火焰木花的色素提取條件優(yōu)化及色素在楊桃果汁中的穩(wěn)定性

宋宗仁 ,于惠竹 ,王兵麗 ,張國廣 ,鄒金美*

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000；2.閩臺(tái)特色園林植物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建漳州 363000）

火焰木（Spathodea campanulata）又名火焰樹、郁金香樹，為紫葳科火焰木屬常綠喬木，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，原產(chǎn)自非洲，現(xiàn)我國廣東、廣西、福建和臺(tái)灣等省都有廣泛種植[1].研究表明火焰木的樹皮、葉片和花的提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎癥等藥理作用[2-7]，是一種觀賞和食藥用兼具的園林植物，但因其是近年來從國外引種而來，國內(nèi)對(duì)該植物的研究還較少，國內(nèi)的文獻(xiàn)多在報(bào)道引種栽培的適應(yīng)性觀察和組織培養(yǎng)等方面[1,8-9]，對(duì)其有效成分分離和食用藥用等研究還較少[10].火焰木花的花色猩紅，形同火焰，花形大，花冠外面為紅色、內(nèi)面為黃色，開花時(shí)花朵多且密集[1]，花中富含生物堿、皂苷、糖苷類、類黃酮、三萜和單寧等成分[3-5,10-11]，其花提取的色素可以作為染料使用[12]，花的呈色物質(zhì)主要是花色苷[13].本研究擬探討火焰木的花中色素的提取條件優(yōu)化及其在楊桃果汁中的應(yīng)用，為火焰木花的色素在食用或藥用等方面提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火焰木的新鮮花朵，采自閩南師范大學(xué)校內(nèi)火焰木樹上.無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、鹽酸等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.新鮮楊桃購自超市.

1.2 儀器設(shè)備

本研究用到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備Tab.1 Instruments and equipment used in the experiment

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 火焰木花的色素的最大吸收波長測(cè)定

稱取5 g 新鮮的火焰木花樣品，取30 mL 的體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶劑，滴加0.1 mol/L 鹽酸4 至5 滴，倒入火焰木花瓣，勻漿后在放置于水浴鍋中，在55 ℃下浸提90 min后，用離心機(jī)在25 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min，取上清液，用60%乙醇將上清液定容到30 mL，用酶標(biāo)儀在400～800 nm的波長范圍內(nèi)對(duì)提取液進(jìn)行光譜掃描，確定火焰木花色素的最大吸收光的波長.

1.3.2 火焰木花長期保存的護(hù)色前處理優(yōu)化

由于火焰木開花具有季節(jié)性，季節(jié)性收獲的新鮮花朵要處理后能長期保存以方便后續(xù)連續(xù)的色素提取，為更好的保護(hù)花中的色素，進(jìn)行四種保存方式的比較.1）烘干保存：將鮮花直接放入烘箱內(nèi)65 ℃進(jìn)行烘干，待樣品烘至徹底干燥后粉碎密封室溫保存；2）蒸制后烘干保存：將鮮花放入沸騰水的蒸鍋內(nèi)蒸制3～5 min 后，再放入烘箱65 ℃烘干，待樣品烘至徹底干燥后粉碎密封室溫保存；3）蒸制后冰凍保存：將鮮花放入沸騰水的蒸鍋內(nèi)水蒸3～5 min后，晾干表面水分后，勻漿放入冰箱冷凍保存；4）鮮凍保存：將采收的鮮花直接勻漿后放入冰箱冷凍保存.

均保存一個(gè)月后，稱取上述烘干保存的花各1 g，冷凍保存的花各5 g，用60%乙醇作為提取溶劑，分別提取樣品的色素，提取方法按照1.3.1進(jìn)行，然后掃描四種提取物的光譜，光譜和最大吸收峰沒有發(fā)生變化的保存方法即為合適的火焰木花的保存方法.

1.3.3 火焰木花的色素的提取溶劑篩選

分別稱取1 g 蒸制后烘干保存的花的粉碎物18 份，分別取蒸餾水、甲醇、無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為20%、60%的乙醇、乙酸乙酯30 mL 作為提取溶劑對(duì)花的色素進(jìn)行提取，每種溶劑設(shè)置3 個(gè)平行處理，提取方法同1.3.1，提取結(jié)束后用紫外分光光度計(jì)在506 nm 處測(cè)量各個(gè)提取物的吸光值，吸光值最高的即為火焰木花色素的最佳提取溶劑.

