PtrWRKY51基因的克隆及抗旱表達(dá)特性分析

黃安瀛 夏德安 張 洋 那冬晨 燕 青 魏志剛

（1. 國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心，北京 100091；2. 國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，湛江 524022；3. 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040；4. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041000）

植物抗逆涉及多個不同調(diào)控水平間復(fù)雜的互作過程，包括生理生化代謝調(diào)節(jié)及基因表達(dá)動態(tài)調(diào)控［1］，而基因表達(dá)調(diào)控需要轉(zhuǎn)錄因子（Transcrip?tion factor，TFs）的參與。轉(zhuǎn)錄因子作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要調(diào)控因子，能與特定DNA序列結(jié)合，能夠激活或抑制特定靶基因轉(zhuǎn)錄，對于基因表達(dá)調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的作用［2］。此外，順式作用元件在轉(zhuǎn)錄時也發(fā)揮了重要作用，最終可以抑制或增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄效率［3］。

研究表明NAC、AP2/ERF和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族均在植物應(yīng)對脅迫時發(fā)揮作用［4］。WRKY作為一種常見轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)構(gòu)上來說，含有高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域——七肽WRKYGQK 和鋅指基序［5-6］。通過家族成員包含WRKY 結(jié)構(gòu)域個數(shù)以及鋅指基序的不同類別，常被分為三類。第一類包含2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域與一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，其他兩類均只有一個WRKY 結(jié)構(gòu)域，不同的是第二類的鋅指結(jié)構(gòu)域為C2H2而第三類是C2HC［7］。從作用方式而言，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可與W-box 元件有效結(jié)合，激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，也可以與其他作用元件結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄結(jié)合蛋白的活性。從功能角度而言，多項研究［8-10］證明該家族基因在冷熱脅迫、旱澇脅迫、高鹽脅迫等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

作為研究最廣泛的TFs 家族之一，WRKY家族在 毛 果 楊（Populus trichocarpa，104 個）［11］、黃 瓜（Cucumis sativus，55 個）［12］、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana，74 個）［13］、水稻（Oryza sativa，102 個）［13］和番茄（Solanum lycopersicum，104 個）［14］等植物中均有報道。近年來，關(guān)于毛果楊WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在生物脅迫和生長發(fā)育，對于非生物脅迫研究較少。 例如，PtrWRKY18和PtrWRKY35能促進(jìn)毛果楊對生物營養(yǎng)病原菌大斑菌的抗性［15］，PtrWRKY89能增強(qiáng)毛白楊對黑斑病脅迫的耐受能力［16］，PtrWRKY73在對生物營養(yǎng)性病原菌的抗性中起著積極作用，對壞死性病原菌的抗性起著消極作用［17］。此外，PtrWRKY19參與了毛果楊次生壁形成的調(diào)控［18］，PtrWRKY25可能在木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用［19］。

本研究通過從鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序文庫中，獲得鹽脅迫響應(yīng)基因PtrWRKY51，通過生物信息學(xué)分析其理化性質(zhì)、酵母自激活活性檢測其轉(zhuǎn)錄活性，研究其亞細(xì)胞定位，以及模擬干旱脅迫條件下定量PCR，對該基因抗逆性進(jìn)行綜合分析，為毛果楊WRKY家族基因的抗逆及功能進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛果楊RNA的提取及cDNA的合成

Nisqually-1 野生型毛果楊來自中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，采用組織培養(yǎng)方法擴(kuò)繁后，在25 ℃、長日照（光照16 h 黑暗8 h）溫室中培養(yǎng)3周后選擇生長勢相似的組培苗，取材后液氮中研磨。使用擎科生物科技有限公司的多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（貨號：TSP412）提取毛果楊總RNA，TaKaRa 公司的PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：6110A）反轉(zhuǎn)錄獲得cD?NA，放置于冰箱內(nèi)-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PtrWRKY51基因的克隆

在PtrWRKY51（Potri.007G079800.1）基因序列兩端分別設(shè)計引物，由擎科生物科技有限公司合成引物PtrWRKY51-F/R（見表1）。利用東洋紡生物科技有限公司的KOD FX Neo 試劑盒克隆基因，使用OMEGA 的E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit 試劑盒對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收?；厥债a(chǎn)物連接至pClone007 Blunt Vector Kit 載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌并涂平板，次日挑取單克隆搖菌送至擎科測序，結(jié)果正確即使用E.Z.N.A.?Plasmid Maxi Kit OMEGA試劑盒提取質(zhì)粒。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3 PtrWRKY51 轉(zhuǎn)錄激活活性檢測與亞細(xì)胞定位分析

