N6-甲基腺苷修飾與心血管疾病關(guān)系研究

戴承曄 鄧毅凡 徐笑挺 何勝虎 張晶

(1.大連醫(yī)科大學(xué)揚州臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225001；2.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇 揚州 225001)

心血管疾病是中國人死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，近5年內(nèi)心血管疾病致死率占中國人群死亡率的40%[1]，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌病和心力衰竭(心衰)均為直接導(dǎo)致心源性死亡的病因。因此進一步發(fā)掘心血管疾病的發(fā)病機制具有重要意義。表觀遺傳學(xué)是近年的研究熱門，在DNA不發(fā)生改變的情況下，通過RNA甲基化、DNA甲基化、基因組印記和基因沉默等多種方式使基因發(fā)生可遺傳變化。其中RNA甲基化修飾被證明直接參與了心血管疾病、代謝類疾病以及惡性腫瘤的病理生理機制，且N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾占RNA甲基化修飾的80%以上。因此，作為心血管疾病的潛在治療靶點，現(xiàn)就m6A修飾與心血管疾病的關(guān)系做一綜述。

1 m6A概述

m6A修飾是指腺嘌呤的第6位氮原子發(fā)生了甲基化修飾，主要發(fā)生在信使RNA(messenger RNA，mRNA)分子的3’-非翻譯區(qū)和終止密碼子附近[2-3]。作為真核細胞中最普遍和最保守的RNA修飾，m6A修飾幾乎影響mRNA代謝的各個方面，包括保持RNA的穩(wěn)定性、RNA選擇性剪接和翻譯[4]，并以此影響細胞的凋亡、自噬和免疫應(yīng)答等。

m6A修飾是一種由酶主導(dǎo)動態(tài)可逆的過程，其中有三類酶參與此過程，包括“編碼器(writer)”——甲基化酶、“擦除器(eraser)”——去甲基化酶以及“讀碼器(reader)”——m6A閱讀蛋白。甲基化酶作為“編碼器”可使mRNA中的A堿基發(fā)生甲基化，形成m6A。該酶由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase like protein 3，METTL3)和甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase like protein 14，METTL14)及其輔助因子腎母細胞瘤1相關(guān)蛋白，以及其他蛋白如病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白、RNA結(jié)合基序蛋白15、鋅指CCCH 結(jié)構(gòu)域蛋白13、Casitas B系淋巴瘤原癌基因轉(zhuǎn)化序列樣蛋白1構(gòu)成[5-6]。脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)和AlkB同源物5是m6A的去甲基化酶，它們可逆轉(zhuǎn)m6A的甲基化修飾[7]。而甲基化閱讀蛋白能識別m6A介導(dǎo)的生理行為并影響 RNA的功能。隨著甲基化RNA免疫沉淀技術(shù)、甲基化RNA免疫沉淀測序和高通量測序方法的逐漸成熟，越來越多的證據(jù)顯示m6A在心血管疾病中具有重要作用。

2 RNA m6A修飾在心血管疾病中的作用

2.1 心衰

心衰是一種由結(jié)構(gòu)和功能性心臟異常引起心輸出量減少和心腔內(nèi)壓力升高的臨床綜合征[8]。多種復(fù)雜的生物學(xué)途徑網(wǎng)絡(luò)影響了心臟的結(jié)構(gòu)和功能，引起心臟收縮和舒張功能不全，這是心衰演變的關(guān)鍵。在射血分數(shù)降低性心衰的心肌細胞中，RNA m6A修飾發(fā)生了改變，但mRNA水平卻未受影響，這意味著m6A調(diào)控與DNA轉(zhuǎn)錄無關(guān)。在動物實驗中，特異性敲除METTL3小鼠的心臟會隨年齡增長而出現(xiàn)心肌細胞延長，心室擴張顯著增加，心臟整體功能下降，證明甲基化酶中METTL3可通過調(diào)節(jié)m6A修飾影響心臟形態(tài)和功能[9]。

