羥基紅花黃色素A對缺血再灌注損傷保護機制的研究進展

汪潔，陳綸華，李涵喬，伊雪

(1.廈門醫(yī)學院 a.機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室,b.基礎醫(yī)學部，福建 廈門 361023； 2.廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心胸外科，福建 廈門 361021； 3.廈門大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系,福建 廈門 361102)

紅花為菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥管狀花，具有通絡活血、祛瘀止痛的功效，常用于心腦血管疾病(如高血壓、冠心病、腦血栓)的輔助治療[1]。紅花中含有黃酮類、色素、揮發(fā)油、脂肪酸等多種化學成分，其中黃酮類化合物紅花黃色素是紅花的主要有效成分之一，而羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)是紅花黃色素中含量最高、活血化瘀最好的水溶性活性單體[2-3]。HSYA為單查爾酮苷類結構，分子式為C27H32O16，分子量為612。HSYA在健康人體的生物半衰期為2.6～4.4 h，1～1.1 h可達吸收峰值[4-5]，人體的健康狀態(tài)也會影響藥物的代謝過程?，F(xiàn)代藥理學研究表明，HSYA具有擴張微細動脈、增加組織血液灌量、改善微循環(huán)的作用，同時能抗血小板聚集、抗凝血、抑制血栓形成，并能調節(jié)血脂、清除有害氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用[6]。近年隨著對HSYA研究的深入發(fā)現(xiàn)，HSYA具有如下藥理學作用：①抗細胞凋亡[7]、促進血管生成[8-9]，發(fā)揮保護缺血/缺氧和缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的作用；②抑制活性氧的產(chǎn)生、增加線粒體膜電位和葡萄糖攝取的能力[10-11]，起到保護線粒體和抗氧化損傷的作用；③調節(jié)自噬水平、維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12-13]；④促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長[14-15]；⑤改善肺功能[16-17]、保護肝功能[18-19]等。

IRI指缺血組織和器官重新獲取血液灌注和氧供后損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的過程。IRI與組織器官的缺血時間、側支循環(huán)、對氧的需求程度及再灌注條件等密切相關。缺血時間短，恢復血供后，組織或器官的功能多無明顯損傷；缺血時間過長，組織或器官已發(fā)生不可逆性損傷或壞死，則觀察不到IRI。因此，缺血時間太短、太長均不易發(fā)生IRI。另外，不易形成側支循環(huán)、需氧量高的組織器官易發(fā)生IRI。再灌注液的溫度、壓力、pH值等也影響IRI。IRI是一個復雜的病理生理過程，目前認為其發(fā)生與細胞凋亡、鈣超載、氧自由基生成、內(nèi)皮細胞功能障礙、白細胞激活、能量代謝障礙等因素有關。HSYA在抗IRI方面發(fā)揮作用，其對IRI的保護機制與多種途徑、信號通路有關，對不同臟器IRI的保護機制也不同，且大部分保護機制尚處于探索階段?，F(xiàn)就HSYA對IRI的保護機制進行綜述，以為臨床治療IRI提供理論依據(jù)。

1 HSYA對心肌IRI保護機制

1.1激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)/己糖激酶Ⅱ通路 PI3K/Akt是再灌注損傷補救激酶信號通路家族重要成員。PI3K/Akt的激活可有效減少再灌注損傷導致的細胞死亡[20]。己糖激酶Ⅱ是一種糖酵解酶，負責啟動無氧葡萄糖代謝。近年來發(fā)現(xiàn)己糖激酶Ⅱ在IRI和細胞衰老的發(fā)病機制中起重要作用，且Akt激活的己糖激酶Ⅱ可影響線粒體功能、活性氧產(chǎn)生以及線粒體能量代謝，并參與調控細胞凋亡[21]。Min和Wei[22]以H9C2細胞為研究對象，建立缺氧-復氧損傷細胞模型(常溫缺氧12 h，復氧4 h)發(fā)現(xiàn)，HSYA可顯著降低乳酸脫氫酶、胱天蛋白酶(caspase)-3的水平，減輕氧化應激損傷和凋亡。進一步用PI3K抑制劑(LY294002)或己糖激酶Ⅱ抑制劑(3-BrPA)預處理，HSYA的保護作用明顯減弱。說明HSYA可通過激活PI3K/Akt/己糖激酶Ⅱ通路，恢復線粒體能量代謝，減少活性氧生成，從而抑制慢性缺氧導致的細胞凋亡。