1.3.1 PtrWRKY51轉(zhuǎn)錄激活活性檢測

利 用BioEdit 軟 件，結(jié) 合pGBKT7 載 體，對PtrWRKY51的CDS 序列進(jìn)行酶切位點分析，上游引物酶切位點選用EcoRⅠ，下游選用BamHⅠ，設(shè)計載體雙酶切擴(kuò)增引物pGBKT7-PtrWRKY51-F/R。以測序正確的PtrWRKY51陽性質(zhì)粒為模板擴(kuò)增pGBKT7-PtrWRKY51目的片段。利用Trelief?SoS?oo Cloning Kit Ver.2 試劑盒將雙酶切成功的pGB?KT7 載體質(zhì)粒與目的片段連接，熱激法轉(zhuǎn)化完成后將測序正確菌液過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。

取保存于中國林業(yè)科學(xué)研究院天津林業(yè)科學(xué)研究所的Y2H 酵母菌株，參照Clontech 公司酵母雙雜交手冊進(jìn)行酵母感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化完成后各取100 μL 菌液，均勻涂布在SD/-Trp 固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)完成后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃、250 r·min-1直至OD600達(dá)到0.6～0.8；取1 mL 菌液高速離心，棄去上清后用去離子水將菌液重懸，濃縮至OD600=1.0；吸取2 μL 的pGBKT7-PtrWRKY51與pGBKT7 空載酵母菌液分別點在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/Xɑ-Gal 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中30℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長及顏色變化情況。

1.3.2 PtrWRKY51亞細(xì)胞定位

使用BioEdit 軟件對PtrWRKY51的CDS 序列進(jìn)行酶切位點分析，結(jié)合pBI121-GFP 載體，上下游均選用BamHⅠ酶切位點，設(shè)計載體單酶切擴(kuò)增引物pBI121-GFP-PtrWRKY51-F/R。以測序正確的PtrWRKY51 陽性質(zhì)粒為模板擴(kuò)增PBI121-GFPPtrWRKY51目的片段，Trelief?SoSoo Cloning Kit Ver.2 試劑盒將單酶切成功的pBI121-GFP 載體與目的片段連接。熱激法轉(zhuǎn)化完成后送測序，測序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。

凍融法將pBI121-GFP-PtrWRKY51轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，將重懸農(nóng)桿菌液注射到本氏煙草葉片背面，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d 后，使用1×PBS 稀釋到終濃度為100 ng·mL-1的DAPI 室溫染色10 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4 PtrWRKY51基因生物信息學(xué)分析

通 過NCBI 的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析PtrWRKY51的開放閱讀框；利用NCBI中的CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測PtrWRKY51的保守結(jié)構(gòu)域；使用ExPaSy 在線程序Protparam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析蛋白理化性質(zhì)。采用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行蛋白信號肽預(yù)測；通過TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使用在線程序SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred sopma.pl）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析；使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。通過MEGA6.0中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建；氨基酸多序列比對使用BioEdit進(jìn)行。從Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov）下載PtrWRKY51起始密碼子前2 000 bp的序列作為啟動子區(qū)域匯總，上傳至Plant?care網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進(jìn)行順式作用元件在線分析。

利用在線軟件STRING（https：//string-db.org/）進(jìn)行蛋白互作預(yù)測分析構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將PtrWRKY51 蛋白序列導(dǎo)入網(wǎng)站，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，探究PtrWRKY51蛋白在毛果楊中的互作關(guān)系。

1.5 PtrWRKY51基因表達(dá)模式分析

選取當(dāng)年生生長勢相似的同株系毛果楊組培苗為材料，采用8% PEG6000 水培模擬干旱脅迫，選擇0、6、12、24、48、72 h 6 個時間點，每個時間點3 個生物學(xué)重復(fù)。以Ptr-Actin基因為內(nèi)參［20］，利用TransStart Top Green qPCR SuperMix（全式金）試劑盒配制qRT-PCR 反應(yīng)液，在MJ MiniTMpersonal thermal cycler Real-time PCR 儀器上進(jìn)行試驗，反應(yīng)程序為94 ℃/30 s；94 ℃/5 s，59 ℃/15 s，72 ℃/10 s，重復(fù)40個循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束。采用2-ΔΔCT的方法［21］計算相對表達(dá)量。定量引物DL-PtrWRKY51-F/R見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrWRKY51基因的克隆

