響應(yīng)鹽脅迫調(diào)控的露地菊miR398a的克隆及功能研究

岳莉然 劉穎婕 劉晨旭 周蘊(yùn)薇

（1. 東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 德州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，德州 253000；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118）

植物microRNAs 是一類長(zhǎng)度為20～24 nt 的非編碼小RNA，能控制mRNA 降解或抑制其翻譯，通常在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用［1］。miRNA 控制了多種生物和代謝途徑中眾多基因的表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)非生物脅迫中扮演著重要角色，尤其在植物響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［2］。例如：miR164 通過(guò)靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子使其增加側(cè)根數(shù)量來(lái)平衡植物對(duì)水分的吸收［3］；miR393 通過(guò)提高種子萌發(fā)時(shí)的激素含量，從而提高種子的耐鹽性［4］；擬南芥（Arabidopsis thali?ana）中的miR171 和miR396 能夠通過(guò)改變植株形態(tài)來(lái)抵御鹽脅迫［5］；過(guò)量表達(dá)osa-miR319a 能夠增加水稻（Oryza sativa）的耐鹽性［6］；在高鹽脅迫下，玉米（Zea mays）中上調(diào)表達(dá)的miR159 調(diào)控ABA信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程，進(jìn)而抵抗鹽脅迫［7］。

miR398 是一類多數(shù)為21 nt 組成的miRNA［8］，在 擬 南 芥 中miR398 家 族 包 括-a、-b 和-c 3 類 成員［9］。miR398 作為一種保守的miRNA 廣泛存在于植物中，并在非生物脅迫中扮演著重要的角色［10］。在鹽脅迫下，miR398 在擬南芥［11］、煙草（Ni?cotiana tabacum）［12］、番 茄（Lycopersicon esculen?tum）［13］等植物中均顯著下調(diào)表達(dá)；熱脅迫和SO2都能誘導(dǎo)miR398a 表達(dá)量降低［14-15］。miR398 通過(guò)降低靶基因的表達(dá)量來(lái)抵御活性氧的毒害，進(jìn)而增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫的能力［16］。在擬南芥中，miR398 能通過(guò)剪切靶基因CSD轉(zhuǎn)錄出的mRNA降低植株耐熱性［14］；在臭氧、鹽害等非生物脅迫下，擬南芥能夠抑制miR398 的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)相應(yīng)靶基因使其抵抗脅迫［17］；miR398 與CSD的結(jié)合還可以控制生物體內(nèi)銅元素水平的自我平衡［18］。

露地菊（Chrysanthemum×grandiflora）是在引種地被菊的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)天然雜交、衛(wèi)星搭載后選育的一個(gè)新的地栽小菊品種群［19］，因其抗性強(qiáng)、易管理、花繁茂等特點(diǎn)成為了秋季景觀營(yíng)造中非常重要的一類植物材料。本課題組前期通過(guò)對(duì)鹽脅迫前后的露地菊‘紐9717’miRNAs 進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)露地菊miR398 家族成員miR398a 呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)。為探究露地菊miR398a 在非生物脅迫過(guò)程中的功能和作用機(jī)制，本研究對(duì)miR398a前體和靶基因進(jìn)行分析，克隆miR398a 前體并構(gòu)建植物表達(dá)載體，獲得過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a 轉(zhuǎn)基因擬南芥并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。這為miR398a 在露地菊的表達(dá)特性及功能的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院組培室培養(yǎng)的露地菊‘紐9717’植株，移栽后用60 mL 的200 mmol·L-1NaC1 溶液進(jìn)行澆灌，以澆灌蒸餾水的植株為對(duì)照，處理12 h，用于檢測(cè)基因的表達(dá)量變化。擬南芥為哥倫比亞野生型。

1.2 試劑

DNA 提取試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T 載體購(gòu)自TOYOBO 公司，DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，大腸桿菌DH5α 購(gòu)自維地生物公司，pBI121 MCS-GFP 載體、限制性內(nèi)切酶和根瘤農(nóng)桿菌為東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 miRNA前體序列的擴(kuò)增

