葡萄糖無酶快檢技術(shù)研究進(jìn)展

王 艷，程美佳，謝金暉，劉天嬌，李虹佳，辛嘉英,2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

葡萄糖是常見的有機(jī)化合物，更是人體所需的重要能源物質(zhì)。作為血糖含量的重要指標(biāo)，其含量的變化通常伴隨著人體一些疾病的產(chǎn)生；作為糕點(diǎn)、飲料及營養(yǎng)品等食品加工工業(yè)中的主要營養(yǎng)成分，其含量的變化又是檢測(cè)食物質(zhì)地風(fēng)味的重要指標(biāo)[1]。因此，葡萄糖檢測(cè)在食品工業(yè)、醫(yī)療健康、生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域均具有非常重要的意義[2]。目前，葡萄糖的檢測(cè)方法主要有熒光色譜法、比色法和電化學(xué)法等。其中，電化學(xué)檢測(cè)和比色法因其測(cè)量快、便捷、操作簡單而備受關(guān)注[3]。

近年來，電化學(xué)無酶檢測(cè)與可視化檢測(cè)成為了研究人員研究的熱點(diǎn)。電化學(xué)酶基葡萄糖檢測(cè)傳感器需要將天然酶固定到電極上，而天然酶價(jià)格較昂貴、保存條件苛刻、在過酸、過堿條件下容易失活、不易保存；另外，固定化步驟也較為繁瑣，不穩(wěn)定，使用壽命較短，并且酶基葡萄糖傳感器在制造、儲(chǔ)存和使用過程中很難不發(fā)生熱變性或化學(xué)反應(yīng)[4]。而無酶葡萄糖傳感器是一種基于葡萄糖分子的電催化氧化，是在相關(guān)催化活性材料表面上直接發(fā)生的，依據(jù)反應(yīng)信號(hào)對(duì)其進(jìn)行定性及定量檢測(cè)的傳感裝置[5]。可視化無酶檢測(cè)分為比色傳感檢測(cè)和熒光傳感檢測(cè)，利用模擬酶催化葡萄糖氧化的過氧化氫與顯色底物或熒光染料發(fā)生反應(yīng)，引起的顏色或熒光強(qiáng)度的變化來判斷葡萄糖濃度。本文綜述了國內(nèi)外的葡萄糖無酶快檢技術(shù)，對(duì)無酶葡萄糖傳感技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并討論了他們?cè)谄咸烟菣z測(cè)中的應(yīng)用。

1 基于電化學(xué)的葡萄糖無酶快速檢測(cè)

電化學(xué)無酶型葡萄糖傳感器檢測(cè)過程不受天然酶的限制，而是借助傳感器具有的模擬酶活性實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的檢測(cè)。該方法具有成本低、制備過程簡單、反應(yīng)迅速、檢測(cè)限低、穩(wěn)定性高、良好重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)[4]。下述將圍繞酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)對(duì)無酶型葡萄糖傳感器進(jìn)行介紹。

1.1 基于酶促反應(yīng)機(jī)制的葡萄糖無酶快速檢測(cè)

1.1.1 通過葡萄糖氧化酶模擬酶實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶快速檢測(cè) 葡萄糖氧化酶（GOD）是葡萄糖生物傳感器研究中應(yīng)用最廣泛的一種酶，是一種特征明確的糖蛋白，由2 個(gè)相同的亞基與2 個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔酶結(jié)合而成[6]。GOD 可以催化D-葡萄糖（C6H12O6）氧化為D-葡萄糖酸（C6H12O7）和過氧化氫（H2O2），反應(yīng)過程中消耗氧，可用電極測(cè)出氧電流變化值，根據(jù)氧電流變化值與葡萄糖之間的線性關(guān)系從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的高度特異性檢測(cè)。但由于葡萄糖氧化酶的固定化過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)且不穩(wěn)定、成本較高，近年來許多研究者便開發(fā)了模擬葡萄糖氧化酶活

