克羅諾桿菌環(huán)境耐受性的評(píng)價(jià)

龐立冬，宋丹靚敏，賈 嬡，李 譽(yù)，梁雅琪，蘇群超，鄭亞平，李 然，滿朝新，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

發(fā)病率高和影響范圍廣的食源性疾病極大地威脅了公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)[1-3]。而食源性致病菌作為食源性疾病的主要因素之一受到了廣泛關(guān)注[4]?？肆_諾桿菌（Cronobacterspp.）作為一種重要的食源性致病菌，已經(jīng)在多種食品中分離得到[5-7]，其中，乳制品尤其是嬰兒配方奶粉（powdered infant formulas，PIF）是其主要的污染源[8]?？肆_諾桿菌能夠引發(fā)早產(chǎn)兒、嬰幼兒等患上嚴(yán)重的敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎[9-11]，其致死率高達(dá)40%～80%[12-13]，已被國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)列為嚴(yán)重危害特定人群、導(dǎo)致慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥甚至威脅生命的細(xì)菌[14]。

PIF 作為克羅諾桿菌的主要污染來(lái)源和傳播途徑[15]，它的污染途徑主要包括原輔料的添加和生產(chǎn)環(huán)境[16]。此外，克羅諾桿菌具有很強(qiáng)的環(huán)境耐受性[17-18]，使其能夠在PIF 加工環(huán)境和終產(chǎn)品中存在[19-20]，造成持續(xù)污染，難以完全清除，嚴(yán)重威脅到PIF 的質(zhì)量安全。曹晨陽(yáng)等[21]報(bào)道了分離自嬰幼兒乳粉和米粉的15 株不同基因型阪崎克羅諾桿菌對(duì)不同溫度和pH 的耐受能力。BENNOUR 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，克羅諾桿菌能夠在干燥的嬰兒配方奶粉中存活至少3 個(gè)月。YE 等[23]對(duì)比了阪崎克羅諾桿菌野生型和OmpW突變體在高滲條件下的存活率和形態(tài)變化。目前的研究多集中在不同基因型的克羅諾桿菌環(huán)境耐受性的研究上，缺乏對(duì)不同實(shí)際生產(chǎn)環(huán)節(jié)中分離的克羅諾桿菌環(huán)境耐受性的研究。為徹底有效地對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行預(yù)防和控制，本實(shí)驗(yàn)以從PIF 樣品及其加工環(huán)境中分離得到的8 株克羅諾桿菌作為代表菌株，研究了其環(huán)境的耐受性（耐熱性、耐酸堿性、耐干燥性和耐高滲性）。本研究通過(guò)評(píng)價(jià)克羅諾桿菌的環(huán)境耐受性，為更好地控制和消除克羅諾桿菌污染提供參考依據(jù)，為保障乳制品安全提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用克羅諾桿菌均分離自PIF 樣品及其加工環(huán)境，共計(jì)8 株分離菌株。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株及其來(lái)源Table 1 Bacterial strains used in this study and their sources

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptone soy agar,TSA）、LB 肉湯培養(yǎng)基（LB broth powder）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（brain heart infusion, BHI） 青島海博生物有限公司；山梨醇 陽(yáng)騰化工產(chǎn)品有限公司；硅膠上海月杰實(shí)業(yè)有限公司；NaCl 西隴化工股份有限公司。

TGC-16G 型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；DK-98-II 型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；YM50L 型高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；DU800 型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Beckman 公司；ME204E 型精密電子天平（0.0001 g）、PL2002 型電子天平、Delta320 型pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 根據(jù)已發(fā)表研究并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[24]，將凍存的克羅諾桿菌接種于LB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下200 r/min 培養(yǎng)12 h 進(jìn)行活化，將活化后的菌株在TSA 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h 后挑取單菌落，置于10 mL 液體LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，連續(xù)傳代2 次，待菌液濃度達(dá)到108CFU/mL 后，取1 mL 菌液在4 ℃下8000×g 離心10 min，用0.85%的滅菌生理鹽水進(jìn)行洗滌（4 ℃下8000×g 離心10 min），棄去上清液，該過(guò)程重復(fù)三次，最終向菌泥中加入1 mL 滅菌生理鹽水，制成濃度為108CFU/mL 的菌懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 克羅諾桿菌環(huán)境耐受性研究