以當(dāng)年生毛果楊為材料整株研磨提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，擴(kuò)增該基因的CDS序列并測序，序列來源于（https：//phytozome.jgi.doe.gov）數(shù)據(jù)庫，得到擴(kuò)增產(chǎn)物長度為579 bp（見圖1），命名為PtrWRKY51。

圖1 PtrWRKY51基因的克隆Fig.1 Cloning of the PtrWRKY51 gene of P.trichocarpa M.Marker

2.2 PtrWRKY51 轉(zhuǎn)錄激活活性檢測與亞細(xì)胞定位分析

2.2.1 PtrWRKY51轉(zhuǎn)錄激活活性檢測

以PtrWRKY51陽性質(zhì)粒為模板，以PGBKT7-PtrWRKY51-F/R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與空載酶切產(chǎn)物連接后熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用Omega 質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行菌液PCR 鑒定后送公司測序。測序結(jié)果表明，成功擴(kuò)增到目的片段。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SD/-Trp培養(yǎng)基中pGBKT7空載酵母與pGBKT7-PtrWRKY51均能正常生長出白色菌落，而在SD/-Trp/-His/-Ade/X-ɑ-Gal三缺培養(yǎng)基上只有pG?BKT7-PtrWRKY51菌落及正對照能夠正常生長且變藍(lán)（見圖2）。表明PtrWRKY51具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

圖2 PtrWRKY51的激活活性分析結(jié)果Fig.2 Analysis of activity test of PtrWRKY51

2.2.2 亞細(xì)胞定位分析

將PtrWRKY51構(gòu)建到帶有GFP 標(biāo)簽的植物表達(dá)載體中，得到含有pBI121-GFP-PtrWRKY51片段的質(zhì)粒。質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，注射本氏煙草，利用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布。結(jié)果顯示：pBI121-GFP 空載在細(xì)胞膜與細(xì)胞核均可看到綠色熒光；pBI121-GFP-PtrWRKY51只能在細(xì)胞核觀察到綠色熒光，定位于細(xì)胞核中（見圖3）。

圖3 PtrWRKY51基因的亞細(xì)胞定位PBI121-GFP-PtrWRKY51.融合蛋白和GFP 蛋白在煙草葉片細(xì)胞中的定位情況；GFP.綠色熒光信號；DAPI. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，與DNA強(qiáng)力結(jié)合的一類熒光染料；Light.明場信號；Merge.疊加信號Fig.3 Subcellular Localization of PtrWRKY51 gene PBI121-GFP-PtrWRKY51.Localization of fusion proteins and GFP proteins in tobacco leaf cells；GFP.Green fluorescent signal；DAPI. 4'，6-diami?dine-2-phenylindole，a class of fluorescent dyes strongly bound to DNA；Light.Bright field signal；Merge.Merges signals

2.3 PtrWRKY51基因生物信息學(xué)及進(jìn)化樹分析

2.3.1 PtrWRKY51基因理化信息

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明PtrWRKY51 包括2 973 個原子，分子式為C947H1439N267O309S11，相對分子質(zhì)量為21.86 kDa。編碼氨基酸全長為192 aa，在307～477 bp 處含有WRKY 結(jié)構(gòu)保守域，包含57個氨基酸（見圖4）。組成蛋白的氨基酸中，絲氨酸（Ser）所占比例最高，為14.6%，色氨酸（Trp）所占比例最低，占1.6%，不含硒半胱氨酸（Sec）和吡咯賴氨酸（Pyl）。該蛋白等電點為7.63，不穩(wěn)定系數(shù)為50.70，平均親水系數(shù)為-1.006，脂肪指數(shù)為44.64，推測該蛋白為不穩(wěn)定親水的堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示基因定位于細(xì)胞核，與試驗結(jié)果一致。

圖4 PtrWRKY51基因序列及預(yù)測的保守域Fig.4 Sequence and predicted conserved domain of PtrWRKY51 gene

2.3.2 PtrWRKY51蛋白的二級結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)（見圖5），PtrWRKY51 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)卷曲（69.79%）、延伸鏈（14.06%）、α-螺旋（11.46%）和β-折疊（4.69%）組成。對蛋白進(jìn)行預(yù)測沒有發(fā)現(xiàn)信號肽存在，是不存在典型的跨膜螺旋區(qū)的非跨膜蛋白。

圖5 PtrWRKY51蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of secondary structure of PtrWRKY51 protein