1.2抑制Janus激酶(Janus kinase,JAK)2/信號轉導及轉錄活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)1信號通路 JAK/STAT信號通路是眾多細胞因子信號轉導的共同途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、侵襲、代謝、凋亡及炎癥等過程。JAK/STAT通路的激活可促進各種疾病的發(fā)生、發(fā)展。Zhou等[7]通過結扎雄性SD大鼠左冠狀動脈前降支30 min后再灌注2 h建立在體缺血再灌注模型，結扎前30 min腹腔內(nèi)注射5 mg/kg HSYA，結果顯示，大鼠出現(xiàn)的心肌損傷較輕，JAK2和STAT1活性降低，抗氧化能力增強，凋亡減少；同時，他們應用H9C2心肌細胞體外制備缺氧-復氧模型，給予HSYA后觀察心肌損傷、氧化應激、線粒體膜蛋白等情況，結果顯示JAK2/STAT1通路的失活增強了HSYA對缺氧-復氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用。說明HSYA治療對減少缺血再灌注誘導的心肌損傷有效，這可能在很大程度上抑制JAK2/STAT1通路。

1.3減輕鈣超載 鈣超載既是IRI的原因，又是缺血再灌注的結果：①胞質內(nèi)Ca2+聚積(鈣超載)使肌質網(wǎng)及線粒體攝取鈣的同時消耗大量ATP，線粒體內(nèi)的Ca2+可形成磷酸鈣沉淀，干擾線粒體氧化磷酸化，最終導致細胞能量供應不足。②聚積的Ca2+可激活磷脂酶類，促進細胞膜磷脂成分降解，破壞細胞膜結構。受損的細胞膜又增加了對Ca2+的通透性，進一步促進鈣超載。此外，細胞內(nèi)Ca2+還可激活鈣依賴性蛋白水解酶，進而產(chǎn)生過多的自由基，損害組織細胞。③細胞內(nèi)Ca2+水平升高可激活ATP酶水解高能磷酸鹽，進而釋放出大量H+，加重酸中毒。此外，鈣超載還可引起再灌注后Na+/Ca2+交換異常，導致心律失常、肌纖維過度收縮，進而引起心肌纖維斷裂。王麗娜等[23]通過結扎雄性SD大鼠左冠狀動脈前降支30 min，缺血再灌注24 h建立缺血再灌注模型，再灌注前5 min經(jīng)鼠尾靜脈注射10 mg/kg HSYA，結果發(fā)現(xiàn)：靜脈注射HSYA可明顯降低缺血再灌注大鼠Ca2+升高的幅度，且可明顯增加肌質網(wǎng)鈣泵肌質網(wǎng)鈣ATP酶的含量，該酶可調控細胞器鈣庫對Ca2+的重新攝入。提示HSYA可減輕缺血再灌注損傷后心肌細胞中出現(xiàn)的鈣超載，并明顯提高鈣庫對Ca2+的攝入，其作用是通過肌質網(wǎng)鈣ATP酶調控的。

1.4減輕炎癥反應 缺血再灌注時，細胞黏附分子、趨化因子與細胞因子生成增多，導致炎癥反應過度激活，引起微血管損傷及細胞損傷。劉永剛等[24]通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支40 min后再灌注160 min，建立心肌IRI模型，于結扎左冠狀動脈10 min后經(jīng)股靜脈給予HSYA，測定心肌梗死面積、心肌酶學、心肌組織中炎癥細胞因子[白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等]的水平以及髓過氧化物酶活性。結果顯示，HSYA可減少心肌缺血再灌注后大鼠心肌標志酶乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、血清肌鈣蛋白的漏出，并通過減輕心肌炎癥反應保護心肌細胞。張園和張妍[25]通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min，再灌注120 min，建立心肌IRI模型。其中HSYA組于造模前14 d分別給予10、20 mg/kg的HSYA，灌胃給藥。比較兩組大鼠腫瘤壞死因子-α、IL-6、C反應蛋白等炎癥指標和心肌組織學指標發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，HSYA組炎癥和心肌損傷明顯減輕。提示HSYA保護心肌IRI的機制可能與調控炎癥因子，減輕炎癥反應有關。

