薄壁細(xì)胞內(nèi)部無分布（見圖3：B～E）。βManY 在維管束及薄壁細(xì)胞等部位均沒有棕紅色沉淀（見圖3：F）。

圖3 著色期果實AGPs的βGlcY定位Fig.3 βGlcY distribution of AGPs during the the coloring period

2.4 完熟期果實AGPs的βGlcY定位

完熟期果實外果皮壁及緊鄰細(xì)胞特點與著色期相似，外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖4：A）。相鄰的內(nèi)部較大型的中果皮薄壁細(xì)胞間隙拉大排列松散，單列或數(shù)列排成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由于很多細(xì)胞的破裂，形成更大的空腔，分布于整個中果皮外部及內(nèi)部組織，除空腔之外，AGPs 形成的棕紅色沉淀均主要在薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞內(nèi)部均較少分布，AGPs 形成的棕紅色沉淀明顯減少（見圖4：A～E）。同一視野下維管束數(shù)量更少，尤其中果皮最內(nèi)部的維管束數(shù)目減少明顯（見圖4：C～E），但維管束結(jié)構(gòu)和排列與之前著色期相比亦無明顯變化，多個維管束相連形成多分支結(jié)構(gòu)較普遍，導(dǎo)管數(shù)目較多，韌皮部薄壁細(xì)胞明顯，有時相鄰維管束鏈接成線，除空腔之外，在中果皮中部及內(nèi)部維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀（見圖4：A～E）。中果皮中部和內(nèi)部維管束周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁均分布有AGPs 形成的棕紅色沉淀，但大部分薄壁細(xì)胞內(nèi)部無分布（見圖4：B～E）。βManY 在維管束及薄壁細(xì)胞等部位均沒有棕紅色沉淀（見圖4：F）。

圖4 完熟期果實AGPs的βGlcY定位Fig.4 βGlcY distribution of AGPs during the maturation period

2.5 膨大前期果實AGPs免疫熒光分布

膨大前期果實外果皮、緊鄰?fù)夤さ臄?shù)層排列較為緊密以及內(nèi)部相鄰數(shù)層排列較疏松大型中果皮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有MAC204 抗體識別的抗原綠色熒光信號（見圖5：A1～B2）。在維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層所有細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有MAC204 抗體識別的抗原（見圖5：A1～C2）。中間部分的中果皮薄壁細(xì)胞排列較疏松，除了空腔之外，大部分薄壁細(xì)胞和組成維管束的各細(xì)胞都分布有MAC204 抗體識別的抗原（見圖5：A1～C2）。而靠近內(nèi)果皮的中果皮細(xì)胞排列緊密，內(nèi)果皮附近的維管束分布數(shù)量較多且集中，除空腔之外，在靠近內(nèi)果皮的大部分薄壁細(xì)胞以及維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞均分布有MAC204 抗體識別的抗原綠色熒光（見圖5：D1～D2）。

圖5 膨大前期果實MAC204抗體的免疫熒光分布A1，B1.外果皮及內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)；A2，B2.外果皮及內(nèi)部組織免疫熒光分布；C1.中部中果皮維管束及周圍組織結(jié)構(gòu)；C2.中部中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布；D1.近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織結(jié)構(gòu)；D2.近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布；A1～D1為明場圖；A2～D2分別為對應(yīng)的熒光圖Fig.5 Immunofluorescence distribution of MAC204 antibody during the early bulking period A1，B1.Structures of exocarp and internal tissues；A2，B2.Immunofluorescence distribution of exocarp and internal tissues；C1.Structures of vascu?lar bundles and surrounding tissues in mid mesocarp；C2.Immunofluorescence distribution of vascular bundles and surrounding tissues in mid meso?carp；D1.Structures of vascular bundles and surrounding tissues of mesocarp near endocarp；D2.Immunofluorescence distribution of vascular bun?dles and surrounding tissues of mesocarp near endocarp；A1-D1 show the bright field；A2-D2 show the corresponding fluorography，respectively