性的催化材料，旨在避免GOD 的弊端。Luo 等[7]發(fā)現(xiàn)AuNPs 具備葡萄糖氧化酶活性，因?yàn)锳uNPs 能夠在過氧化氫酶不存在的情況下，催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸（Gluconic acid）和H2O2，并且發(fā)現(xiàn)其催化葡萄糖的機(jī)理與天然GOD 相似，并且證明了AuNPs的大小、催化活性受多種因素的影響，包括催化反應(yīng)條件、AuNPs 的擴(kuò)大、AuNPs 的表面鈍化；除AuNPs自身的特性具備葡萄糖氧化酶活性外，尺寸效應(yīng)也是影響AuNPs 活性的因素之一。他們將AuNPs 作為原料和催化劑，葡萄糖和O2作為酶的底物，HAuCl4作為反應(yīng)物，AuNPs 首先催化葡萄糖氧化反應(yīng)，原位生成的產(chǎn)物H2O2將HAuCl4還原為Au0，Au0以納米島（Gold nanoisland）的形式沉積在AuNP 種子上，導(dǎo)致AuNPs 逐漸增大，抑制了葡萄糖氧化過程，如圖1 所示。因此發(fā)現(xiàn)粒徑較小的AuNPs類葡萄糖氧化酶活性也較好，此結(jié)論在其他實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)[8]?；谛×紸uNPs 有類葡萄糖氧化酶活性的特性，Cao 等[9]以AuNPs 為核心構(gòu)建了ITO/PbS/SiO2/AuNPs 葡萄糖模擬酶光電化學(xué)（PEC）傳感器。鉍錫氧化物電極（ITO）的表面采用多層PbS 量子點(diǎn)（PbSQD）制造，可產(chǎn)生有效的光電流響應(yīng)。使用小的AuNPs 作為GOD 模擬酶，使葡萄糖催化氧化產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2，H2O2在三電極體系中發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并釋放氧氣。在PbS 和AuNPs 層之間插入隔離的SiO2納米微球（SiO2Ns）可以有效地降低基極電流并提高檢測(cè)極限（如圖2）。結(jié)果表明，該納米酶生物傳感器可以替代天然酶，成功地應(yīng)用于葡萄糖的光電化學(xué)（PEC）檢測(cè)。以上研究都是直接利用AuNPs 構(gòu)建無酶葡萄糖傳感器，而關(guān)樺楠等[10]發(fā)現(xiàn)多種廢棄果殼中都可以提取出AuNPs，于是利用柑橘提取液制備了AuNPs，結(jié)合天然聚谷氨酸（PGA）綠色還原法制備Fe3O4-PGA 微粒，并通過一步自組裝法制備具了核殼結(jié)構(gòu)的新型金磁微粒（Fe3O4-PGA@Au）。利用循環(huán)伏安法（CV 法）評(píng)價(jià)了Fe3O4-PGA@Au 在電化學(xué)體系下檢測(cè)葡萄糖的性能。結(jié)果表明，電極表面的金磁微粒能代替葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖水解產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2，利用電化學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生的氧化還原峰信號(hào)值與葡萄糖濃度之間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的快速檢測(cè)。除使用AuNPs 構(gòu)建無酶葡萄糖檢測(cè)傳感器外，Li 等[11]發(fā)現(xiàn)了Co，N 共摻雜HPC（Co，N-HPC）也具備類葡萄糖氧化酶的活性。通過一步法直接熱解ZIF-67 前驅(qū)體制備Co，N-HPC，ZIF-67 既可以作為模板，又可以作為富氮碳源，Co，N-HP 的高比表面積和分層孔有助于溶解氧快速擴(kuò)散到催化活性位點(diǎn)，從而產(chǎn)生新型高效的Co，N-HPC 氧化酶納米酶，利用此納米酶結(jié)合電化學(xué)傳感器，也可以高效地應(yīng)用于葡萄糖的無酶檢測(cè)中。

圖1 基于AuNPs 的自限增長系統(tǒng)示意圖[7]Fig.1 Schematic diagram of AuNPs-based self-limiting growth system[7]

圖2 在ITO/PbS/SiO2/AuNPs 電極上檢測(cè)葡萄糖的PEC 策略示意圖[9]Fig.2 Schematic illustration of the PEC strategy for detection of glucose at ITO/PbS/SiO2/AuNPs electrode[9]

1.1.2 通過過氧化物模擬酶實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶快速檢測(cè) 隨著納米技術(shù)的高速發(fā)展，許多納米材料已被證實(shí)具有類過氧化物酶活性，同時(shí)一些復(fù)合納米材料展現(xiàn)出更優(yōu)良的模擬酶活性。Cao 等[12]合成了氧化鐵納米線陣列，并對(duì)其進(jìn)行了電化學(xué)表征，證明了納米氧化鐵具有類過氧化物酶的催化活性，是一種理想的電極材料，在沒有葡萄糖氧化酶的作用下納米線也可以檢測(cè)血清中葡糖糖的含量。Zhang 等[13]通過電子順磁光譜證明了CoFe2O4MNPs 能有效催化H2O2分解產(chǎn)生誘導(dǎo)魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的羥基自由基，此結(jié)果證明了CoFe2O4MNPs 的過氧化物模擬酶的催化機(jī)理。最后，利用CoFe2O4MNPs 的過氧化物模擬酶的催化活性建立了一種測(cè)定雨水中H2O2和血清樣品中葡萄糖的新方法。Li 等[14]在半胱胺存在下，四氯金酸氫（III）與硼氫化鈉還原合成了（+）AuNPs。制備的AuNPs 由于吸附了帶正電荷的半胱胺-NH3+基團(tuán)，其電位為正。通過測(cè)試H2O2存在下過氧化物酶底物3, 3’, 5, 5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的催化氧化活性，證實(shí)了（+）AuNPs 具有過氧化物酶活性，通過偶聯(lián)GOD 模擬酶催化葡萄糖氧化，進(jìn)一步建立了葡萄糖的定量分析方法。張雪紅[15]基于水溶性的檸檬酸鹽穩(wěn)定的AuNPs 的類葡萄糖氧化酶活性以及脂溶性的四氧化三鐵納米顆（Fe3O4NPs）的類過氧化物酶活性，將脂溶性的Fe3O4NPs 封裝在脂質(zhì)體的雙分子夾層，水溶性的AuNPs 則被包封在水相的閉合囊泡中組成一個(gè)閉合的多酶體系。構(gòu)建了同時(shí)具有葡萄糖氧化酶-過氧化物酶（GOD-POD）活性的脂質(zhì)體多酶體系用于葡萄糖的一步檢測(cè)。

