3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體色素含量與光合特性分析

張其生

（漳州市花卉研究所,福建漳州 363204）

種業(yè)是國家戰(zhàn)略性、基礎(chǔ)性核心產(chǎn)業(yè).我國被稱為“世界園林之母”，但觀賞園藝許多種類的育種工作仍落后于西方發(fā)達(dá)國家，因此還需努力實(shí)施種業(yè)振興.觀賞植物葉色突變是綠色植物一種非常重要的突變，也是新品種重要來源之一.Gustaffsson[1]將葉色突變體分為5 類：淺綠、白化、條紋、黃化和斑點(diǎn)；Awan 等[2]則將葉色突變體劃分為黃化、綠黃、白化和條紋等8 種類型.葉色突變可作為標(biāo)記性狀，應(yīng)用于良種繁育、雜種純度鑒定[3]及雜交種生產(chǎn)[4]等；部分葉色突變體具有特殊的優(yōu)良性狀，可作為育種材料[5]；葉色突變體是研究葉綠體結(jié)構(gòu)[6-7]、葉綠體發(fā)育[8-9]、植物光合作用[10]和基因功能[11]等的理想材料，為近幾年發(fā)育生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一.目前，葉色突變的報(bào)道更多集中在糧食和蔬菜作物，但在觀賞植物領(lǐng)域也不斷有物種見到報(bào)道，如菊花[12]、蘭花[13-14]、胡頹子[15]和馬拉巴栗[16-17]等.

馬拉巴栗（Pachira glabra），俗稱發(fā)財(cái)樹，屬木棉科瓜栗屬常綠小喬木，是現(xiàn)在市場上暢銷的觀葉植物之一，曾被聯(lián)合國環(huán)保組織評(píng)為世界十大室內(nèi)觀賞植物[18].但目前市場上葉色單一，易引起審美疲勞，難以滿足人們的觀賞需求，因此有必要選育出不同葉色的新品種.國內(nèi)對(duì)馬拉巴栗新品種選育報(bào)道不多，僅蘇文潘等[16]對(duì)黃葉突變體、陳綠林等[17]對(duì)花葉、金葉類型進(jìn)行選育，但目前未有彩葉新品種實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化.為豐富馬拉巴栗的種質(zhì)資源，培育屬于我國自主產(chǎn)權(quán)的品種，漳州市花卉研究所自2018 年起在福建、廣東等地收集葉色突變植株并進(jìn)行選育，已選育10 多個(gè)株系.在選育過程中，發(fā)現(xiàn)部分突變體呈現(xiàn)葉片早衰、植株矮小及長勢弱等問題，嚴(yán)重影響植株的觀賞價(jià)值，因此有必要對(duì)馬拉巴栗的葉色突變體進(jìn)行深入研究，為馬拉巴栗葉色突變體的利用奠定基礎(chǔ)，也為其他觀賞植物葉色突變體選育提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在漳州市花卉研究所的馬拉巴栗種質(zhì)資源圃中選擇3個(gè)命名為Mu21、Mu27和Mu37的葉色黃化、白化類型的突變單株，分別取枝條進(jìn)行嫁接，以野生型的馬拉巴栗為砧木，連續(xù)嫁接3～4代，待其性狀穩(wěn)定后進(jìn)行試驗(yàn).以相同規(guī)格與栽培條件下的野生型馬拉巴栗為對(duì)照進(jìn)行數(shù)據(jù)的測定與分析.

1.2 植物學(xué)性狀的測定

嫁接后90 d，測定葉片顏色和枝條長度、葉柄長度、葉長、葉寬和葉面積等植物學(xué)性狀.

采用英國皇家園藝協(xié)會(huì)RHS 比色卡測定葉片正面顏色，突變體Mu27 的幼葉與成熟葉分開測定.枝條長度為嫁接點(diǎn)或切點(diǎn)到頂端的長度；因馬拉巴栗掌狀葉的小葉數(shù)5～8片不等，掌狀葉的葉長、葉寬等性狀差異大，故選擇比較穩(wěn)定的頂生小葉進(jìn)行測定.選擇野生型與突變體植株頂端往下的第五片成熟葉，測定掌狀葉葉柄長度、頂生小葉葉長、葉寬、葉面積等性狀.面積測量方法參照李寶光和黃芳[19]的方法，采用HP Smart Tank 519掃描儀對(duì)頂生小葉進(jìn)行掃描，保存為jpg格式后，通過Photoshop 7.01進(jìn)行計(jì)算.每種材料隨機(jī)選15株進(jìn)行測定.