以露地菊葉片為試驗(yàn)材料，從課題組前期測(cè)序所得露地菊sRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到該miRNA 的前體cgr-MIR398a 序列及成熟體cgr-miR398a 序列。通過(guò)Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物cgr-MIR398a-F、cgr-MIR398a-R（見表1），以露地菊葉片DNA 為模板進(jìn)行PCR 并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，送生物公司測(cè)序。

表1 PCR引物堿基序列Table 1 List of PCR primer sequences

1.3.2 生物信息學(xué)分析

利 用 在 線 軟 件RNAfoldWebSever（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）進(jìn)行miRNA 前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，WebLOGO（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）對(duì)miRNA 成熟序列的堿基保守性進(jìn)行分析。從公共數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase（22.1 版）（http：//www.mirbase.org/）下載已登錄的所有植物的miR398a 成熟序列及前體序列，用MEGA 6.0 軟件Neighbor-Joining 法構(gòu)建基于miRNA 前體的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 靶基因預(yù)測(cè)

利用課題組前期測(cè)序所得露地菊降解組數(shù)據(jù)庫(kù)原始數(shù)據(jù)，使用CleaveLand 4.0 程序［20］和AC?GT301-DGEv1.0程序（聯(lián)川生物）預(yù)測(cè)cgr-MIR398a靶基因。根據(jù)植物miRNA/靶標(biāo)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)［21］，對(duì)列陣進(jìn)行評(píng)分，繪制T-plot圖。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析

采用RNA 試劑盒提取長(zhǎng)勢(shì)良好的露地菊葉、根和擬南芥葉片的總RNA，使用miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用miR398a 的成熟體cgr-miR398a-F 和試劑盒通用下游引物為上下游引物，以U6為內(nèi)參基因（見表1）進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)。參照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用NCBI 在線工具Primer-BLAST 設(shè)計(jì)靶基因的上下游引物，以CmEF1a基因［22］作為內(nèi)參（見表1）進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)，所有試樣重復(fù)3 次。蒸餾水作為對(duì)照，每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。參照2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ，擎科）說(shuō)明書，采用2-??CT方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和擬南芥的轉(zhuǎn)化篩選

使用基因特異性引物cgr-MIR398aM-F 和cgr-MIR398aM-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用KpnⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，過(guò)夜轉(zhuǎn)化，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，送公司測(cè)序。將鑒定正確的重組載體pBI121-cgr-MIR398a-GFP 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。利用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲種子后用含50 mg·L-1Kana 的1/2 MS 培養(yǎng)基逐代篩選，直至獲得cgr-MIR398a 過(guò)表達(dá)擬南芥純合體植株。以pBI121載體的上下游引物PBI121-GFP-F 和PBI121-GFP-R（見表1）進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并對(duì)cgr-miR398a的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 cgr-MIR398a 轉(zhuǎn)基因擬南芥響應(yīng)鹽脅迫的表型及生理檢測(cè)

將擬南芥野生型和T3 代純合轉(zhuǎn)基因種子消毒后，分別種于含0、75、100、150 mmol·L-1NaCl 的MS固體培養(yǎng)基中，冰箱內(nèi)4 ℃春化3 d后置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胚根伸出種皮作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算培養(yǎng)7 d的發(fā)芽率。

將擬南芥野生型和T3 代純合轉(zhuǎn)基因種子消毒后接種于MS 固體培養(yǎng)基，冰箱內(nèi)4 ℃春化3 d后置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出2 片真葉后上盆，正常生長(zhǎng)4 周后進(jìn)行脅迫，處理組植株每2 d 澆灌200 mmol·L-1NaCl 溶液50 mL，對(duì)照組澆灌等量清水，取脅迫9 d 的擬南芥植株測(cè)定超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性［23］、過(guò)氧化氫含量（分光法，蘇州科銘）和超氧陰離子含量（分光法，蘇州科銘）。進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，使用GraphPad prism 8.0進(jìn)行多重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 露地菊miR398a前體克隆