1.2 基于非酶促反應(yīng)機(jī)制的葡萄糖無酶快速檢測(cè)

為了彌補(bǔ)天然酶的缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、不易保存、固定化不穩(wěn)定等，特別是在極端環(huán)境中酶功能的喪失，非酶促葡萄糖傳感器是一種很有必要的替代方法。其原理在于將功能性納米材料修飾在電化學(xué)三電極體系中的工作電極上，代替天然酶催化氧化葡萄糖，該過程發(fā)生氧化還原反應(yīng)的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生電信號(hào)，該信號(hào)通過電化學(xué)工作站傳出，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后方可得出葡萄糖的含量。而金屬[16]、金屬合金[17]、金屬硫化物[18]、金屬氮化物[19]、金屬氧化物[20-21]，因其在中性和堿性環(huán)境下具有催化葡萄糖氧化的能力而被關(guān)注。其中，金屬氧化物因其比金屬或金屬合金具有更好的穩(wěn)定性和易接近性，在電化學(xué)葡萄糖檢測(cè)中受到了推崇[16-17]。

1.2.1 利用金屬氧化物實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶快速檢測(cè)

1.2.1.1 銅氧化物 氧化銅（CuO）天然豐富，生產(chǎn)成本低，具有良好的電化學(xué)和催化性能，是電氣、光學(xué)器件、多相催化、磁性存儲(chǔ)介質(zhì)、氣體傳感器和鋰離子電極等的最佳材料之一。與銅元素相比CuO 納米材料在電分析中具有較高的穩(wěn)定性，因而，被作為葡萄糖傳感器的電極也得到了廣泛的認(rèn)可[22]。劉東等[23]將竹粉分散于硝酸銅溶液中，經(jīng)靜置、過濾、干燥后高溫碳化，制備了氧化亞銅/銅/生物質(zhì)多孔碳復(fù)合材料（CuOx@BPC），采用循環(huán)伏安法、安培時(shí)間法研究其對(duì)葡萄糖非酶檢測(cè)的電化學(xué)性能，證實(shí)了CuOx@BPC/GCE 電化學(xué)性能優(yōu)良，且基于其構(gòu)建的傳感器對(duì)葡萄糖展現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能（如圖3）。

圖3 CuOx@BPC/GCE 葡萄糖非酶檢測(cè)機(jī)理圖[23]Fig.3 CuOx@ BPC/GCE glucose non-enzyme detection mechanism diagram[23]注：參比電極使用飽和甘汞電極（SCE）。

隨著葡萄糖無酶檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，一系列CuO 納米材料也被廣泛設(shè)計(jì)和合成，以增強(qiáng)其在葡萄糖傳感器中的內(nèi)在特性和性能，包括納米盤[24]、納米花[25]、納米線[26]和納米棒[27]等。見表1，特殊的多孔泡沫狀CuO 微納米纖維能夠增大電極比表面積從而提高與葡萄糖的反應(yīng)活性[28]，但靈敏度較低；相比之下，餅干狀CuO、CuO 納米盤、CuO@C/AuNPs靈敏度相對(duì)提高，線性范圍寬；CuO 納米花、CuOPANI、CuO/Cu2O/SnO2納米棒的靈敏度最高，CuO/Cu2O/SnO2納米棒與莠草狀CuO/Cu2O 納米線相比，由于SnO2的復(fù)合，加強(qiáng)了電子的遷移率，進(jìn)而加快了電極與葡萄糖分子之間的電子傳輸速度。上述納米材料的結(jié)構(gòu)具有小尺寸效應(yīng)、表面與界面效應(yīng)，該效應(yīng)可有效增加電極的導(dǎo)電性，增強(qiáng)電子的轉(zhuǎn)移。此外，納米材料的比表面積較大，且無毒副作用，具有良好的生物相容性、耐腐蝕性。