2.6 快速膨大期果實AGPs免疫熒光分布

快速膨大期果實MAC204 抗體識別的抗原綠色熒光在外果皮細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布，外果皮內(nèi)數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均明顯分布MAC204 抗體識別的抗原（見圖6：A1～A2）。內(nèi)部數(shù)層大型卵圓形薄壁細(xì)胞MAC204抗體識別的抗原均主要分布于細(xì)胞壁上，部分細(xì)胞內(nèi)部無分布（見圖6：A1～A2）。維管束主要分布在中果皮的中部和內(nèi)部，在維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞內(nèi)外均分布有MAC204抗體識別的抗原（見圖6：A1～B2）。除了空腔之外，維管束周圍的中果皮薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁都分布有MAC204 抗體識別的抗原，部分細(xì)胞內(nèi)部無分布（見圖6：A1～B2）。近內(nèi)果皮維管束數(shù)量較少，在近內(nèi)果皮維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞內(nèi)外均分布有MAC204抗體識別的抗原，近內(nèi)果皮維管束周圍大部分薄壁細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)外都分布有MAC204 抗體識別的抗原，薄壁細(xì)胞出現(xiàn)破裂現(xiàn)象（見圖6：C1～D2）。

圖6 快速膨大期果實MAC204抗體的免疫熒光分布A1-D1，A2-D2.按果實結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)的順序排列；A1.外果皮及內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)；A2.外果皮及內(nèi)部組織免疫熒光分布；B1.近外果皮維管束及周圍組織結(jié)構(gòu)；B2.近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布；C1.中部中果皮維管束及周圍組織結(jié)構(gòu)；C2.中部中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布；D1.近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織結(jié)構(gòu)；D2.近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布；下同F(xiàn)ig.6 Immunofluorescence distribution of MAC204 antibody during the rapid enlargement period A1-D1，A2-D2.According to the order of fruit structure from outside to inside；A1.Structures of exocarp and internal tissues；A2.Immunofluores?cence distribution of exocarp and internal tissues；B1.Structures of vascular bundles and surrounding tissues near exocarp；B2.Immunofluorescence distribution of vascular bundles and surrounding tissues near exocarp；C1.Structures of vascular bundles and surrounding tissues in mid mesocarp；C2.Immunofluorescence distribution of vascular bundles and surrounding tissues in mid mesocarp；D1.Structures of vascular bundles and surround?ing tissues of mesocarp near endocarp；D2.Immunofluorescence distribution of vascular bundles and surrounding tissues of mesocarp near endo?carp；The same as below

2.7 著色期果實AGPs免疫熒光分布

著色期果實外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有MAC204抗體識別的抗原綠色熒光信號分布（見圖7：A1～A2）。除空腔之外，內(nèi)部數(shù)層大型卵圓形薄壁細(xì)胞MAC204 抗體識別的抗原綠色熒光信號均主要在薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞內(nèi)部均較少分布，熒光有所減少（見圖7：A1～B2）。多個維管束相連進(jìn)而形成了多分支結(jié)構(gòu)，除空腔之外，在維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞均分布有MAC204 抗體識別的抗原（見圖7：A1～D2）。維管束周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁均分布有MAC204 抗體識別的抗原，但大部分薄壁細(xì)胞內(nèi)部無熒光信號（見圖7：A1～D2）。

圖7 著色期果實MAC204抗體的免疫熒光分布Fig.7 Immunofluorescence distribution of MAC204 antibody during the coloring period

2.8 完熟期果實AGPs免疫熒光分布

完熟期果實外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有MAC204 抗體識別的抗原綠色熒光信號（見圖8：A1～A2）。相鄰的內(nèi)部較大型的中果皮薄壁細(xì)胞MAC204 抗體識別的抗原綠色熒光信號均主要在薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞內(nèi)部均較少分布，與之前時期相比熒光明顯減少，很多細(xì)胞破裂明顯（見圖8：A1～D2）。維管束數(shù)目減少明顯，維管束排列與之前著色期相比亦無明顯變化，在中果皮中部及內(nèi)部維管束的維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部、形成層的所有細(xì)胞均分布有MAC204 抗體識別的抗原（見圖8：B1～D2）。中果皮中部和內(nèi)部維管束周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁均分布有MAC204 抗體識別的抗原，但大部分薄壁細(xì)胞內(nèi)部無綠色熒光信號（見圖8：B1～D2）。

圖8 完熟期果實MAC204抗體的免疫熒光分布Fig.8 Immunofluorescence distribution of MAC204 antibody during the maturation period

