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    綠藻多糖研究進(jìn)展

    2022-12-06 02:17:02劉文晶王菲菲
    現(xiàn)代食品 2022年10期
    關(guān)鍵詞:綠藻分子量凝膠

    ◎ 劉文晶,劉 山,王菲菲

    (齊魯醫(yī)藥學(xué)院,山東 淄博 255300)

    褐藻、紅藻、藍(lán)藻和綠藻是海洋中常見的藻類,許多海藻可以食用,且營養(yǎng)價(jià)值高,例如人們常食用的海帶屬于褐藻類,石花菜、角叉菜屬于紅藻類,滸苔、石莼屬于綠藻類。褐藻、紅藻利用率較高,例如卡拉膠褐藻膠等,綠藻研究相對(duì)較少。近年來,海邊經(jīng)常發(fā)生“綠潮”現(xiàn)象,主要是綠藻門的石莼泛濫,它可作為飼料、食品和藥物開發(fā)的原料[1]。由于綠藻多糖結(jié)構(gòu)往往比較復(fù)雜,大多數(shù)為酸性多糖,在結(jié)構(gòu)研究方面研究相對(duì)緩慢,但隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,結(jié)構(gòu)解析方面也有了較大進(jìn)步,本文就近年來綠藻多糖的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

    1 綠藻多糖提取方法

    1.1 水提醇沉法

    水提醇沉法是多糖提取最經(jīng)典的方法,多糖是多羥基化合物,極性較大,所以用極性大的蒸餾水作為溶劑提取綠藻里面的多糖是常用方法。一般先將綠藻沖洗干凈,去除雜質(zhì),烘干后磨碎得干燥藻粉。將藻粉與蒸餾水按照一定比例混合,用常溫或者一定溫度蒸餾水進(jìn)行提取,將多糖溶液濃縮后,用95%的乙醇進(jìn)行醇沉處理,此方法需計(jì)算好料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度等。曹素建等[2]從石莼綠藻類中,按照藻粉與超純水1∶50的料液比,100 ℃熱水提取粗多糖,得率為5.75%。

    1.2 酸/堿提取法

    酸/堿提取法的基本原理是,弱酸或弱堿溶液可以破壞植物細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)多糖成分盡可能多的被提取出來,但要注意的是要選擇適合的pH值來進(jìn)行提取,pH值過大或過小都存在破壞多糖糖苷鍵的風(fēng)險(xiǎn)。付雙超等人[3]確定滇刺棗多糖的最優(yōu)提取條件為檸檬酸調(diào)節(jié)pH值到1.5、溫度90 ℃、時(shí)間80 min,此時(shí)多糖提取率為13.62%。王姝垚等[4]采用0.5 mol·L-1NaOH溶液提取腸滸苔綠藻多糖,提取溫度為100 ℃,提取時(shí)間為2 h,粗多糖得率為6.4%。

    1.3 超聲波提取法

    超聲波提取法主要是通過改變超聲儀器的功率達(dá)到震碎細(xì)胞壁的效果,使細(xì)胞內(nèi)多糖溶出,該方法要注意提取時(shí)間,防止超聲過度,使多糖糖鏈發(fā)生斷裂。彭傳友等[5]采用超聲波提取法提取枇杷葉多糖,結(jié)果表明液料比為33 mL·g-1、功率320 W,溫度60 ℃、提取時(shí)間32 min時(shí)為最優(yōu)提取條件,最優(yōu)得率為5.78%。此法不用添加額外試劑,相對(duì)安全可靠,為枇杷葉多糖的提取提供了最優(yōu)方案。

    1.4 酶解提取法

    酶解法提取多糖可以使用一種提取酶,也可以多種提取酶聯(lián)合使用,原理是用酶破壞植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使細(xì)胞質(zhì)中的多糖充分溶解出來,提高粗多糖的得率。杜涓等[6]采用纖維素酶提取玉米芯多糖,將玉米芯酶解20 h后,酶解法提取分離后的樣品與不加纖維素提取酶的樣品對(duì)比,發(fā)現(xiàn)具有相同的多糖官能團(tuán),掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酶解后的多糖表面變得粗糙,立體結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。酶解后多糖體外抗氧化活性得到了增強(qiáng),主要原因是酶解的過程中也破壞了原來多糖的結(jié)構(gòu),使多糖有一定降解,體外抗氧化活性得到了增強(qiáng)。黃斌[7]在提取海洋綠藻滸苔多糖時(shí),用酶法提取比其他方式多糖得率要高。