表1 CuO 基非酶促葡萄糖傳感器性能Table 1 CuO-based non-enzymatic glucose sensor performance

1.2.1.2 鈷氧化物 鈷氧化物是應(yīng)用于無酶葡萄糖傳感器的一類主要金屬氧化物，有三種常見的形態(tài)：氧化鈷（CoO）、三氧化二鈷（Co2O3）和四氧化三鈷（Co3O4）。對(duì)于非酶促葡萄糖傳感，Co3O4由于其成本低、環(huán)境友好、相對(duì)良好的導(dǎo)電性和電催化性能，已被多項(xiàng)研究證明是一種有前途的材料，應(yīng)用于許多領(lǐng)域[21,36]，見表2。Co3O4微薄片靈敏度較低，線性范圍窄，但電極使用Co3O4微薄片修飾的電極表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，能夠循環(huán)掃描1000 次，多孔Co3O4納米板同樣具有良好的穩(wěn)定性；Co3O4納米顆粒均勻嵌入3D 多孔激光誘導(dǎo)石墨烯（Co3O4NPs-LIG）電極因具有多個(gè)高活化位點(diǎn)顯示出優(yōu)異的導(dǎo)電性，可以增強(qiáng)電荷轉(zhuǎn)移，從而提高葡萄糖傳感性能；針狀Co3O4納米陣列線性范圍廣泛，靈敏度高，具有較高的催化活性，均受益于密集排列和獨(dú)立的具有大表面積的Co3O4納米針；Co-Co3O4/碳納米管/碳泡沫（Co-Co3O4/CNT/CF）納米復(fù)合材料中的Co3O4納米粒子生長在CF 的外部，而CNTs 大量地生長在CF的表面，這大大提高了碳納米管的電導(dǎo)率，使該電極具有較寬的線性范圍；Co3O4/Au、Au@Co3O4-S 因結(jié)合了Au 納米材料靈敏度大大提高，擴(kuò)寬了線性范圍。

表2 Co3O4 基非酶促葡萄糖傳感器性能Table 2 Co3O4-based non-enzymatic glucose sensor performance

1.2.1.3 鎳氧化物 NiO 具有低毒性、天然豐度、低成本、良好的電化學(xué)活性和穩(wěn)定性，是無酶葡萄糖傳感器極有希望的電極材料。葡萄糖在NiO 修飾電極上的電化學(xué)氧化是基于NiO 衍生的Ni（OH）2/NiOOH的氧化還原對(duì)，類似于鎳基電極。見表3，Ni/NiO/NG的靈度低，但具有較寬的線性范圍，并且展現(xiàn)出出色的選擇性、良好的重現(xiàn)性和長期穩(wěn)定性；Au@NiO 納米管中Au 具有雙功能效應(yīng)，能夠增加電荷轉(zhuǎn)移并充當(dāng)葡萄糖氧化的直接催化劑，使傳感器具有高的靈敏度和寬的線性范圍；利用火焰合成法在碳布上合成的NiO 納米顆粒，具有高的靈敏度，響應(yīng)時(shí)間迅速，短至3 s；NiO/FTO、NiO@CF、NiONC-rGO/GCE 和NiO/碳多孔復(fù)合材料的設(shè)計(jì)原理基于特殊的結(jié)構(gòu)以及豐富的活性位點(diǎn)，旨在增大電極的比表面積，提高靈敏度；使用掠射角沉積（GLAD）技術(shù)在鎳箔上制造納米結(jié)構(gòu)的NiO 電極顯示出較高靈敏度和卓越的檢測(cè)范圍，具有理想的選擇性和重現(xiàn)性。

表3 NiO 基的非酶促葡萄糖傳感器性能Table 3 NiO-based non-enzymatic glucose sensor performance

1.2.1.4 其他金屬氧化物 ZnO 是II-VI 族半導(dǎo)體的重要成員，具有較大的孔隙，由于其納米結(jié)構(gòu)的多樣性、高電子遷移率、化學(xué)穩(wěn)定性、電化學(xué)活性和高等電點(diǎn)，是制備酶生物傳感器的一個(gè)有吸引力的候選材料[53]。MnO2材料具有低電導(dǎo)率，生物相容性和壓電性能，能夠促進(jìn)酶的吸附，因此最大限度地利用MnO2設(shè)計(jì)出具有高導(dǎo)電性的納米結(jié)構(gòu)是實(shí)現(xiàn)MnO2基電極材料的一項(xiàng)熱門研究[54]。其中，包括MnO2與其他金屬及氧化物材料復(fù)合材料，如MnO2與Ni、CuO、Co3O4等[55-56]。除上述金屬氧化物外，其他幾種化合物也被探索作為電催化劑，在無酶葡萄糖傳感器中有潛在的應(yīng)用，F(xiàn)e3O4的納米棒、納米管、納米花以及磁性粒子等材料電化學(xué)活性強(qiáng)，具有良好的電催化性能、熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性[57]，TiO2材料成本低，毒性弱，穩(wěn)定性強(qiáng)，催化活性強(qiáng)，近年來常被作用于制備電極用于葡萄糖的檢測(cè)[58]。以上的研究都能夠證明金屬氧化物能夠作為天然酶的替代方法實(shí)現(xiàn)非酶促機(jī)制的葡萄糖無酶快速檢測(cè)。