1.3.4 料液比對(duì)花的色素提取效果的影響

稱取1 g 蒸制后并烘干保存的粉碎的火焰木花樣品，分別以體積質(zhì)量比（g∶mL）為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 加入20%乙醇溶劑，再加4 至5 滴0.1 mol/L 鹽酸于提取溶劑中，用水浴鍋在55 ℃下浸提90 min，用離心機(jī)在25 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min，然后取上清液定容至相同體積60 mL，分別用紫外分光光度計(jì)在506 nm處測(cè)定吸光值，平行試驗(yàn)進(jìn)行3次.

1.3.5 提取時(shí)間對(duì)花的色素提取效果的影響

稱取1 g 蒸制后并烘干粉碎保存的火焰木花樣品，取30 mL 的20%乙醇溶劑進(jìn)行色素提取，在55 ℃下分別浸提30、60、90、120、150 min 后，用離心機(jī)離心取上清液定容至相同體積，用紫外分光光度計(jì)在506 nm處測(cè)定各處理吸光值，平行試驗(yàn)進(jìn)行3次.

1.3.6 提取溫度對(duì)花的色素提取效果的影響

稱取1 g 蒸制后并烘干粉碎的火焰木花樣品，取30 mL 的20%乙醇溶劑，再加4 至5 滴0.1 mol/L 鹽酸于提取溶劑中，用水浴鍋分別在25、35、45、55、65 ℃下浸提90 min 后，離心取上清液定容至相同體積30 mL，用紫外分光光度計(jì)在506 nm 處測(cè)定吸光值，平行試驗(yàn)進(jìn)行3 次.

1.3.7 火焰木花的色素提取條件的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

選取料液比、時(shí)間、溫度三種因素作為優(yōu)化條件[12-13].所選因素對(duì)火焰木花的色素提取有著不同程度的影響，各因素之間也可能會(huì)存在著復(fù)雜的相互作用，以提取液的506 nm處吸光值為響應(yīng)值，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)正交試驗(yàn)表L9（33）設(shè)計(jì)了三因素三水平正交試驗(yàn)水平表（表2），優(yōu)化提取條件.

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Orthogonal test factor level table

1.3.8 火焰木花的色素提取優(yōu)化條件的驗(yàn)證及其花色苷的定量

利用正交試驗(yàn)結(jié)果，在優(yōu)化出的最佳提取條件下對(duì)火焰木花的色素進(jìn)行五次重復(fù)提取實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

采用pH示差法[14]對(duì)提取物中的花色苷含量進(jìn)行定量，從提取的花的色素溶液中，吸取2份同體積的樣液，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH分別到pH=1.0和pH=4.5，然后分別用相同pH的水稀釋5倍和10倍，在520 nm和700 nm波長下測(cè)量其吸光值，代入公式(1)計(jì)算其花青素含量.

其中：A=(A520nm-A700nm)pH=1.0-(A520nm-A700nm)pH=4.5；MW 為矢車菊色素3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）的相對(duì)分子量（449.2 g/mol）；ε為摩爾消光系數(shù)（26 900 L·mol-1·cm-1）；DF 為稀釋因子（V/Wt）；L為比色皿的厚度（1 cm）.

1.3.9 火焰木花的色素在鮮榨楊桃汁中的穩(wěn)定性

購買新鮮楊桃榨汁，取80 mL楊桃汁，分別加入0、5、10、15、20、25 mL的花的色素提取原液，放入三角瓶中混勻并密封，65 ℃巴氏殺菌30 min.將上述樣品放置冰箱冷藏保存，連續(xù)取樣觀察14 d，每次測(cè)量時(shí)從三角瓶中吸取一定量用離心機(jī)在25 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液測(cè)定506 nm 波長下的吸光值，同時(shí)觀察果汁的顏色變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 火焰木花提取的色素的最大吸收波長

火焰木的新鮮花瓣60%的乙醇提取物整體呈現(xiàn)鮮紅色，由其光譜（圖1）可知火焰木花的色素的最大吸收峰在506 nm 處.因紅紫色溶液的最大吸收波長在490～560 nm 之間[15]，火焰木花的提取溶液吸收峰出現(xiàn)的波長和提取液呈現(xiàn)的紅色色調(diào)一致，選定506 nm 作為后續(xù)試驗(yàn)中測(cè)定花的色素提取量的波長，以該波長下的吸光值表示所提取的色素的相對(duì)含量.