以露地菊葉片DNA 為模板，使用前體序列cgr-MIR398a 上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果表明在200 bp 左右的位置有一條特異性條帶（見圖1）。DNA 測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)所得露地菊miR398a前體序列一致。

圖1 露地菊miR398a前體PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000；1.cgr-MIR398aFig.1 PCR result of cgr-MIR398a in Chrysanthemum×grandiflora M.DL2000；1.cgr-MIR398a

2.2 植物miR398a前體的進(jìn)化特性

對(duì)已知的22個(gè)物種及露地菊的miR398a前體序列構(gòu)建進(jìn)化樹。裸子植物挪威云杉（Picea excel?sa）與雙子葉植物甜橙（Citrus sinensis）聚集于同一分支，單子葉植物水稻和玉米分別與不同的雙子葉植物聚成分支，這說(shuō)明MIR398a 的進(jìn)化特性與現(xiàn)有的植物形態(tài)學(xué)分類并不完全一致。露地菊cgr-MIR398a 與毛茛科的耬斗菜（Aquilegia coeru?lea）aqc-MIR398a 的相似度較高（見圖2）。推測(cè)露地菊miR398a的進(jìn)化特性與耬斗菜接近。

圖2 基于miR398a前體序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of pre-miR398a

2.3 露地菊miR398a 前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及成熟序列保守性分析

利用RNAfold WebSever 對(duì)露地菊miR398a 前體序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明露地菊miR398a前體能形成典型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，序列的結(jié)構(gòu)最小自由能dG 值為-196.39 kJ·mol-1。其中miR398a的成熟體序列在莖部結(jié)構(gòu)的5′端和3′端，且在最后一個(gè)堿基位置其保守性最低（見圖3）。對(duì)已知miR398a成熟序列的堿基保守性進(jìn)行分析，結(jié)果表明植物miR398a-3p端的成熟序列的堿基保守性較強(qiáng)且整體高于5p 端，miR398a-5p 只在第1、2、6 和13 位的堿基保守性較強(qiáng)且都偏好鳥嘌呤（G）（見圖4）。

圖3 露地菊miR398a前體二級(jí)結(jié)構(gòu)及前體保守性示意圖A.紅色紅框內(nèi)為cgr-miR398a 的成熟體序列；B.不同顏色代表其保守性程度，紅色表示保守程度最高，藍(lán)色表示保守程度最低Fig.3 The pre-miR398a sequences and the conserved nucleotide sequence of pre-miR395a in Chrysanthemum×grandiflora A.Mature miR395a sequence is showed with the red square；B.Differ?ent colors represent the conservative degrees，and the red is the most conservative，the blue is the lest conservative

圖4 miR398a-3p和miR398a-5p成熟序列堿基保守性A.miR398a-3p；B.miR398a-5pFig.4 Conservative analysis of nucleotides in miR398a-3p and miR398a-5p A.miR398a-3p；B.miR398a-5p

2.4 露地菊miR398a靶基因預(yù)測(cè)

利用露地菊根和葉降解組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行miR398a靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在露地菊根和葉中共預(yù)測(cè)得到18 個(gè)靶基因，其中葉中有11 個(gè)靶基因，根中有12 個(gè)靶基因。有5 個(gè)靶基因在根和葉中被共同靶向，包括硫醇酶基因、銅-鋅超氧化物歧化酶基因和銅伴侶蛋白基因等。在葉中單獨(dú)檢測(cè)到的靶基因有葉綠體酶2 基因、DNAJ 熱激蛋白家族基因等；在根中被單獨(dú)靶向的基因包括含有糖苷水解酶，含催化域蛋白、PH、RCC1和FYVE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)1樣異構(gòu)體X3等（見表2）。miR398a在葉和根中的靶基因不完全一致，表明miR398a在植物不同組織中行使的功能存在差異。