1.2.2 利用金屬及合金復(fù)合材料實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶快速檢測(cè) 對(duì)葡萄糖的氧化具有電催化活性并可用于葡萄糖測(cè)定的金屬修飾電極材料有鉑、金、銥、銠、釕、銅、鈷和鎳等[16]。納米結(jié)構(gòu)的金屬因其極小的特征尺寸而受到人們的廣泛關(guān)注，與體積金屬相比，納米結(jié)構(gòu)金屬表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，從而適用于廣泛的應(yīng)用，并且納米結(jié)構(gòu)金屬在電化學(xué)傳感中的應(yīng)用也越來越受歡迎。納米結(jié)構(gòu)Au 因其獨(dú)特的光學(xué)、物理和催化性能，在生物應(yīng)用和生物傳感方面引起了極大的興趣。同時(shí)，越來越多的研究也致力于鈀和碳納米材料的納米雜化，如石墨烯和碳納米管（CNTs），由于這些材料提高了對(duì)葡萄糖氧化的靈敏度和選擇性，在非酶促葡萄糖傳感中有很大的前景。盡管許多材料可以在不需要GOD 的情況下成功氧化葡萄糖，但它們大多數(shù)在生理pH 下不起作用，而是在更高的pH 下具有電活性。鉑基和金基納米材料在生理pH 條件下能夠催化葡萄糖的電化學(xué)氧化。Wang等[59]通過微波水熱合成海膽狀CuO，隨后在HAuCl4和NaBH4存在下自生酸蝕刻海膽狀CuO，制備了具有二維納米材料特性和優(yōu)異葡萄糖傳感性能的花狀CuO/Au 納米顆粒，在酸蝕刻后，Au 納米顆粒均勻分布在CuO 納米薄片的表面，該電極顯示出更高的比表面積、導(dǎo)電性能和催化活性。隨著金屬材料的深入研究，合金復(fù)合材料也不斷涌出，人們發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料的形成不僅經(jīng)濟(jì)，而且通過在具有高導(dǎo)電性和大表面積的基材上均勻分布納米粒子，可使電催化活性最大化。Wang 等[16]將Pt 和Ni 層被濺射在基板上，然后退火形成雙金屬PtNi 材料，作為葡萄糖檢測(cè)的敏感材料，具有較高的靈敏度，用于檢測(cè)人體血清中的葡萄糖含量。因此，金屬及合金復(fù)合材料可以作為一種基于非酶促機(jī)制的葡萄糖無酶快速檢測(cè)方法。

2 基于顏色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶快速檢測(cè)

可視化葡萄糖傳感器是以顏色變化為分析基礎(chǔ)，通過裸眼觀察或使用分光光度計(jì)，直接或間接實(shí)現(xiàn)對(duì)引起顏色變化的現(xiàn)象進(jìn)行定性、定量檢測(cè)?？梢暬咸烟莻鞲衅鞑恍枰獜?fù)雜和昂貴的設(shè)備，并且可用于即時(shí)診斷和現(xiàn)場(chǎng)分析[60]。

2.1 利用非熒光染料實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶顏色反應(yīng)快速檢測(cè)