1.2.2.1 耐受高溫能力的測(cè)定 菌株最適生產(chǎn)溫度為37 ℃左右。根據(jù)已發(fā)表研究并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[25]，本試驗(yàn)取1.2.1 節(jié)所述的菌懸液用滅菌生理鹽水10 倍梯度稀釋至107CFU/mL，取10 mL 菌懸液分別置于53、57、61 和65 ℃的熱水浴中，處理時(shí)間分別為1、2、3、5、8、10、20、30、60 min。經(jīng)高溫處理的菌液，冷卻至室溫后震蕩搖勻，從每個(gè)處理后的試管中分別吸取100 μL 混合液均勻涂布TSA 平板，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.2.2 耐受pH 能力的測(cè)定 菌株最適生長(zhǎng)pH 為7.0 左右。根據(jù)已發(fā)表研究并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[26]，本試驗(yàn)取1 mL 1.2.1 節(jié)所述的菌懸液用pH 分別為1.0、1.5、2.0、12.0、12.5 和13.0 的滅菌生理鹽水10 倍梯度稀釋至107CFU/mL，將上述菌懸液分別在上述pH條件下處理0、30、60、90、120 s。經(jīng)酸堿處理的菌液，震蕩搖勻，從每個(gè)處理后的試管中分別吸取100 μL混合液均勻涂布TSA 平板，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.2.3 耐受干燥能力的測(cè)定 根據(jù)已發(fā)表研究并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[27]，本試驗(yàn)將無(wú)水硅膠放入無(wú)菌的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行干燥處理，待培養(yǎng)箱中的空氣相對(duì)濕度為20.7%時(shí)，取50 μL 1.2.1 節(jié)所述的菌懸液于2 mL 無(wú)菌離心管中，每株菌分別分裝20 個(gè)，將離心管蓋打開(kāi)，在培養(yǎng)箱中放置1.5 h 后，立即蓋上離心管蓋，并在培養(yǎng)箱中持續(xù)放置7 個(gè)月。經(jīng)不同間隔時(shí)間干燥處理后，震蕩搖勻，對(duì)菌懸液進(jìn)行梯度稀釋TSA 平板計(jì)數(shù)。

1.2.2.4 耐受高滲透壓能力的測(cè)定 根據(jù)已發(fā)表研究并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[28]，本試驗(yàn)將各菌株凍存管從-20 ℃取出放入4 ℃冰箱中，完全解凍后，從凍存管中吸取50 μL 待測(cè)菌株的菌液分別加入到10 mL 無(wú)菌的NaCl 濃度分別為4%、6%、8%、10%的BHI 溶液和10 mL 無(wú)菌的山梨醇濃度分別為12.5%、19%、25%、31%的BHI 溶液中，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)高滲透壓處理后的菌液，震蕩搖勻，每隔2 h 測(cè)定OD 值，持續(xù)24 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用Microsoft Excel 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，用SPSS 軟件進(jìn)行差異性分析，用Origin 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 克羅諾桿菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況

8 株不同ST 型的克羅諾桿菌，分別以53、57、61 和65 ℃評(píng)價(jià)其耐熱性，結(jié)果如表2 所示。PIF 的巴氏殺菌法通常為62～65 ℃，持續(xù)30 min[29]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了4 個(gè)溫度（53、57、61 和65 ℃）進(jìn)行耐熱性分析。在53 ℃條件下，所有的菌株處理60 min時(shí)仍可存活；在57 ℃條件下，菌株ES3 和ES35 在20 min 時(shí)仍有存活，ES52 在10 min 時(shí)仍有存活，其他菌株在作用8 min 時(shí)全部失活；在61 ℃條件下，菌株ES3 和ES35 在5 min 時(shí)仍有存活，ES52 在3 min時(shí)仍有存活，其他菌株在作用3 min 時(shí)全部失活；在65 ℃條件下，所有菌株均在1 min 時(shí)全部失活。由此可見(jiàn)，升高處理溫度和延長(zhǎng)作用時(shí)間，所有菌株的活性都有所降低，其中克羅諾桿菌ES3 和ES35 表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性，在61 ℃條件下5 min 時(shí)仍可存活，其次菌株ES52 的耐熱性也較高。這可能是由于不同ST 型的菌株的基因表達(dá)不同，導(dǎo)致了菌株的耐熱性不同[30]。

表2 克羅諾桿菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of Cronobacter spp. at different temperatures