1.3 葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定

參照王學(xué)魁等[20]的方法測定葉綠素、類胡蘿卜素含量.每個(gè)突變體各取植株第五片成熟葉，5 片為一組，將每組葉片剪碎，進(jìn)行混樣，稱取0.2 g 葉片鮮樣.經(jīng)少量石英砂、碳酸鈣粉及乙醇研磨后，過濾，加乙醇定容至25 mL.采用普析TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)在波長665、649、470 nm 下測定吸光度，依據(jù)公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素等色素含量.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.4 光合速率的測定

采用GFS-3000 光合熒光測定儀測定光合作用.設(shè)定氣流流速750μmol·m-2·s-1，葉室30 ℃，CO2濃度400μmol·m-2·s-1，光照強(qiáng)度800μmol·m-2·s-1.夾取第5 片葉的頂生小葉中部，使用開放氣路測定葉片光合速率等參數(shù)，每種材料隨機(jī)選擇5株.

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

采用Handy PEA型植物效率分析儀測定葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù).夾取頂端向下的第5片成熟葉的頂生小葉中部進(jìn)行測定，測定前葉片至少暗適應(yīng)20 min，然后暴露在飽和脈沖光1 s.每種材料測10片小葉.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過軟件Microsoft Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；通過軟件DPS 7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn).樣本間的比較采用Duncan新復(fù)極差法多重比較（P＜0.05）.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體的植物學(xué)性狀

3 個(gè)葉色突變體的葉色與野生型有明顯差異（圖1）.英國皇家園藝協(xié)會(huì)RHS 比色卡比對(duì)結(jié)果表明：Mu37 葉面比色卡數(shù)值顏色為155C，白色；Mu21 為156D，黃白色；Mu27 幼葉為144A，黃綠色，成熟葉為156D，與Mu21的葉色接近；Mu37在嫁接后3個(gè)月葉片表面逐漸出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大，直至整個(gè)葉片枯萎、脫落，部分植株出現(xiàn)死亡；Mu21在3.5個(gè)月開始出現(xiàn)與Mu37類似的情況；Mu27的幼葉由黃綠色逐漸轉(zhuǎn)為黃白色，也逐漸出現(xiàn)早衰現(xiàn)象.在夏季高溫、強(qiáng)光照的條件，早衰的現(xiàn)象更早出現(xiàn)、更為明顯.3個(gè)突變體的所有嫁接植株均會(huì)出現(xiàn)葉片早衰的現(xiàn)象.表明3 個(gè)葉色突變體由于出現(xiàn)突變，導(dǎo)致生理特性改變，出現(xiàn)葉片早衰現(xiàn)象.

圖1 馬拉巴栗野生型與不同葉色突變體植株Fig.1 Plant of wild type and leaf color mutants of Pachira glabra

與野生型相比，各突變體植株矮小，枝條長度、掌狀葉葉柄、頂生小葉葉長、葉寬、葉面積均顯著性變?。ū?）；其中，Mu37 的各項(xiàng)性狀為最小，與野生型差異大.結(jié)果表明3 個(gè)葉色突變體因突變顯著影響了植株的生長，導(dǎo)致植株矮小，葉片等性狀變小，且突變顏色越淺，受影響程度越大.