利用非熒光染料檢測(cè)的原理是基于目標(biāo)物和傳感探針之間的特定化學(xué)反應(yīng)迅速引起的顏色信號(hào)來對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)分析的。在葡萄糖檢測(cè)中，通常利用過氧化物酶底物3, 3', 5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）與H2O2發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，引起底物的顏色發(fā)生改變，通過肉眼直接觀察溶液顏色變化，從而快速大致區(qū)分葡萄糖濃度。同電化學(xué)無酶葡萄糖傳感器類似，許多金屬及金屬氧化物（納米材料）可以模擬過氧化物酶活性，與非熒光染料底物聯(lián)用實(shí)現(xiàn)葡萄糖可視化快速檢測(cè)。李甜等[61]構(gòu)建了一種基于納米金銀染放大的可視化葡萄糖傳感器。采用檸檬酸鈉還原法制備了納米金（酒紅色）。加入葡萄糖時(shí)，托倫試劑被還原為單質(zhì)Ag 沉積在納米金的表面，形成Au-Ag 核殼型納米顆粒，使溶液的吸收光譜發(fā)生藍(lán)移，顏色由酒紅色變?yōu)辄S色。測(cè)量430 nm 處的吸光度，從而得出葡萄糖濃度。AuNPs 催化氧化葡萄糖生成H2O2，H2O2繼續(xù)溶解腐蝕納米銀（AgNPs），引起AgNPs 紫外吸光度的改變，基于此原理制備的無酶葡萄糖比色傳感器用于測(cè)定葡萄糖[62]。楊敏等[63]構(gòu)建出Fe3O4@SiO2@IL結(jié)構(gòu)體，其具有比辣根過氧化物酶更高的催化活性，并能催化H2O2與過氧化物酶底物TMB 形成藍(lán)色產(chǎn)物，用于葡萄糖的比色檢測(cè)。Huang 等[64]報(bào)道了AuNPs 結(jié)合金屬卟啉MOFs 作為雙酶串聯(lián)催化體系比色檢測(cè)葡萄糖。使AuNPs 在二維金屬卟啉MOFs納米片上生長，得到具有過氧化物模擬酶活性的AuNPs/Cu-TCPP（M）復(fù)合材料。而AuNPs 又具有類葡萄糖氧化酶活性，所以該復(fù)合材料能夠用于葡萄糖比色檢測(cè)。吳科研等[65]通過共沉淀法制備了Fe3O4磁性納米粒子，并發(fā)現(xiàn)其具有過氧化酶活性，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子能夠在H2O2存在的情況下氧化2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽生成有色產(chǎn)物。Ganganboina 等[66]采用快速沉淀法制備的水溶性納米CuO，可用作過氧化物酶的納米模擬物，建立了H2O2和葡萄糖的比色檢測(cè)方法。這些CuO 納米粒子相當(dāng)穩(wěn)定，在很寬的pH 和溫度范圍內(nèi)具有幾乎不變的催化活性。除金屬及金屬氧化物基模擬酶外，Qu 等[67]發(fā)現(xiàn)GO-COOH 也具有內(nèi)在的過氧化物模擬酶活性，能催化H2O2氧化辣根過氧化物酶底物TMB，生成藍(lán)色氧化產(chǎn)物（如圖4）。建立了簡便、便宜、高靈敏和高選擇檢測(cè)血清和果汁中葡萄糖的新方法。Wei 等[68]成功制備的六邊形狀的Co-Al LDH 也表現(xiàn)出過強(qiáng)的過氧化物酶活性，他們用L-天冬酰胺作為剝離劑將Co-Al LDH 成功剝離，與未剝離的LDH 相比，剝離之后的Co-Al LDH 表現(xiàn)出更強(qiáng)的過氧化物模擬酶活性，由此構(gòu)建了靈敏、快速的定量檢測(cè)H2O2和葡萄糖比色分析平臺(tái)。為了驗(yàn)證該檢測(cè)平臺(tái)的實(shí)用性，將其進(jìn)一步應(yīng)用于果汁中葡萄糖濃度的檢測(cè)，展現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性。以上研究均利用非熒光染料實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的無酶快速檢測(cè)，與電化學(xué)無酶葡萄糖傳感器比較，具有可見可控的優(yōu)點(diǎn)。

圖4 在H2O2 存在時(shí)，GO-COOH 作為過氧化物模擬酶氧化TMB 機(jī)理圖[67]Fig.4 Mechanism diagram of oxidation of TMB by GO-COOH as a peroxide mimicking enzyme in the presence of hydrogen peroxide[67]

2.2 利用熒光染料實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶顏色反應(yīng)快速檢測(cè)