除了含有METTL3的蛋白質(zhì)復(fù)合物普遍負責(zé)mRNA的m6A修飾形式，去甲基化酶中的FTO催化m6A去除甲基，Berulava等[10]報道，心衰過程中m6A甲基化的水平逐漸升高，F(xiàn)TO表達逐漸降低，其中有大量mRNA發(fā)生高甲基化修飾，加快mRNA的降解，降低與核糖體的結(jié)合力，導(dǎo)致心衰更快進展，患者左室射血分數(shù)顯著降低，心臟功能受損。這意味著維持FTO表達有助于通過改善心臟穩(wěn)態(tài)來保護和修復(fù)心肌細胞的功能。Mathiyalagan等[11]的研究團隊發(fā)現(xiàn)，與健康心臟組織相比，衰竭心臟的壞死區(qū)和壞死周圍區(qū)m6A甲基化修飾增加，F(xiàn)TO表達顯著降低，特別是多聚腺苷酸陽性的m6A甲基化修飾升高最為明顯，正常水平的多聚腺苷酸可維持mRNA的活性、穩(wěn)定性以及正常翻譯，而過度的m6A甲基化在mRNA的多聚腺苷酸尾處修飾可能是導(dǎo)致心肌基因表達異常的主要原因。由于FTO增強了肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵mRNA的穩(wěn)定性，防止肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵的降解，發(fā)揮共轉(zhuǎn)錄的功能[12]，心衰時FTO表達下降，m6A甲基化修飾異常升高，肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵蛋白表達下降，鈣離子處理能力降低，心臟功能減弱[13]。而過表達去甲基化酶FTO可調(diào)節(jié)心臟中m6A修飾的水平，使心肌纖維化顯著減少，并促進血管生成，改善心臟功能。總體而言，依賴FTO的心臟m6A甲基化組在心衰期間對心臟收縮起著基本的調(diào)節(jié)作用。除了m6A修飾中的“編碼器”和“擦除器”外，還發(fā)現(xiàn)了“讀碼器”(或“m6A識別因子”)對心臟功能的調(diào)控。Zhang等[14]在射血分數(shù)保留性心衰患者的心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化相關(guān)因子與疾病相關(guān)mRNA同步增高，其中m6A閱讀蛋白YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白(YTH domain family protein，YTHDF)2通過介導(dǎo)mRNA降解來控制目標轉(zhuǎn)錄物的半衰期，而YTHDF1直接結(jié)合mRNA促進翻譯并抑制細胞中Wnt/β-catenin通路的活性。

2.2 心肌肥厚

肥厚型心肌病是心肌損傷的常見原因之一，常伴有心肌肥厚等病理現(xiàn)象，心肌肥厚是心肌對慢性壓力或容量超負荷產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，METTL3介導(dǎo)的mRNA m6A甲基化修飾對于體內(nèi)和體外心肌細胞肥大的病理過程至關(guān)重要。METTL3會引起心肌細胞重構(gòu)，使心肌細胞獲得經(jīng)刺激(如衰老和壓力)引起心臟代償性肥大的能力。同時心臟特異性METTL3敲除小鼠在體內(nèi)也顯示出促進偏心性心肌細胞重構(gòu)和功能障礙傾向。Dorn等[9]最近的一項研究表明，METTL3可通過絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路誘導(dǎo)病理性心肌肥厚的發(fā)生，特異性過表達METTL3可提高MAP3K6、MAP4K5和MAPK14的水平。

FTO作為m6A甲基化修飾的去甲基化酶，可增強體外α腎上腺素刺激，抑制心肌細胞肥大，維持心肌的正常形態(tài)[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠進行FTO基因敲除，可導(dǎo)致代謝性心肌肥厚發(fā)生[16]。FTO的表達降低和m6A甲基化修飾顯著增高可能是壓力負荷誘導(dǎo)心肌肥厚的重要機制。以上提示心肌細胞m6A甲基化修飾增加會導(dǎo)致代償性心肌肥厚，而降低則使心肌細胞發(fā)生重構(gòu)和功能障礙。