表1 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體的植物學(xué)性狀Tab.1 Botanical character of three leaf color mutants of Pachira glabra

2.2 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的光合色素

表2結(jié)果表明，與野生型相比，3個(gè)突變體的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均顯著降低.Mu21、Mu27和Mu37的葉綠素a含量分別為0.175、0.323、0.056 mg·g-1，僅為野生型的1.75%、3.22%和0.56%；葉綠素b 含量分別為0.100、0.215、0.070 mg·g-1，僅為野生型的2.68%、5.74%和1.87%；胡蘿卜素的含量分別為0.071、0.121、0.040 mg·g-1，僅為野生型的3.61%、6.12%和2.03%；總?cè)~綠素含量分別為0.275、0.538、0.126 mg·g-1，僅為野生型的2.00%、3.90%和0.92%.表明與對(duì)照植株相比，3 個(gè)突變體的葉綠素含量顯著降低，葉綠素a 降幅最大，同時(shí)影響類胡蘿卜素的合成.Mu27、Mu37 的葉綠素a/b 均顯著下降，Mu21下降差異不顯著，說明葉綠素b含量降低的幅度小于葉綠素a降低的幅度.各突變體的胡蘿卜素/總?cè)~綠素均較野生型大，除Mu37有顯著差異外，其他差異均不顯著.綜上推斷葉綠素與類胡蘿卜素含量的降低可能是3個(gè)突變體葉色變化的主要原因.

表2 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的光合色素含量Tab.2 Photosynthetic pigment content in leaf of three color mutants of Pachira glabra

2.3 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的光合參數(shù)

表3 結(jié)果表明，3 個(gè)葉色突變體的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰作用（Tr）均顯著低于野生型，胞間CO2濃度（Ci）顯著高于野生型.Mu21 和Mu27 的凈光合速率（Pn）分別為0.035 μmol·m-2·s-1和0.012 μmol·m-2·s-1，為對(duì)照的3.70%、1.27%；Mu37的凈光合速率（Pn）為負(fù)值，表明其光合作用小于呼吸作用，處于消耗狀態(tài)，相對(duì)應(yīng)的是數(shù)據(jù)測量時(shí)突變體葉片開始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)等早衰現(xiàn)象.引起葉片光合速率降低的植物自身因素有葉肉細(xì)胞光合活性下降和氣孔部分關(guān)閉兩類，胞間CO2濃度（Ci）增加則是光合作用非氣孔限制的最可靠的判據(jù)[21].由此推斷，3個(gè)葉色突變體的凈光合速率（Pn）下降是由于突變體葉肉細(xì)胞光合活性下降，而非氣孔限制.

表3 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的光合參數(shù)Tab.3 Photosynthetic parameters in leaf of three color mutants of Pachira glabra

2.4 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的熒光動(dòng)力學(xué)特性

初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）和最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）分別反映的是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量、完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量、原初電子受體QA的還原情況和內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率[21]；PIabs為光化學(xué)性能指數(shù)，較Fv/Fm更好反映植物的光反應(yīng)活性[22-23].

表4結(jié)果表明，突變體Mu21、Mu27、Mu37的初始熒光Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、PIabs均顯著較野生型小.其中，Mu21、Mu27 和Mu37 的Fo分別為55.000、185.400 和21.200，為野生型的15.33%、51.69%和5.91%；Fm分別為62.600、293.000 和23.500，為野生型的4.36%、20.39%和1.64%；Fv分別為7.600、107.600 和2.300，為野生型的0.70%、9.98%和0.21%；衡量植物抗逆性的參數(shù)PsⅡ最大光化學(xué)效率(（Fv/Fm）分別為0.116、0.272 和0.096，為野生型的15.49%、36.32%和12.82%，表明3 個(gè)突變體的抗逆性下降，且突變顏色越淺，下降幅度越大；性能指數(shù)(PI abs)下降代表PsⅡ的光合結(jié)構(gòu)、功能受到較大傷害[24]，三個(gè)突變體的PIabs分別為0.007、0.197 和-0.004，為野生型的0.20%、5.58%和-0.11%，表明3 個(gè)突變體的PsⅡ的光合結(jié)構(gòu)和功能受到了傷害，特別是Mu37出現(xiàn)負(fù)值，表明光合作用小于呼吸作用，與凈光合速率為負(fù)值一致，比Fv/Fm能更好的反映植物的光反應(yīng)活性.