熒光染料葡萄糖無酶檢測(cè)法是利用熒光團(tuán)供體到受體的共振能量轉(zhuǎn)移，共振能量轉(zhuǎn)移依賴于供體和受體之間的距離，模擬酶與熒光供體之間的共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅，這種猝滅機(jī)制使發(fā)光生物傳感器獲得高信噪比，熒光強(qiáng)度改變，根據(jù)變化后的熒光強(qiáng)度與葡萄糖濃度的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)葡萄糖的無酶檢測(cè)。同時(shí)，熒光與比色聯(lián)用，通過顏色和熒光強(qiáng)度的變化反映葡萄糖的濃度，實(shí)現(xiàn)了熒光染料葡萄糖無酶可視化檢測(cè)。Kuo 等[69]以HAuCl4的檸檬酸鹽溶液為原料合成了含有Au 納米顆粒的溶液，然后再將含Ag+的溶液與其混合，制備了Ag-Au/AgCl 納米復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，所制備的Ag-Au/AgCl 納米復(fù)合物具有優(yōu)異的類過氧化物酶和類氧化酶活性，在H2O2或O2存在時(shí)能催化熒光紅染料（AR）在585 nm 處產(chǎn)生強(qiáng)熒光強(qiáng)度。由此構(gòu)建了一種基于H2O2/ARAg-Au/AgCl 納米復(fù)合物的傳感平臺(tái)。Liu 等[70]建立了基于Au@Ag 的雙金屬核殼納米粒子（Au@AgNPs）和碳納米點(diǎn)（C-dots）的雙信號(hào)葡萄糖檢測(cè)傳感器。C-dots 點(diǎn)作為該傳感器的表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移（SPEET）的供體，其熒光被Au@AgNPs 的銀殼（受體）淬滅，Au@AgNPs 作為比色傳感器，通過顏色和熒光的變化反應(yīng)葡萄糖濃度（如圖5）。Chen 等[71]將熒光素酶生物發(fā)光蛋白（Rluc）與β-環(huán)糊精（β-CD）偶聯(lián)。當(dāng)AuNPs 與β-CD 共價(jià)結(jié)合時(shí)，AuNPs 可猝滅Rluc 的生物發(fā)光強(qiáng)度。加入葡萄糖時(shí)，AuNPs 被取代并通過競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)遠(yuǎn)離Rluc，導(dǎo)致Rluc 的發(fā)光強(qiáng)度發(fā)生變化。變化后的發(fā)光強(qiáng)度與葡萄糖對(duì)數(shù)濃度呈線性關(guān)系。Mai 等[72]利用水熱法合成了氧化鋅納米棒（NRs），并裝飾了金納米顆粒（NPs），用于熒光非酶促葡萄糖檢測(cè)。Mai 等[72]聚合物（PVDMA）中的二甲基內(nèi)酯環(huán)用作連接器作用于結(jié)構(gòu)易打開的親核物質(zhì)。此外，ARS 掃描3-氨基苯硼酸（APBA）將VDMA 的氮內(nèi)酯基團(tuán)與氨基反應(yīng)結(jié)合到PVDMA連接器上合成PVDMA-APBA-ARS 熒光探針。由于多熒光染料ARS 固定在聚合物鏈上，PVDMAAPBA-ARS 熒光聚合物探針具有更高的靈敏度。當(dāng)ARS 被葡萄糖取代后，熒光發(fā)射降低，可用于葡萄糖檢測(cè)。除此之外，一些分子識(shí)別化合物也用于無酶的光學(xué)葡萄糖傳感器，它們包括苯基硼酸功能化水凝膠、含硼酸熒光團(tuán)和硼酸衍生物等。

圖5 基于Au@Ag 的雙金屬核殼納米粒子（Au@AgNPs）和碳納米點(diǎn)（C-dots）的雙信號(hào)葡萄糖檢測(cè)示意圖[70]Fig.5 Schematic representation of dual-signal glucose detection using Au @Ag-based bimetal nuclear-shell nanoparticles（Au@Ag NPs） and carbon nanodots （C-dots）[70]

3 葡萄糖無酶檢測(cè)的應(yīng)用

3.1 葡萄糖無酶檢測(cè)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

葡萄糖的代謝與許多疾病有關(guān)，人體中葡萄糖的含量過高容易引發(fā)糖尿病、胰腺炎、心肌梗死、肝硬化、腦瘤、腦膜炎等疾病，含量過低也會(huì)引起急性肝炎、肝癌、甲狀腺功能不全、低血糖癥等。因此葡萄糖含量的檢測(cè)廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中，而快速簡便的檢測(cè)方法更易得到青睞。Rashtbari 等[73]報(bào)道了納米層錳鈣（Mn-Ca）氧化物納米顆粒（NL-Mn CaO2）模擬葡萄糖氧化酶的活性，建立了一種非酶促比色法檢測(cè)葡萄糖的方法，該方法不僅可用于葡萄糖的肉眼可視化快速檢測(cè)和分析，還可用于葡萄糖的分光光度法定量分析，可應(yīng)用于人血清中葡萄糖的檢測(cè)。朱巍然等[74]通過在氧摻雜氮化碳（OCN）的分散液中化學(xué)沉淀MnO2晶體制備得到二氧化錳-氧摻雜氮化碳（MnO2-OCN）復(fù)合材料，單體的MnO2具有類葡萄糖氧化酶活性，而引入的OCN 具有類過氧化物酶活性，二者結(jié)合構(gòu)建了一種級(jí)聯(lián)催化無酶比色葡萄糖傳感器。在檢測(cè)血清中葡萄糖時(shí)，此傳感器表現(xiàn)出較高的精確性，可應(yīng)用于實(shí)際樣品中葡萄糖的檢測(cè)。目前，很多研究設(shè)計(jì)納米酶代替天然酶進(jìn)行檢測(cè)，但常用的納米酶不能同時(shí)顯示串聯(lián)酶活性和顯色性能，因此需要進(jìn)一步添加天然酶或顯色劑，為了克服這些問題，Zhang 等[75]開發(fā)了人工納米酶替代天然酶，設(shè)計(jì)了一種基于MnO2/葡萄糖直接氧化還原反應(yīng)的一步法無指示劑的血糖比色檢測(cè)。二氧化錳納米材料可作為活性納米氧化劑，以及用于血糖水平檢測(cè)的彩色納米指示劑。在目標(biāo)葡萄糖存在的情況下，MnO2納米氧化劑被還原為Mn2+，導(dǎo)致黃色MnO2溶液的吸光度急劇下降并褪色。此外，該方法在人體血糖監(jiān)測(cè)中具有良好的適用性。它為便攜式血糖和尿糖快速檢測(cè)技術(shù)提供了新的思路，對(duì)緩解人類糖尿病的高發(fā)具有一定的社會(huì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。因此，無論是電化學(xué)無酶葡萄糖傳感器還是可視化無酶葡萄糖傳感器，在臨床醫(yī)學(xué)方面具有巨大潛力。