表2 露地菊miR398a靶基因預(yù)測(cè)Table 2 Target genes of cgr-miR398a of Chrysanthemum×grandiflora

2.5 露地菊在鹽脅迫下miR398a 及靶基因在根和葉中的相對(duì)表達(dá)量

鹽脅迫下，露地菊miR398a-3p 在根和葉中都顯著下調(diào)，而葉中miR398a-5p 表達(dá)量在鹽處理前后沒(méi)有顯著變化，但在根中變化顯著（見圖5：A～B）。選取罰分較低且T-plot 峰值較單一的靶基因（CSD2、CCS、SAP8）驗(yàn)證其鹽脅迫前后的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，CSD2、CCS、SAP8在鹽脅迫下，在根和葉中都有不同程度的上調(diào)（見圖5：C～E）。

圖5 在鹽處理下露地菊的根和葉miR398a和靶基因的相對(duì)表達(dá)量A.miR398a-3p；B.miR398a-5p；C.CSD2（TRINITY_DN123102_c0_g2）；D.CCS（TRINITY_DN96068_c0_g2）；E.SAP8（TRINITY_DN94774_c3_g5）Fig.5 Relative expression levels of miR398a and target genes in leaf and root of Chrysanthemum×grandiflora under salt stress A.miR398a-3p；B.miR398a-5p；C.CSD2（TRINITY_DN123102_c0_g2）；D.CCS（TRINITY_DN96068_c0_g2）；E.SAP8（TRINITY_DN94774_c3_g5）

2.6 露地菊miR398a 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

使用基因特異性引物擴(kuò)增cgr-MIR398a，回收并連接至pMD18-T，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-cgr-MIR398a。用KpnⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶，對(duì)pMD18-T-cgr-MIR398a 質(zhì)粒和pBI121 MCS-GFP（啟動(dòng)子為35 S）空載體質(zhì)粒分別雙酶切后，用T4 連接酶連接獲得重組質(zhì)粒，命名為pBI121-cgr-MIR398a-GFP。雙酶切檢測(cè)結(jié)果表明重組質(zhì)粒被切開，目的片段長(zhǎng)度在220 bp 左右（見圖6A）。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，目的條帶符合通用引物長(zhǎng)度，說(shuō)明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中（見圖6B）。

圖6 pBI121-cgr-MIR398a-GFP雙酶切鑒定（A）和農(nóng)桿菌重組菌落PCR鑒定（B）M.DL2000 DNA Marker；0.pBI121-cgr-MIR398a-GFP；1.陰性對(duì)照；2、4～10.單菌落Fig.6 Double digestion of pBI121-cgr-MIR398a-GFP（A）and PCR identification of agrobacterium recombinant plas?mid（sB）M.DL2000 DNA Marker；0.pBI121-cgr-MIR398a-GFP；1.Negative control；2，4-10.Single colony

2.7 轉(zhuǎn)cgr-MIR398a 基因擬南芥植株的鑒定及表達(dá)分析

經(jīng)Kana 抗性培養(yǎng)基篩選，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片為綠色且生長(zhǎng)良好（見圖7A）。PCR鑒定結(jié)果表明已成功轉(zhuǎn)入外源cgr-MIR398a（見圖7B）。對(duì)成熟cgr-miR398a 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析表明，cgr-MIR398a在轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中表達(dá)量顯著高于野生型。說(shuō)明整合到擬南芥基因組中cgr-MIR398a經(jīng)剪切可以加工成為成熟的cgr-miR398a（見圖8A），轉(zhuǎn)基因擬南芥中At2g28190（CSD2）和At1g12520（CCS）的相對(duì)表達(dá)量低于野生型（見圖8B）。