2.3 冠狀動脈疾病

冠狀動脈疾病是一種典型的由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用產(chǎn)生的常見疾病。血管損傷引起動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成，侵蝕血管壁，導(dǎo)致血管管腔狹窄和心肌缺血。Mo等[17]利用公開的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)數(shù)據(jù)匯總結(jié)果研究了m6A單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)對冠狀動脈疾病的影響，發(fā)現(xiàn)第15號染色體上的基因間SNP rs7173743和rs4468572十分相近，這些位點與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病顯著相關(guān)。

2.3.1 AS

AS是冠狀動脈疾病最常見的病理改變，巨噬細胞的激活和平滑肌細胞增生與遷移影響著動脈粥樣斑塊。細胞炎性壞死是一種新的炎性細胞程序性死亡，已被證明與AS密切相關(guān)。Guo等[18]發(fā)現(xiàn)circ-0029589在急性冠狀動脈綜合征患者巨噬細胞中m6A修飾水平升高，降低circ-0029589上的m6A修飾水平可增加其表達，從而促進AS患者外周血單核巨噬細胞的炎癥產(chǎn)生。AS的發(fā)生始于血管內(nèi)皮細胞的功能障礙和炎癥。通過檢測AS患者的心血管內(nèi)皮細胞，Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)METTL14作為一種甲基化酶，通過m6A修飾促進成熟miR-19a的產(chǎn)生，從而加快AS血管內(nèi)皮細胞的增殖和侵襲，影響AS斑塊的穩(wěn)定性。多種炎癥因子可引起內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞通透性增加，屏障功能受損，以及黏附分子如細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達增加，導(dǎo)致單核細胞黏附和遷移到內(nèi)皮下，進而觸發(fā)AS的發(fā)生和發(fā)展。METTL14調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞組1(Forkhead box O1，F(xiàn)OXO1) mRNA的m6A甲基化修飾，并通過YTHDF1識別促進FOXO1 mRNA的翻譯，形成的FOXO1直接作用于VCAM-1和ICAM-1的啟動子區(qū)域，上調(diào)內(nèi)皮黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表達，最終導(dǎo)致AS的發(fā)展。此外，METTL14通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路和內(nèi)皮細胞中的腫瘤壞死因子信號通路顯著促進腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥。隨后的體內(nèi)試驗顯示，METTL14基因敲除可在小鼠中以m6A依賴的方式抑制AS斑塊的形成[20]。通過以上研究表明，m6A修飾通過調(diào)節(jié)心血管內(nèi)皮細胞功能、內(nèi)皮細胞炎癥和巨噬細胞炎性壞死，影響AS的發(fā)生和發(fā)展。

血脂異常是AS的危險因素之一，在Mo等[21]的另一項研究中，該團隊證實脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)2的3’-非翻譯區(qū)位點的m6A-SNP rs6859表達與甘油三酯、總膽固醇和高/低密度脂蛋白膽固醇相關(guān)，提示rs6859可能是脂質(zhì)代謝相關(guān)的多功能SNP。而高/低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和甘油三酯水平正是AS明確的危險因素[22]。

Song等[23]最近研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白217通過激活m6A去甲基化酶FTO的轉(zhuǎn)錄，增加FTO，降低m6A甲基化修飾水平，促進脂肪生成增加和肥胖，并以依賴m6A-YTHDF2的方式調(diào)節(jié)m6A修飾。YTHDF2和鋅指蛋白217的相互作用也維持著FTO的活性。m6A甲基化修飾的功能失調(diào)可能導(dǎo)致包括肥胖和糖尿病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)展。上述證據(jù)證明表觀遺傳m6A修飾可通過各種方式參與AS斑塊的形成，導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生[24]。