    2 綠藻多糖分離純化方法

    2.1 除雜

    綠藻粗多糖提取之后往往摻雜色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),首先需要將色素去除,可以采用活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法等,吸附色素的同時(shí)也會(huì)損失一部分多糖,也可以使用過氧化氫法等化學(xué)方法去除色素,但實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)單的方式是采用透析袋透析法。這種方法是將粗多糖用少量蒸餾水溶解,置于透析袋中,外部大量純水,透析袋內(nèi)色素會(huì)滲透到外部環(huán)境中,但由于多糖粒徑較大無法透過透析袋薄膜,截留在內(nèi)部,實(shí)現(xiàn)脫色目的,此方法要注意透析袋孔徑,防止多糖的外溢。綠藻提取后的多糖有時(shí)會(huì)攜帶蛋白質(zhì)大分子,除蛋白的方式很多,有生物法、物理法和化學(xué)法。曹澤虹等[8]采用不同化學(xué)方法對(duì)駿棗多糖進(jìn)行脫蛋白處理,發(fā)現(xiàn)三氟乙酸法脫蛋白效果最好,樣本損失率最小。

    2.2 分離純化

    常用的多糖分離方法有多級(jí)醇沉法、電泳法等,對(duì)于綠藻多糖最常用的是柱層析法。離子交換色譜原理是多糖分子和色譜柱內(nèi)部填料發(fā)生電吸附作用,被離子色譜柱吸附下來,再通過不同濃度的鹽溶液作為流動(dòng)相,使填料與多糖發(fā)生解吸附作用,不同濃度的流動(dòng)相可以使不同類型的多糖分子解離下來,實(shí)現(xiàn)分離目的。凝膠柱層析法是運(yùn)用分子排阻原理實(shí)現(xiàn)多糖的分離,填料一般是葡聚糖凝膠、丙烯葡聚糖凝膠,原理是小分子量多糖分子在填料的孔徑內(nèi)游走路徑長(zhǎng),流出的時(shí)間長(zhǎng),大分子量多糖分子進(jìn)入填料孔徑內(nèi)受阻力大,不易進(jìn)入孔徑,比較容易流出,流出時(shí)間短。HE等[9]采用Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子色譜柱及Sephacryl S-400凝膠色譜柱對(duì)小枝剛毛藻粗多糖進(jìn)行了分離純化,得到半乳-阿拉伯聚糖OHSS2,并用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定其分子量,呈現(xiàn)單一對(duì)稱單峰,表明多糖純度較高,分離效果較好。

    3 綠藻多樣結(jié)構(gòu)研究

    綠藻多糖往往是酸性多糖,在解析結(jié)構(gòu)時(shí)具有其特殊性,多糖和其他生物大分子類似,具有一級(jí)、二級(jí)等多級(jí)結(jié)構(gòu),一級(jí)結(jié)構(gòu)研究是綠藻多糖研究的基礎(chǔ),隨著分析儀器和分析方法的進(jìn)步,對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)研究有了進(jìn)一步進(jìn)展。高級(jí)結(jié)構(gòu)解析包括二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)研究,主要研究其空間構(gòu)象。

    3.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)