3 討論

由于βGlcY 是一種特異性結(jié)合和沉淀AGPs的合成紅棕色染料，可以與AGPs 發(fā)生特有的反應(yīng)，故而應(yīng)用于植物組織中AGPs 的定位和定量檢測。Trifunovi? 等［14］利 用βGlcY 溶 液 對 百 金 花（Centaurium erythraea）根的徒手橫切片染色處理，βGlcY 對根表皮細(xì)胞和維管組織中AGPs 強烈的染色形成紅棕色沉淀，證實了βGlcY 特異性地染色并沉淀AGPs，以此為基礎(chǔ)測定了不同組織中AGPs 的含量。除此之外，現(xiàn)有研究更多的是利用βGlcY 能與AGPs 發(fā)生特異結(jié)合的特性，對AGPs進(jìn)行分離純化［10-11］、研究AGPs 的功能及定量檢測［15］，而AGPs 的定位和分布更多采用的是免疫學(xué)的方法或技術(shù)。本試驗利用βGlcY 對AGPs 特異結(jié)合和沉淀，創(chuàng)新應(yīng)用Steedman’s wax低熔點多酯蠟切片，較系統(tǒng)地揭示了不同發(fā)育時期果實AGPs的分布特征，為AGPs的定位嘗試了新途徑。

AGPs 是細(xì)胞內(nèi)非常重要的糖蛋白，在雌雄配子體發(fā)育、花藥發(fā)育與花粉管生長、體細(xì)胞胚胎發(fā)生等方面AGPs的研究非常深入［7-8］，而果實發(fā)育中AGPs 的研究較少［9-11］。細(xì)胞壁由纖維素微纖絲與半纖維素交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)埋于無定形狀態(tài)的果膠質(zhì)中，還包括少量的AGPs 等細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白［20］。因此，細(xì)胞壁不僅決定植物細(xì)胞整體形態(tài)的重要骨架，更重要的是通過AGPs 參與多種生命活動［20］。本試驗研究表明，靈武長棗不同發(fā)育時期果實外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞，以及維管束的維管束鞘、木質(zhì)部和韌皮部所有細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部始終分布有βGlcYAGPs形成的棕紅色沉淀和MAC204抗體識別的抗原。我們認(rèn)為：第一，外果皮及相鄰的內(nèi)部數(shù)層排列緊密的中果皮小細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部持續(xù)高含量AGPs 的分布，為果實正常發(fā)育提供了保護(hù)屏障。AGPs 可能參與了細(xì)胞分裂及生長過程中纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)的組裝［21］。第二，AGPs 可能參與了木質(zhì)部細(xì)胞的生長發(fā)育，以及纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等細(xì)胞壁物質(zhì)的沉積增厚等過程。研究表明，作為一種細(xì)胞間相互作用的AGPs 分子，盡管木質(zhì)素并不是維管組織分化必需的成分，但卻發(fā)揮了維管束發(fā)育過程中細(xì)胞之間信息傳遞的功能，介導(dǎo)了木質(zhì)部導(dǎo)管的分化［22］，AGPs 的時空表達(dá)與木質(zhì)素分化相關(guān)，并且可作為形成初生木質(zhì)部起始細(xì)胞的標(biāo)志［23］。第三，維管束韌皮部為果實的生長發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)的積累提供了保障。果實膨大前期至快速膨大期，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)來滿足組織的發(fā)育和器官的建成，因而韌皮部及維管束鞘周圍細(xì)胞中分布有大量βGlcYAGPs形成的棕紅色沉淀和MAC204抗體識別的抗原，AGPs 可能從韌皮部運輸?shù)骄S管束鞘周圍細(xì)胞中，作為一種營養(yǎng)物質(zhì)為果實的持續(xù)快速生長提供了物質(zhì)保障［4］。研究表明，煙草（Nicotiana taba?cum）花粉管在花柱生長的過程中，AGPs 從引導(dǎo)組織向花粉管轉(zhuǎn)移，花柱組織AGPs 與花粉管的生長密切相關(guān)，為花粉管的生長提供營養(yǎng)支持［4］。果實維管束韌皮部及附近周圍細(xì)胞中持續(xù)高含量AGPs 的存在，以及它們主要在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中的分布特點，表明韌皮部中豐富的AGPs 可能為果實發(fā)育提供營養(yǎng)支持，AGPs 高含量的糖基是提供營養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。果實維管組織中存在大量的AGPs，為其參與果實維管組織的形成提供了一個有利的佐證，因此推測AGPs 參與了靈武長棗果實維管束發(fā)育過程的形態(tài)建成。