2.2 克羅諾桿菌在不同pH 下的生長(zhǎng)情況

8 株不同ST 型的克羅諾桿菌，分別以不同pH進(jìn)行酸堿處理，評(píng)價(jià)其耐酸堿性，結(jié)果如表3 所示。根據(jù)工廠的實(shí)際生產(chǎn)情況可知，一般采用酸洗和堿洗的方法對(duì)生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行殺菌[31]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取6 個(gè)pH 梯度（1.0、1.5、2.0、12.0、12.5 和13.0）進(jìn)行耐酸堿性分析。在pH1.0 的酸性條件下，所有菌株均失活；在pH1.5 的酸性條件下，菌株ES3 在90 s時(shí)仍可存活，而ES35、ES37、ES39、ES52 在90 s 時(shí)失活，ES38、ES45、ES46 在60 s 時(shí)全部失活；在pH2.0的酸性條件下，ES3 在120 s 時(shí)仍可存活，ES46 在90 s 時(shí)失活，其余菌株在120 s 時(shí)全部失活。由此可見(jiàn)，克羅諾桿菌ES3 具有較強(qiáng)的耐酸性。在pH12.0的堿性條件下，只有ES38 在處理120 s 時(shí)仍可存活；在pH12.5 的堿性條件下，只有ES38、ES39 在處理30 s 時(shí)仍可存活；在pH13.0 的堿性條件下，除菌株ES38 外其余菌株立即死亡，由此可見(jiàn)，克羅諾桿菌ES38 具有較強(qiáng)的耐堿性?？肆_諾桿菌對(duì)堿敏感的原因，可能是由于其屬于革蘭氏陰性桿菌，細(xì)胞壁中含有較多的脂類物質(zhì)，而這類物質(zhì)易與堿性溶液反應(yīng)，致使細(xì)胞壁失去保護(hù)作用，最終造成菌體死亡。

表3 克羅諾桿菌在不同pH 下的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of Cronobacter spp. at different pH

2.3 克羅諾桿菌在干燥條件下的生長(zhǎng)情況

對(duì)8 株不同ST 型的克羅諾桿菌進(jìn)行干燥處理，評(píng)價(jià)其耐干燥性，結(jié)果如圖1 和圖2 所示。在長(zhǎng)達(dá)7 個(gè)月的監(jiān)測(cè)中，8 株菌的菌數(shù)都有不同程度地降低，但下降的趨勢(shì)一直都趨于平緩，沒(méi)有很大的波動(dòng)。總體來(lái)看，8 株菌的菌數(shù)從初始濃度108CFU/mL 下降到105CFU/mL 左右，且在試驗(yàn)前期下降的趨勢(shì)較為明顯，在后期下降趨勢(shì)趨于平緩。其中克羅諾桿菌ES37 具有相對(duì)較強(qiáng)的耐干燥性，而菌株ES3 的耐干燥性較弱。這種緩慢的下降趨勢(shì)說(shuō)明克羅諾桿菌具有很強(qiáng)的抵抗干燥環(huán)境的能力。這可能是由于生物膜和菌株所產(chǎn)生海藻糖對(duì)菌株的保護(hù)作用[32]。

圖1 ES3、ES46、ES35 和ES39 四株克羅諾桿菌在干燥條件下的活菌數(shù)Fig.1 Viable counts of four Cronobacter spp. ES3, ES46,ES35 and ES39 under dry conditions

圖2 ES52、ES45、ES37 和ES38 四株克羅諾桿菌在干燥條件下的活菌數(shù)Fig.2 Viable counts of four Cronobacter spp. ES52, ES45,ES37 and ES38 under dry conditions

2.4 克羅諾桿菌在高滲透壓的條件下的生長(zhǎng)情況

8 株不同ST 型的克羅諾桿菌，以不同濃度的NaCl 和山梨醇進(jìn)行處理，評(píng)價(jià)其耐高滲性，NaCl 的試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。從圖中可知，8 株不同ST 型的克羅諾桿菌在耐高滲性試驗(yàn)中呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，即隨著NaCl 濃度的增大，與未添加NaCl 的空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的OD600nm值逐漸下降，且當(dāng)NaCl的濃度為8%和10%時(shí)，在24 h 內(nèi)OD600nm值變化平緩，幾乎呈直線趨勢(shì)，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)緩慢或阻滯。這可能是由于NaCl 屬于強(qiáng)電解質(zhì)，在溶液中很容易電離成Na+和Cl-，這就使得溶液的滲透壓有所升高[18]。同時(shí)，山梨醇的滲透壓與葡萄糖接近，是蔗糖的1.88 倍。通過(guò)測(cè)定克羅諾桿菌對(duì)山梨醇的耐受能力對(duì)控制PIF 中的克羅諾桿菌具有重要意義[33]。山梨醇的試驗(yàn)結(jié)果與NaCl 相似（未在文中體現(xiàn)），隨著山梨醇濃度的升高，OD600nm值呈現(xiàn)梯度遞減的趨勢(shì)，但當(dāng)山梨醇濃度達(dá)到最大值31%時(shí)，與10% NaCl組相比，在24 h 內(nèi)OD600nm值仍有明顯的上升趨勢(shì)。而山梨醇屬于非電解質(zhì)，在溶液中不能電離，因此其作用效果沒(méi)有NaCl 好[34]。所以等滲條件下，克羅諾桿菌對(duì)山梨醇的耐受性強(qiáng)于NaCl。對(duì)高滲透壓的耐受能力則可能是因?yàn)樘潜簧系臉O性基團(tuán)減少了克羅諾桿菌的水分流失以及海藻糖所形成的保護(hù)膜對(duì)克羅諾桿菌的保護(hù)作用。