2.3.3 物種間進(jìn)化關(guān)系比對

從NCBI檢索與PtrWRKY51同源度高的同源基因，選取前11個構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（見圖6）。分析結(jié)果顯示：WRKY51同源基因在草本植物和木本植物基因在進(jìn)化中處于不同分支上，毛果楊與胡楊進(jìn)化關(guān)系最近，與西葫蘆和水稻最遠(yuǎn)。毛白楊、胡楊、毛果楊、烏蘇里楊與加州白櫟均含有6個基序，而陸地棉最少，只有1個基序。保守結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列分析結(jié)果顯示這些基因含有一個共同的WRKY保守結(jié)構(gòu)域（見圖6～7），且木本植物與擬南芥中的同源基因保守區(qū)域內(nèi)β1（WRKYGKK）、β2（PRNYYKC）和β3（KKRVE）序列是絕對保守的，推測這些基因可能在某些方面具有相似作用。

圖6 同源基因蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及基序比對Fig.6 Phylogenetic tree and motif alignment of homologous gene proteins

圖7 同源基因氨基酸序列比對Fig.7 Alignment of amino acid sequence of homologous genes

2.3.4 啟動子區(qū)順式作用元件分析

為了解PtrWRKY51基因可能的生物學(xué)功能和調(diào)控特性，利用PlantCARE 對其進(jìn)行啟動子分析。結(jié)果表明：PtrWRKY51前2 000 bp啟動子區(qū)域內(nèi)除啟動子的基本轉(zhuǎn)錄原件TATA-box、CAAT-box及光響應(yīng)元件外，還有部分非生物脅迫響應(yīng)元件與植物激素響應(yīng)元件。

值得注意的是，PtrWRKY51啟動子區(qū)域內(nèi)包含的非生物脅迫響應(yīng)元件與植物激素響應(yīng)元件（見表2）數(shù)量由高到低分別為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif 和TGACG-motif）、ABA 應(yīng)答元件（ABRE）、抗病和脅迫誘導(dǎo)元件（TC-rich repeats）、水楊酸誘導(dǎo)元件（TCA-element）和厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）。

表2 PtrWRKY51基因啟動子區(qū)域的各順式作用元件Table 2 Analysis of cis acting elements in PtrWRKY51 genes promoter region

2.3.5 PtrWRKY51蛋白互作預(yù)測分析

蛋白互作預(yù)測結(jié)果顯示（見圖8），PtrWRKY51蛋白不但與WRKY 家族自身成員之間，如Potri.007G079800（PtrWRKY16）、Potri.013G090300（PtrWRKY77）等發(fā)生互作，還與Potri.001G086400（Dof36）、Potri.003G144500（Dof31）、Potri.005G131600（Dof34）、Potri.007G036400（Dof23）等Dof（DNAbinding One Zinc Finger）轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行互作，預(yù)示PtrWRKY51 與這些蛋白在功能上可能有一定關(guān)聯(lián)。

圖8 PtrWRKY51蛋白互作預(yù)測Fig.8 Predict and analysis of the interacting protein of WRKY51 in P.trichocarpa

2.4 PtrWRKY51基因表達(dá)模式分析

以脅迫0 h 的PtrWRKY51在毛果楊根部中的表達(dá)量為1，分別檢測8% PEG6000 脅迫后6 個時間段毛果楊在根、莖、葉中的PtrWRKY51基因表達(dá)量（見圖9）。分析結(jié)果表明脅迫后PtrWRKY51基因在毛果楊根、莖、葉中的相對表達(dá)量總體呈先降低再升高后降低的趨勢，莖部變化量最為明顯，脅迫12 h 后莖部（37.0）與葉部（27.7）表達(dá)量達(dá)到最大值，而根部則在24 h達(dá)到最大值（8.1）。

圖9 8%PEG6000脅迫處理下不同時間段的組織特異性表達(dá)不同字母表示P<0.05水平顯著Fig.9 Tissue specific expression in different time periods under 8%PEG6000 stress Different letter stand for significant differences at P<0.05

3 討論

植物在生長中會不可避免受到各種生物脅迫與非生物脅迫，而植物本身無法移動，只能通過自身的防御機(jī)制來抵御外界脅迫。TFs 作為基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，在這些機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，已有多種轉(zhuǎn)錄因子被證實參與不同種類植物對生長發(fā)育、防御調(diào)控和脅迫反應(yīng)的調(diào)控［22-23］，WRKY 作為植物中最大的TFs 家族之一，也被證明在這些過程中發(fā)揮重要作用［7，24］。