圖1 火焰木花提取物的光譜Fig.1 Spectrum of extract of S.campanulata flower

2.2 火焰樹花的長期保存前處理優(yōu)化結(jié)果

四種對(duì)火焰木的花預(yù)處理然后保存的方法中，只有蒸汽蒸后烘干保存或冰凍保存的樣品，提取色素后的光譜中能夠觀察到506 nm 處仍然存在的明顯的吸收峰（圖2），說明只有蒸汽蒸后烘干或者冰凍保存的樣品能很好的保護(hù)花中的紅色素，直接烘干或直接冰凍保存的樣品可能在處理過程中因?yàn)榛ò曛械拿傅淖饔脤?dǎo)致紅色素發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而506 nm 處特征吸收峰消失.后續(xù)均采用蒸制后烘干保存的花的樣品進(jìn)行試驗(yàn).

圖2 樣品不同處理保存方式對(duì)提取色素光譜的影響Fig.2 Effect of different treatment and preservation methods on the spectrum of sample extracts

2.3 火焰樹花的色素提取溶劑的篩選結(jié)果

以蒸餾水、甲醇、無水乙醇、20%乙醇、60%乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑對(duì)火焰樹花的色素提取完成后，在506 nm 處測(cè)定的吸光值（圖3）中20%乙醇提取的色素吸光值最高，乙酸乙酯提取的色素吸光值最小，乙酸乙酯溶劑的極性最小提取率最低，可能是火焰木花中的色素主要是水溶性的花色苷構(gòu)成[13].20%乙醇提取率高、成本低，后續(xù)試驗(yàn)采用該溶劑為色素提取溶劑.

圖3 火焰木花的色素提取溶劑比較結(jié)果Fig.3 Comparative results of pigment extraction solvents of S.campanulata flower

2.4 火焰樹花的色素提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 料液比對(duì)花的色素提取效果的影響

隨著料液比的增加，吸光值先增大后減小，在料液比為1∶30 時(shí)，提取效果較優(yōu)（圖4）.可能是隨著料液間溶劑量的增加能夠縮短濃度的平衡時(shí)間，且可以提高色素分子的擴(kuò)散速率，使提取溶劑中花色苷等物質(zhì)增多，從而導(dǎo)致提取量的上升.但料液比達(dá)到一定值時(shí)，也就是色素分子與提取劑之間達(dá)到了溶解平衡后，再增加溶劑的量提取率的增加并不大[16].隨著提取溶劑量的增加，會(huì)溶解出更多花中的分子，溶解出的某些成分會(huì)結(jié)合色素使色素的穩(wěn)定性下降，最終使呈色色素的含量降低[17].

圖4 料液比對(duì)色素提取效果的影響Fig.4 Effect of material-solvent ratio on pigment extraction

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)花的色素提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)花色素提取效果的影響見圖5，在30～150 min 范圍內(nèi)色素提取效果隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在90 min 時(shí)達(dá)到最大.可能是由于浸提時(shí)間的增長，使花色素分子分解，從而使吸光值下降.

圖5 提取時(shí)間對(duì)色素提取效果的影響Fig.5 Effect of extracted time on pigment extraction

2.4.3 提取溫度對(duì)花的色素提取效果的影響

溫度對(duì)色素提取的影響結(jié)果見圖6，隨著溫度的增加花的色素提取效率上升，在55 ℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降.在低于55 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，會(huì)加快溶劑分子間的無規(guī)則運(yùn)動(dòng)，增加生物組織的通透性，所以火焰木花的色素提取效率逐漸增大[18].在高于55 ℃時(shí)提取效率下降，可能是因?yàn)楦邷貢?huì)導(dǎo)致溶劑中的色素分子結(jié)構(gòu)被破壞[16].