圖3 克羅諾桿菌對(duì)不同濃度NaCl 的耐受性Fig.3 Resistance of Cronobacter spp. for different concentrations of NaCl

3 討論與結(jié)論

本研究選取了從PIF 樣品及其加工環(huán)境中分離得到的8 株ST 型克羅諾桿菌進(jìn)行環(huán)境耐受性研究。由4 個(gè)溫度的耐熱性結(jié)果可知，ES3、ES35 和ES52 對(duì)高溫具有較強(qiáng)耐熱性。耐熱菌株均分離自工廠的環(huán)境涂抹和終產(chǎn)品，且都是在經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后分離得到的，進(jìn)一步說(shuō)明這幾株菌對(duì)高溫具有較強(qiáng)的耐受性。根據(jù)以上結(jié)果可知，巴氏殺菌完全可以使克羅諾桿菌失活。克羅諾桿菌的污染可能是由于熱處理過(guò)程中奶粉受熱不均使得部分菌體得以存活或者是加工的后續(xù)過(guò)程中一些營(yíng)養(yǎng)元素的添加引起的污染[35-36]。此外，奶粉的加工環(huán)境以及生產(chǎn)過(guò)程中的干燥和罐裝階段，以及暫存、輸送和包裝時(shí)的二次污染也不容忽視。因此，對(duì)奶粉加工工藝進(jìn)行優(yōu)化來(lái)使其受熱均勻和對(duì)其加工環(huán)境進(jìn)行全方位殺菌對(duì)于防止克羅諾桿菌污染十分重要。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)耐酸堿性結(jié)果可知，克羅諾桿菌具有耐酸不耐堿的特性。因此，可采用堿液對(duì)加工環(huán)境和生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行清洗消毒，操作人員也應(yīng)通過(guò)皂液洗手進(jìn)行殺菌來(lái)保持手部的堿性環(huán)境，防止交叉污染[37]。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明克羅諾桿菌具有較強(qiáng)的抗干燥能力，這也為其能在水分活度很低的奶粉中長(zhǎng)期存活提供了事實(shí)證明和理論依據(jù)。所有分離株均能夠在6% NaCl 中生長(zhǎng)，但無(wú)法在8%及以上環(huán)境中生存，說(shuō)明克羅諾桿菌對(duì)滲透壓具有一定的耐受性，但高滲透環(huán)境能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，在等滲條件下，克羅諾桿菌對(duì)山梨醇的耐受性強(qiáng)于NaCl。

此外，為了保障食品安全，降低食品污染風(fēng)險(xiǎn)，一些更加高效、經(jīng)濟(jì)的殺菌方法也應(yīng)該被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)聯(lián)合使用，例如，恒溫射頻技術(shù)[36]、高靜水壓技術(shù)[38]、脈沖電壓技術(shù)[39]和冷等離子體技術(shù)[40]等。同時(shí)，采取一些有效的環(huán)境殺菌方法對(duì)防控克羅諾桿菌污染也是十分重要的[41]。

綜上所述，克羅諾桿菌對(duì)環(huán)境具有較好的耐受性。其中，ES3、ES35 和ES52 對(duì)高溫具有較強(qiáng)耐熱性，在61 ℃條件下，菌株ES3 和ES35 在5 min 時(shí)仍有存活，ES52 在3 min 時(shí)仍有存活，其他菌株在作用3 min 時(shí)全部失活。所有菌株均具有耐酸不耐堿的特性，在pH1.0 的酸性條件下，所有菌株均失活，在pH1.5 的酸性條件下，所有菌株在處理120 s 時(shí)均可失活，在pH12.0、pH12.5 和pH13.0 處理一定時(shí)間時(shí)仍有部分菌株存活。所有菌株均具有較強(qiáng)的耐干燥性，在長(zhǎng)達(dá)7 個(gè)月的監(jiān)測(cè)中，8 株菌的活菌數(shù)的下降趨勢(shì)一直都趨于平緩，沒(méi)有很大的波動(dòng)。所有菌株均具有較強(qiáng)的耐高滲性，當(dāng)NaCl 的濃度低于8%時(shí)，對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制較小。