    目前多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)解析較為成熟,一級(jí)結(jié)構(gòu)解析主要集中在單糖組成、相對(duì)分子量、糖殘基鏈接方式、取代基鏈接位點(diǎn)和單糖的構(gòu)型等。相對(duì)分子量可通過低壓凝膠滲透色譜法、高效凝膠滲透色譜法、電泳法和質(zhì)譜法等進(jìn)行檢測(cè),常采取高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖的分子量,根據(jù)液相圖譜的出峰時(shí)間和不同多糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量做線性回歸曲線,根據(jù)樣品出峰時(shí)間即可算出多糖的相對(duì)分子量。單糖組成分析常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜法,即把多糖降解后的單糖,用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生上發(fā)色基團(tuán),與標(biāo)準(zhǔn)單糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間進(jìn)行對(duì)比,確定其單糖組成。甲基化結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是近年來多糖糖殘基解析的常用方式,基本原理是多糖的游離羥基被甲基取代,進(jìn)行酸降解,降解樣品經(jīng)過還原、乙酰化得到甲基化的糖醇乙酸酯,結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析,與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比,即可得出糖殘基之間的鏈接方式。值得注意的是,綠藻多糖多為硫酸多糖,還要把脫硫前后的樣品進(jìn)行甲基化對(duì)照實(shí)驗(yàn)以確定硫酸根的鏈接位置。LI等[10]從一種礁膜綠藻中用熱水提取分離得到粗多糖,進(jìn)一步通過陰離子交換柱和凝膠排阻色譜柱分離得到純品多糖PF2,主要的糖殘基為→3)-α-L-Rhap-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→,分支部分位于→3)-α-L-Rhap-(1→的C-2位置上,硫酸根基團(tuán)位于→2)-α-L-Rhap-(1→的C-3位置上。

    3.2 高級(jí)結(jié)構(gòu)

    多糖作為一種生物大分子,分子量比較大,且海藻多糖往往含有酸性基團(tuán),空間結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。由于空間結(jié)構(gòu)對(duì)生物活性影響較大,所以多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)解析十分重要,主要包括二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)研究,研究方法有核磁共振法、X-射線衍射技術(shù)、圓二色譜法、糖芯片技術(shù)和分子模擬技術(shù)等方法。DAYAL等[11]利用X射線衍射技術(shù)分析了細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)表征,得到總輪廓、結(jié)晶度、晶體尺寸等相關(guān)參數(shù)。

    4 綠藻多糖活性研究

    近年來,綠藻多糖的活性一直是多糖研究的熱點(diǎn),包括抗凝血、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和免疫調(diào)節(jié)等活性研究。CAO等[12]從礁膜綠藻中提取出一種多糖,命名為MS-1,經(jīng)測(cè)定,MS-1在體內(nèi)外均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凝血活性,并顯著降低血小板聚集能力。通過血栓的濕重和長(zhǎng)度,以及電誘導(dǎo)頸動(dòng)脈血栓形成的血栓閉塞時(shí)間來評(píng)估,MS-1在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗血栓活性。這些結(jié)果提示,MS-1可能是一種很有前途的預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的海洋藥物。QIN等[13]從綠藻線形硬毛藻中提取得到一種硫酸鼠李多糖,對(duì)人胰島胰樣多肽的(Human Islet Amyloid Polypeptide,hIAPP)聚集具有抑制作用,可使hIAPP聚集形態(tài)改變,證明該多糖能有效抑制hIAPP聚集,具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性。綠藻多糖,不僅可以用于醫(yī)學(xué)研究,在食品、化工方面也有重要應(yīng)用,比如石莼聚糖可以作為優(yōu)良的食品添加劑,滸苔多糖可以作為果凍里面的凝膠,綠藻多糖還可以作為有機(jī)肥料或者動(dòng)物飼料。

    5 結(jié)語

    綠藻多糖是一種非常特殊的天然大分子,目前還沒有被深度開發(fā)利用,目前集中在結(jié)構(gòu)研究和活性研究,在醫(yī)藥、養(yǎng)殖、化工和食品方面有了一定應(yīng)用。綠藻由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜,結(jié)構(gòu)解析比較煩瑣,尤其是高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析難度較大,結(jié)構(gòu)與生物活性的構(gòu)效關(guān)系還不夠明朗。為更好地研究多糖的結(jié)構(gòu),可將其進(jìn)行寡糖制備,通過確定寡糖的結(jié)構(gòu),進(jìn)而推斷多糖結(jié)構(gòu)。綠藻多糖的活性研究取得了較大進(jìn)步,但其分子量巨大,分子難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,因此其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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