圖6 提取溫度對(duì)色素提取效果的影響Fig.6 Effect of extracted temperature on pigment extraction

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比、時(shí)間、溫度三個(gè)因素，并依據(jù)表2 進(jìn)行了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì).得到的正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示.由正交試驗(yàn)結(jié)果的R值可知，對(duì)火焰木花的色素提取的影響因素的順序大小為溫度＞料液比＞時(shí)間，即溫度是影響火焰木花的色素提取的主要因素，時(shí)間對(duì)花色苷的提取影響較小.由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，火焰木花的色素的最佳提取條件組合為：A3B2C1，即料液比為1∶40、提取時(shí)間為90 min、溫度為45 ℃.

表3 火焰木花色素提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal experiment results of a pigment from S.campanulata flower

2.6 正交優(yōu)化條件的驗(yàn)證及花色苷的濃度測(cè)定結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果中吸光值最高的色素提取條件組合在第8 組正交試驗(yàn)中出現(xiàn)，且第8 組的條件與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果一致，即料液比為1∶40、時(shí)間為90 min、溫度為45 ℃的組合條件.采用該條件進(jìn)行的5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，吸光值分別為0.930、0.933、0.935、0.934、0.931，平均值為0.933，與正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

根據(jù)pH 示差法，在520、700 nm 波長下測(cè)出的吸光值見表4，花色素在不同pH 值下吸光值差別較大，pH值越低吸光值越低，說明火焰木花的花色素主要呈色物質(zhì)是花色苷[14,17].將數(shù)據(jù)代入公式(1)計(jì)算出2種稀釋倍數(shù)下提取液中花青素含量分別為41.33、39.58 mg/L，平均值為40.46 mg/L，即吸光值為0.933 的花的提取液中花色苷的濃度為40.46 mg/L.

表4 火焰木花的提取物在兩種pH值條件下的吸光值Tab.4 Aabsorption value of pigment of S.campanulata flower at different pH value

2.7 火焰木花提取的色素在楊桃汁中的穩(wěn)定性

將不同量的火焰木花中提取的色素加入到新鮮的楊桃汁中后，可以明顯看到楊桃汁由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t黃色，添加花的提取物越多，顏色越鮮艷，呈現(xiàn)紅色，果汁的顏色更具有引誘力.14 d 連續(xù)的吸光值的測(cè)定結(jié)果（圖7）表明火焰木的花提取的色素在楊桃汁中非常穩(wěn)定，而且所有添加有色素提取物的楊桃汁在1 d 后的吸光值明顯增加，可能是鮮榨楊桃汁的pH 值較低，較低的pH 值對(duì)提取物中的花色苷有增色作用[17,20].

圖7 火焰木花花色苷在鮮榨楊桃汁中的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of anthocyanin in fresh-pressed carambola juice

3 結(jié)論與討論

以火焰木的花為原料，進(jìn)行天然花色素的提取，原料來源豐富、廉價(jià)，若能開拓出花色素的食藥用途，必定可以增加火焰木的產(chǎn)業(yè)價(jià)值.本研究結(jié)果表明火焰木的花經(jīng)過蒸制后再烘干或冷凍保存能有效長時(shí)間保護(hù)花中的花色素，可能是蒸汽短時(shí)間蒸制后能迅速的滅活花瓣中各種酶類，阻止酶對(duì)花色素分子的破壞，短時(shí)間的蒸制又不會(huì)因溫度太高破壞花中的花色素分子，和蒸青綠茶殺青的原理相同[19].火焰木的花色素提取溶液最大吸收波長為506 nm，20%乙醇溶劑提取效果相對(duì)最好，最佳提取工藝為料液比為1∶40、時(shí)間為90 min、溫度為45 ℃的組合條件下提取率最好，此時(shí)提取物中的花色苷含量可以達(dá)到40.46 mg/L.火焰木花的色素在鮮榨楊桃汁中，在連續(xù)14 d 的檢測(cè)中表現(xiàn)穩(wěn)定，初步認(rèn)為火焰木花的花色素可以應(yīng)用在一些果汁中增色.研究結(jié)果為火焰木的花的開發(fā)利用提供了基本參考.