3.2 葡萄糖無酶檢測(cè)在食品分析中的應(yīng)用

現(xiàn)如今，葡萄糖在人體中起著非常重要的作用，它能夠保護(hù)肝臟，促進(jìn)肝臟的解毒功能；能夠補(bǔ)充熱能和體液；促進(jìn)身體代謝，參與代謝過程等。因此，食品中葡萄糖的檢測(cè)不容小覷。目前，葡萄糖的檢測(cè)方法有很多，但近些年葡萄糖無酶檢測(cè)技術(shù)因方便、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)脫穎而出。該技術(shù)較多應(yīng)用于果汁、飲料等飲品的檢測(cè)，Qu 等[67]發(fā)現(xiàn)類過氧化物酶活性的GO-COOH 應(yīng)用于果汁中葡萄糖含量的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了可視化的無酶檢測(cè)。Wei 等[68]制備的六邊形狀的Co-Al LDH，表現(xiàn)出更強(qiáng)的過氧化物模擬酶活性，構(gòu)建了靈敏、快速的定量檢測(cè)葡萄糖比色分析平臺(tái)，應(yīng)用于果汁中葡糖含量的檢測(cè)。吳雪梅[76]以AuNPs 為催化劑，環(huán)肽模擬物為葡萄糖受體，分別以4-NP 和TMB 為顯色劑，建立了兩種葡萄糖比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了可視化的檢測(cè)，不需要其他復(fù)雜儀器的輔助就可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖的定性、定量分析。其中，4-NP 顯色比色檢測(cè)方法可應(yīng)用于蔬菜、水果和主食樣品中葡萄糖含量的檢測(cè)。TMB 顯色比色檢測(cè)方法也可應(yīng)用于白菜、梨和小麥面粉等樣品中葡萄糖含量的檢測(cè)?？梢钥闯?，葡萄糖無酶檢測(cè)技術(shù)已成功應(yīng)用于各種食品實(shí)際樣品的葡萄糖檢測(cè)中，未來還具有更大的發(fā)展前景。

4 結(jié)論與展望

無酶檢測(cè)技術(shù)分為兩類：電化學(xué)無酶葡萄糖傳感器、可視化無酶葡萄糖傳感器。其中電化學(xué)無酶葡萄糖傳感器又分為修飾電極的電化學(xué)傳感器和模擬酶電化學(xué)傳感器；可視化無酶?jìng)鞲衅鞣譃楸壬珎鞲衅骱凸鈱W(xué)傳感器。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的研究者致力于葡萄糖無酶技術(shù)的開發(fā)，并且這項(xiàng)技術(shù)成功地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、食品分析等領(lǐng)域中。

在生物檢測(cè)中，無酶葡萄糖傳感器目前用于人體血糖水平檢測(cè)，而人體血液的構(gòu)成復(fù)雜，蛋白質(zhì)、糖類、Cl-等一些不穩(wěn)定因素都應(yīng)待考慮，因此，新電極還有待開發(fā)，技術(shù)的進(jìn)一步成熟和普及將造福糖尿病患者。此外，對(duì)無酶葡萄糖傳感器進(jìn)行農(nóng)業(yè)生物檢測(cè)的研究很少，這仍需要科學(xué)家進(jìn)一步探索，以促進(jìn)農(nóng)業(yè)智能的發(fā)展。檢測(cè)無酶葡萄糖傳感器的方法也為使用無酶檢測(cè)方法的其他生物分子提供了廣泛的平臺(tái)。未來將建立更多的無酶檢測(cè)方法來代替使用一些需要酶作為催化劑的檢測(cè)，例如：新型的模擬酶、染色劑等。