表4 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Tab.4 Chlorophyll fluorescence parameters in leaf of three color mutants of Pachira glabra

比活性參數(shù)能更確切反映植物對(duì)光能的吸收、轉(zhuǎn)化和耗散等狀況[25].ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC 和REo/RC 分別表示單位反應(yīng)中心吸收的光能、單位反應(yīng)中心耗散的能量、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量、單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量和單位面積中活性反應(yīng)中心的密度[26].

由表5可得，不同突變體的比活性參數(shù)表現(xiàn)不一致.Mu21、Mu27的ABS/RC 和DIo/RC顯著高于野生型，但Mu37低于野生型，但差異不顯著.Mu21、Mu27的TRo/RC 與野生型無明顯差異，但Mu37的接近于零，與野生型差異顯著.Mu21的ETo/RC顯著高于野生型，Mu27與野生型無明顯差異，Mu37為負(fù)值，顯著低于野生型.Mu21、Mu27的REo/RC 與野生型無明顯差異，但Mu37為負(fù)值，顯著低于野生型.由此推斷，突變體Mu21、Mu27 單位反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)增加，較多的能量并沒有用來捕獲光能(TRo/RC)和推動(dòng)電子的傳遞(ETo/RC)，而是以熒光和熱的方式耗散掉(DIo/RC)，造成葉片光合能力降低；而處于衰退期的Mu37 突變體光合結(jié)構(gòu)和功能受到了嚴(yán)重?fù)p傷，單位反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)減少，但不顯著，幾乎喪失了捕獲光能(TRo/RC)的能力，ETo/RC 和REo/RC 出現(xiàn)負(fù)值.Mu37 的多項(xiàng)比活性參數(shù)與Mu21、Mu27有明顯的差異，可能與Mu37處于衰退狀態(tài)有關(guān).

表5 3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉片的比活性參數(shù)Tab.5 Specific Activity Parameters in leaf of three color mutants of Pachira glabra

3 結(jié)論與討論

光合色素含量直接或間接影響著植物的光合能力.在小麥[24]、番茄[25]和菜豆[26]等植物中，葉綠素缺乏會(huì)抑制光合作用，導(dǎo)致葉片光合能力下降，進(jìn)而影響生物量的積累與植株的發(fā)育，植株往往矮小、長勢弱.本實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)馬拉巴栗葉色突變體的葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素含量和總?cè)~綠素含量較野生型均顯著降低.葉綠素含量的降低，且胞間CO2濃度（Ci）增加，表明凈光合速率（Pn）下降是突變體葉肉細(xì)胞光合活性下降，而非氣孔限制.植株則表現(xiàn)矮小，枝條變短，葉柄長度、頂生小葉葉長、葉寬、葉面積均有不同程度的減小.

葉片早衰是指葉片在有效期的生理生化過程中的衰老比正常植株提前，葉片過早死亡的現(xiàn)象.玉米[27]、白樺[28]等存在葉色突變體葉片早衰的現(xiàn)象.馬拉巴栗3 個(gè)葉色突變體Mu21、Mu27、Mu37 均出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，嚴(yán)重影響觀賞價(jià)值與觀賞時(shí)長.今后可進(jìn)一步研究葉片早衰機(jī)制，為培育耐早衰葉色突變優(yōu)良品種提供借鑒.

三個(gè)馬拉巴栗葉色突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、PIabs均顯著下降，表明光合色素含量降低導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心捕光能力弱和光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率低，葉片光合速率降低.Mu37的光化學(xué)性能指數(shù)（PIabs）為負(fù)值，與凈光合速率為負(fù)值表現(xiàn)一致，表明測定時(shí)植株的狀態(tài)處于表明其處于衰退狀態(tài)，光合作用小于呼吸作用，比Fv/Fm能更好反映植物的光反應(yīng)活性.

不同突變體植株的比活性參數(shù)表現(xiàn)不一樣，不僅跟葉色突變有關(guān)，可能跟植株的狀態(tài)有關(guān).Mu37 的多項(xiàng)比活性參數(shù)與Mu21、Mu27存在顯著性差異，且TRo/RC趨近與零，ETo/RC和REo/RC出現(xiàn)負(fù)值，這些是否可以作為突變體處于衰退狀態(tài)的指標(biāo)尚需進(jìn)一步的討論.