圖7 過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a擬南芥抗性篩選（A）與PCR驗(yàn)證（B）M.DL2000 DNA marker；1.重組質(zhì)粒；2.野生型擬南芥；3.陰性對(duì)照；4～10.轉(zhuǎn)基因植株Fig.7 Resistance screening（A）and PCR verification（B）of Arabidopsis thaliana overexpressing cgr-MIR398a M.DL2000 DNA marker；1.Recombinant plasmid；2.Wild-type Arabidopsis；3.Negative control；4-10.Transformed plant

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥miR398a及靶基因的表達(dá)水平WT.野生型；1～7，OE.轉(zhuǎn)基因株系；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.01；下同F(xiàn)ig.8 Expression analysis of miR398a and target genes in transgenic Arabidopsis WT.Control；1-7，OE.Transgenic Arabidopsis；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.01；The same as below

2.8 過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a 轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

2.8.1 鹽脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程的影響

選取表達(dá)量高的3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別命名為OE-1、OE-2、OE-3，對(duì)其進(jìn)行表型和生理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，不含NaCl 的MS 培養(yǎng)基中，野生型WT 和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的發(fā)芽率均為100%；隨著鹽濃度增加，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。100 mmol·L-1NaCl 處理下，OE-1、OE-2、OE-3 的發(fā)芽率與WT 相比均下降；150 mmol·L-1NaCl 處理時(shí)，WT的發(fā)芽率依舊能維持60%左右，而轉(zhuǎn)cgr-MIR398a基因南芥發(fā)芽率僅為15%左右（見圖9）。

圖9 過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a擬南芥在不同鹽濃度處理下的發(fā)芽率WT.野生型株形；OE-1/2/3.轉(zhuǎn)基因株系；下同F(xiàn)ig.9 Germination rates of Arabidopsis overexpressing cgr-MIR398a under different salt concentrations WT.Control；OE-1/2/3.Transgenic Arabidopsis；The same as below

2.8.2 鹽脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型的影響

對(duì)生長(zhǎng)狀況一致的擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽脅迫處理。脅迫6 d 時(shí)野生型和轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)良好、葉片顏色鮮綠；脅迫9 d 時(shí)野生型葉片邊緣輕微枯黃，轉(zhuǎn)基因葉片變軟并出現(xiàn)失水現(xiàn)象；脅迫12 d 時(shí)野生型葉片開始失水萎蔫，而轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)出現(xiàn)單株死亡現(xiàn)象（見圖10）。因此，鹽脅迫處理時(shí)轉(zhuǎn)基因株系受鹽害程度顯著高于野生型。

圖10 過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a擬南芥在200 mmol·L-1 NaCl處理下的形態(tài)特征Fig.10 Morphological characteristics of Arabidopsis overexpressing cgr-MIR398a under 200 mmol·L-1 NaCl treatment

2.8.3 過(guò)表達(dá)cgr-MIR398a 轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫后的生理指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)生長(zhǎng)狀況一致的擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽脅迫，9 d 后檢測(cè)SOD、POD 酶活性和超氧陰離子（OFR）、過(guò)氧化氫（H2O2）含量。結(jié)果表明，脅迫后野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的SOD、POD 活性均增加，且野生型SOD、POD 活性均顯著高于轉(zhuǎn)基因擬南芥，（見圖11：A～B）。OFR 和H2O2含量測(cè)定結(jié)果表明，在脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的OFR和H2O2含量均增加且高于野生型（見圖11：C～D）。

圖11 轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫后的生理指標(biāo)檢測(cè)Fig.11 Physiological indicators of transgenic Arabidopsis thaliana under salt stress