本研究克隆獲得PtrWRKY51基因，屬Ⅱc 型WRKY轉(zhuǎn)錄因子，與胡楊（XM_011027286）進(jìn)化關(guān)系最近。通過酵母自激活試驗，證明PtrWRKY51轉(zhuǎn)錄因子具有自激活活性，亞細(xì)胞定位試驗證明該基因位于細(xì)胞核中。啟動子區(qū)順式作用元件分析結(jié)果顯示，區(qū)域內(nèi)含有眾多脅迫應(yīng)答元件。植物遭受干旱時會導(dǎo)致脫落酸（ABA）快速積累，PtrWRKY51啟動子區(qū)域內(nèi)包含的4 個ABA 應(yīng)答元件可能與其密切相關(guān)。此外，該基因還含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件及水楊酸誘導(dǎo)元件，這些元件的存在表明毛果楊與擬南芥的WRKY51基因可能通過相似途徑，即通過調(diào)控水楊酸和低油酸從而抑制茉莉酸產(chǎn)生，進(jìn)而在植物抗逆方面發(fā)揮重要作用［25］。同時，番茄的SlWRKY51基因與油菜素（蕓苔素）內(nèi)酯的增加呈正相關(guān)；山新楊（Populus da?vidiana×P. albavar.pyramidlis）的PdPapWRKY51在各組織中均響應(yīng)水楊酸的誘導(dǎo)，在不同生物及非生物因素誘導(dǎo)下各組織表達(dá)量呈現(xiàn)較大差異［26］。以上研究均說明WRKY51轉(zhuǎn)錄因子通過對植物各種激素，如赤霉素、茉莉酸、油菜素類固醇和乙烯等表達(dá)量的調(diào)控進(jìn)而對其生長發(fā)育及抗逆方面進(jìn)行調(diào)控，推測PtrWRKY51可能也通過對激素的調(diào)控從而進(jìn)一步對脅迫進(jìn)行反饋。

模擬干旱下基因表達(dá)量有明顯變化，在莖與葉中被明顯誘導(dǎo)上調(diào)，進(jìn)一步表明PtrWRKY51可能參與了毛果楊在應(yīng)對滲透脅迫時的信號傳導(dǎo)。植物在面臨各種非生物脅迫時會產(chǎn)生活性氧（ROS），從而阻礙植物的正常生長發(fā)育，為應(yīng)對脅迫，植物會積累如脯氨酸、甘氨酸甜菜堿、多胺和糖等滲透劑來保護(hù)細(xì)胞，防止氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。滲透劑的積累受到植物激素如脫落酸、ABA、乙烯、茉莉酸和水楊酸的調(diào)節(jié)，這些激素之間互相有協(xié)同拮抗作用最終會抑制有害ROS的產(chǎn)生［25，27］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在許多植物中被證明參與了干旱脅迫的調(diào)控。轉(zhuǎn)紅薯（Ipomoea batatas）IbWRKY2基因的擬南芥在鹽及干旱脅迫下通過激活A(yù)BA 途徑及ROS 清除系統(tǒng)對脅迫進(jìn)行調(diào)控［28］；大豆（Glycine max）的GmWRKY16基因通ABA 介導(dǎo)途徑增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽與耐干旱能力［29］；小麥（Triticum aestivum）TaWRKY46通過ABA 依賴途徑及ABA 不依賴途徑共同提升耐旱性［30］；玉米（Zea mays）ZmWRKY40基因通過提高過氧化物歧化酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性降低轉(zhuǎn)基因株系活性氧（ROS）含量進(jìn)而對干旱脅迫進(jìn)行調(diào)控［31］；香蕉（Musa acuminata）的MaWRKY80調(diào)節(jié)NCEDs 表達(dá)來控制ABA 水平，通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來調(diào)節(jié)ROS 的積累，從而起到抗干旱脅迫正向調(diào)節(jié)的作用［32］。這些研究均表明WRKY家族成員可以對ABA 及ROS 系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控來應(yīng)對干旱脅迫。根據(jù)已有研究，推測PtrWRKY51可能通過水楊酸、茉莉酸及ABA 之間的協(xié)同拮抗作用增強(qiáng)滲透劑的累積，從而降低或抑制ROS的生成，進(jìn)而對干旱脅迫進(jìn)行反饋。

本研究初步證明PtrWRKY51具有一定的抗旱能力，目前已成功構(gòu)建過表達(dá)載體與抑制表達(dá)載體，后續(xù)將對該基因在楊樹中發(fā)揮的作用與調(diào)控機(jī)制進(jìn)行具體研究。研究不僅為毛果楊WRKY51基因在生物學(xué)及抗旱研究提供理論基礎(chǔ)，同時也可為進(jìn)一步揭開毛果楊抗逆分子機(jī)制提供更多的數(shù)據(jù)支撐。