2.3.2 急性心肌梗死

急性心肌梗死是由動脈血栓形成或粥樣斑塊破裂引起的心肌急性缺血性壞死。細胞自噬和凋亡與心肌細胞損傷程度相關(guān)，抑制細胞凋亡可減輕心肌梗死程度，自噬的減少通常伴隨細胞凋亡的增加。研究者發(fā)現(xiàn)缺血心臟中FTO表達的降低可升高m6A甲基化修飾的整體水平，導(dǎo)致心肌細胞收縮功能增強、血管生成和纖維化減少[25]。Wang等[26]證明FTO基因可提高自噬相關(guān)蛋白5和自噬相關(guān)蛋白7的蛋白質(zhì)表達，而抑制自噬可導(dǎo)致細胞凋亡增加，說明缺血性心肌病與自噬有關(guān)。缺血后心肌中FTO的表達降低，除自噬外，F(xiàn)TO調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄物(Mhrt)的m6A甲基化修飾，影響Mhrt下游基因并參與心肌細胞凋亡，這意味著FTO表達的增加可延緩急性心肌梗死后不良的左心室重塑，減輕缺氧引發(fā)的心肌細胞功能障礙[27]。心肌細胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧試驗后，METTL3表達增多，促進RNA結(jié)合蛋白異質(zhì)性胞核核糖核蛋白D與轉(zhuǎn)錄因子EB前mRNA的結(jié)合，從而降低下游靶基因轉(zhuǎn)錄因子EB的表達，影響腺苷酸活化蛋白激酶雷帕霉素蛋白信號通路，促進細胞凋亡，RNA去甲基化酶AlkB同源物5的過表達可作用于轉(zhuǎn)錄因子EB以逆轉(zhuǎn)METTL3誘導(dǎo)的細胞損傷[28]。

2.4 血管鈣化

血管鈣化是磷酸鈣復(fù)合物在脈管系統(tǒng)中的礦物質(zhì)沉積[29]。Chen等[30]探討METTL14在血管鈣化的分子、細胞和器官水平的病理機制。他們發(fā)現(xiàn)METTL14在硫酸吲哚酚誘導(dǎo)人動脈平滑肌細胞中表達增加，從而誘導(dǎo)RNA中m6A甲基化修飾，削弱血管的修復(fù)功能。鈣化動脈中METTL14的表達降低可使硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的m6A甲基化修飾水平升高和人動脈平滑肌細胞鈣化水平降低。由于METTL14唯一已知的主要功能是使單鏈核RNA中的m6A甲基化，可見m6A甲基化修飾在血管鈣化中有重要作用。在人動脈平滑肌細胞的鈣化模型中，下調(diào)METTL14水平可減輕鈣化，促進血管修復(fù)。據(jù)此，靶向METTL14信號可能是治療血管鈣化的有效方向。

2.5 高血壓

高血壓是動脈內(nèi)血壓持續(xù)升高的一種長期狀態(tài)。持續(xù)的血壓升高會對腎和心臟等靶器官產(chǎn)生內(nèi)皮細胞損傷和微循環(huán)障礙等負面影響，從而導(dǎo)致嚴重的心血管疾病。Mo等[31]發(fā)現(xiàn)1 236個m6A-SNP，其中有761個(11.1%)和799個(12.1%)m6A-SNP與收縮壓和舒張壓相關(guān)，包括rs9847953和rs197922。利用GWAS 2011和GWAS 2018的全基因組關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，他們還發(fā)現(xiàn)與舒張期血壓相關(guān)的SNP存在m6A甲基化修飾。環(huán)核糖核酸(circRNA)的異常表達是多種高血壓的預(yù)測性生物標志物的潛在治療靶點，m6A對circRNA進行堿基甲基化修飾，促進細胞中circRNA蛋白質(zhì)翻譯的高效啟動。Su等[32]繪制了缺氧性肺動脈高壓中m6A circRNA的轉(zhuǎn)錄組全圖，并確定m6A水平影響缺氧誘導(dǎo)肺動脈高壓的血管內(nèi)皮細胞中circRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)的下調(diào)或上調(diào)。

3 結(jié)語

動態(tài)和可逆的m6A修飾已通過多種機制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達。m6A及其調(diào)節(jié)蛋白的失調(diào)可作為潛在的心血管疾病標志物，參與心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)、心肌肥厚、心臟重構(gòu)與修復(fù)、血管內(nèi)皮功能及炎性反應(yīng)、血管鈣化和高血壓這些相關(guān)疾病，擴大了大家對心臟功能損傷的理解，并可能為修復(fù)受損心臟組織尋求新的機遇。值得注意的是，臨床上有效應(yīng)用FTO抑制劑和其他m6A調(diào)節(jié)蛋白抑制劑，可能會為治療心血管疾病提供更有效的治療策略。