3 討論

miRNA 普遍存在于植物體中，主要通過(guò)剪切靶基因或抑制靶基因蛋白翻譯，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生理過(guò)程進(jìn)行調(diào)控［24-25］。本研究對(duì)植物miR398a 成熟體序列進(jìn)化分析得出miR398a 廣泛存在于植物中且高度保守。露地菊miR398a 雖有少量堿基差異，但并不影響前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，且miR398a 在進(jìn)化過(guò)程中并沒(méi)有改變其在CSD的mRNA 上的靶點(diǎn)［11］，因此在非生物脅迫下cgr-miR398 具有與其他植物相似的調(diào)節(jié)作用。qRT-PCR 結(jié)果表明在鹽脅迫下，露地菊的根和葉中miR398a 表達(dá)水平存在差異，可能是應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)植株不同部位表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)［26］。相同組織部位下，露地菊miR398a的3′端和5′端的表達(dá)也存在差異，這與對(duì)紫花苜蓿（Medicago sativa）的研究結(jié)果［27］一致。有研究發(fā)現(xiàn)在RISC成熟過(guò)程中雙鏈miRNA/miRNA*雙鏈伴隨Argonaute（AGO）蛋白，其中一條鏈被催化去除，另一條與靶點(diǎn)結(jié)合并引導(dǎo)沉默［28］。推測(cè)葉中miR398a-5p 的表達(dá)量在鹽脅迫前后沒(méi)有顯著改變可能因?yàn)閙iR398a-5p 在葉中裂解，發(fā)揮作用的是miR398a-3p。

抵抗鹽脅迫時(shí)，miRNA 的功能主要通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。通過(guò)降解組測(cè)序得到的miR398a 的靶基因有葉綠體中的銅/鋅超氧化物歧化酶基因（CSD2）、銅伴侶蛋白基因（CCS）。擬南芥的miR398 能夠通過(guò)靶向CSD2來(lái)清除活性氧、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而抵抗鹽害［29］。而CCS 能夠傳遞銅離子到CSD 中，影響CSD的表達(dá)［28］。推測(cè)露地菊miR398a 可能通過(guò)相同的途徑響應(yīng)脅迫。qRT-PCR 驗(yàn)證了露地菊的根和葉中CSD2和CCS在鹽脅迫12 h 后上調(diào)。此外，靶基因還預(yù)測(cè)到了A20/AN1-l 鋅指家族蛋白（SAP）基因。SAP基因涉及脅迫應(yīng)答，能參與種子萌發(fā)和抵御多種非生物脅迫［30-31］。在鹽脅迫下SAP8也上調(diào)表達(dá)，但二者匹配度相對(duì)其他成員較差，因此二者是否真的是穩(wěn)定的miRNA-靶基因匹配關(guān)系仍待后續(xù)研究。

鹽脅迫下，野生型擬南芥發(fā)芽率和生長(zhǎng)情況均優(yōu)于cgr-miR398a 轉(zhuǎn)基因植株。200 mmol·L-1NaCl脅迫12 d后，野生型擬南芥失水萎蔫，而轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片處于半枯黃狀態(tài)且出現(xiàn)單株死亡現(xiàn)象。ORF 和H2O2是可以造成氧毒害的活性氧（ROS），具有強(qiáng)氧化性，其含量過(guò)高會(huì)損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低植物抵御逆境脅迫的能力［32］。抗氧化酶SOD 和POD 能有效清除ROS，在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用［33-34］。脅迫后，轉(zhuǎn)基因植株的OFR 和H2O2積累顯著高于野生型，SOD 和POD的活性卻顯著低于野生型，說(shuō)明過(guò)表達(dá)的cgr-MIR398a 可能通過(guò)靶向CSD從而降低靶基因的表達(dá)，進(jìn)而降低植物清除ROS的能力，使植株收到的鹽脅迫損傷加重。綜上，cgr-miR398a 在擬南芥的幼苗期和成苗期均減弱了植物的耐鹽能力，且在擬南芥響應(yīng)鹽脅迫中起著負(fù)調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究對(duì)露地菊測(cè)序獲得的cgr-miR398a 進(jìn)行分析、靶基因預(yù)測(cè)，并確定miR398a 在擬南芥中過(guò)表達(dá)會(huì)造成植物體對(duì)鹽脅迫更加敏感。此研究將為進(jìn)一步揭示露地菊cgr-miR398a 在生長(zhǎng)發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。