AGPs 不僅是果實細(xì)胞壁多糖的組分，而且可能參與了果實多糖形成和積累。研究表明，寧夏枸杞多糖屬于AGPs，是包括AGPs 在內(nèi)的一種異質(zhì)性多糖［10，12］；寧夏枸杞果實第一次快速生長期，MAC204抗體識別的熒光信號在外果皮細(xì)胞最強，中果皮薄壁細(xì)胞邊緣、維管束以及內(nèi)果皮細(xì)胞都具有較強的熒光；從緩慢生長期到第二次快速生長期，熒光主要分布在外果皮上，隨著果實發(fā)育整體AGPs 熒光強度減弱，AGPs 可能參與了寧夏枸杞發(fā)育后期果實多糖的積累［11］。與寧夏枸杞研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)，靈武長棗果實內(nèi)部的中果皮大型卵圓形薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)在膨大前期均有βGlcY-AGPs 形成的棕紅色沉淀和MAC204抗體識別的抗原分布，果實細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，而快速膨大期、著色期和完熟期果實βGlcYAGPs形成的棕紅色沉淀和MAC204抗體識別的抗原均主要分布于細(xì)胞壁上，大部分細(xì)胞內(nèi)部無分布；隨著果實發(fā)育成熟，AGPs 分布逐漸減少，細(xì)胞壁從結(jié)構(gòu)疏松進(jìn)一步發(fā)展到后期細(xì)胞壁的逐漸解體消失，而同時果實多糖含量卻顯著增高至最高［13］，說明AGPs 可能參與了靈武長棗發(fā)育后期果實多糖的積累。本課題組以往研究還發(fā)現(xiàn)，著色期至完熟期果實韌皮薄壁細(xì)胞不同形態(tài)的囊泡比較豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器的數(shù)目增多［24］。因此，根據(jù)中果皮薄壁細(xì)胞在果實發(fā)育后期，發(fā)生的質(zhì)膜內(nèi)陷形成大量囊泡和細(xì)胞壁的解體等結(jié)構(gòu)變化，以及靈武長棗果實發(fā)育后期βGlcY-AGPs 形成的棕紅色沉淀和MAC204 抗體識別的抗原分布逐漸減少，而果實多糖含量卻顯著增高至最高的研究結(jié)果［13］，推測果實多糖在AGPs 參與下可能由薄壁細(xì)胞壁解體或細(xì)胞分解形成，可能通過囊泡運輸形式從薄壁細(xì)胞壁卸出，并向果肉庫薄壁細(xì)胞或其它部位積累運輸。Leszczuk 等［9］認(rèn)為，蘋果（Malus pumila）在成熟軟化過程中觀察到的細(xì)胞壁-質(zhì)膜連續(xù)體的破壞，既與AGPs 和果膠含量的大幅下降有關(guān)，也與它們的排列重塑有關(guān)，AGPs和果膠是影響果實結(jié)構(gòu)的重要動態(tài)成分；果實成熟軟化的過程與細(xì)胞壁的重塑有關(guān)，主要是AGPs含量和果膠多糖的降低以及它們在細(xì)胞壁表面的排列方式的改變。但是，闡明調(diào)節(jié)AGPs 分布變化的機制以及與其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的關(guān)系，需要進(jìn)一步的探索，這將有助于更好地闡明AGPs 在果實品質(zhì)中的功能。

因此，各時期靈武長棗果實AGPs 的分布存在一定的差異，AGPs 可能參與了果實維管束發(fā)育過程的形態(tài)建成、為果實發(fā)育提供保護(hù)和營養(yǎng)支持及多糖物質(zhì)積累。研究結(jié)果為果實AGPs 相關(guān)研究提供了借鑒和參考，但揭示調(diào)節(jié)AGPs 分布變化的機制及其與AGPs 功能的關(guān)系，需要進(jìn)一步通過分子生物學(xué)、分析化學(xué)、超微細(xì)胞化學(xué)等方面的研究，為闡明AGPs 分布、基因表達(dá)、分子結(jié)構(gòu)與其功能和果實品質(zhì)調(diào)控間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。