1.5激活AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路 AMPK是調控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶，也稱“細胞能量調節(jié)器”，主要用于協(xié)調代謝，維持能量的供求平衡。AMPK具有調控蛋白質代謝(如通過調節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路抑制蛋白質合成)、脂質代謝(如促使乙酰輔酶A羧化酶和3-羥基-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶磷酸化，從而抑制肝脂肪酸和膽固醇合成)、糖類代謝(如通過葡萄糖轉運體向胞膜轉位以增加機體對葡萄糖的攝取，或抑制果糖1，6-二磷酸酶抑制糖異生，最終降低血糖)、誘導細胞凋亡(如通過促進氧化應激誘導凋亡)、調節(jié)自噬和線粒體穩(wěn)態(tài)(如通過磷酸化unc-51樣激酶促進線粒體自噬[26]；同時通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α轉錄調控新的線粒體產(chǎn)生，實現(xiàn)線粒體的凈化作用)及抗炎、抗衰老等作用[27-28]。Ye等[13,29]通過結扎成年雄性SD大鼠前降支30 min再灌注24 h建立IRI模型，分別于結扎左冠狀動脈前降支前30 min或再灌注后30 min經(jīng)鼠尾靜脈注入HSYA，結果發(fā)現(xiàn)HSYA可通過激活AMPK信號通路，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路，增加細胞自噬，抑制炎癥介質上調，最終減少心肌細胞凋亡，緩解心肌缺血再灌注損傷。

1.6誘導藥理性預適應 藥理性預適應是指預先給予某種損傷性刺激后，機體組織器官對這些有害刺激產(chǎn)生的耐受性或適應性。而缺血預適應則是指短期缺血應激使機體對隨后長時間的缺血再灌注損傷產(chǎn)生明顯保護作用的一種適應性機制。目前缺血性預適應已經(jīng)擴展到藥理性預適應，即應用藥物替代缺血以誘導預適應樣保護作用。張建軍等[30]使用成年Wistar大鼠建立缺血預適應模型(缺血5 min、再灌注5 min，循環(huán)3次)及缺血再灌注模型(結扎左冠狀動脈30 min造成缺血，再灌注120 min)，缺血再灌注模型中，缺血前15 min及再灌注后15 min分別經(jīng)鼠尾靜脈注射HSYA。通過檢測心肌梗死面積、血漿降鈣素基因相關肽、6-酮基-前列腺素F1a等指標，觀察缺血預適應和HSYA對心肌IRI的影響。結果顯示，HSYA對心肌IRI的影響與心肌缺血預適應相似[30]。線粒體分子Cx43是一種縫隙連接蛋白，研究發(fā)現(xiàn)增加Cx43的表達可增強缺血性預適應的心肌保護作用[31]。孫玉芹[32]研究發(fā)現(xiàn)，給予HSYA治療后心肌細胞線粒體Cx43的表達升高，具有抗IRI的作用，其作用與缺血性預適應相似。以上研究提示，HSYA對心肌IRI的保護作用可能部分與誘導缺血性預適應有關。

2 HSYA對腦IRI的保護機制

2.1抑制炎癥介質釋放，降低自由基反應 氧自由基的生成是導致IRI的重要機制。氧自由基可誘導炎癥因子產(chǎn)生，加重再灌注損傷。清除超氧陰離子或抑制氧自由基的生成可有效減輕IRI。HSYA通過抑制IL-6、IL-1b、腫瘤壞死因子等炎癥介質釋放，減輕一氧化氮合酶、髓過氧化物酶等自由基反應引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷，發(fā)揮保護作用[9]。Sun等[33]認為，HSYA的保護作用至少部分來自局部缺血再灌注后炎癥反應的抑制。

2.2激活PI3K/Akt信號通路 PI3K/Akt是細胞內(nèi)重要的抗凋亡信號通路。Akt是PI3K信號通路中重要的下游靶點，參與細胞生長、代謝及抗凋亡等多種生物學過程。IRI時抑制了PI3K/Akt信號通路，但激活了下游的糖原合成酶激酶-3β，而糖原合成酶激酶-3β可激活caspases家族和Bcl-2家族中相關凋亡因子，進而促進細胞凋亡[34-35]。譚燕萍等[36]采用線栓法復制成年SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，造模成功后經(jīng)鼠尾靜脈注入HSYA 5 mg/kg，結果發(fā)現(xiàn)HSYA具有神經(jīng)保護作用，這可能與血小板衍生生長因子介導的PI3K/Akt通路的激活有關。Chen等[37]通過堵塞大腦中動脈建立Wistar大鼠缺血再灌注模型，堵塞后15 min經(jīng)鼠尾靜脈注入HSYA，結果發(fā)現(xiàn)HSYA防止腦IRI部分是通過激活PI3K/Akt信號通路，減少再灌注損傷導致的細胞死亡發(fā)揮作用。

2.3關鍵樞紐蛋白 HSYA通過影響部分關鍵樞紐蛋白的表達而起到減輕IRI的作用。戚智鋒等[38]用線栓法制備大腦中動脈缺血1.5 h再灌注72 h模型，其中實驗組于缺血30 min、再灌注時、再灌注24 h、再灌注48 h 4個時間點經(jīng)鼠尾靜脈分別注射2 mg/kg的HSYA，對照組給予同劑量生理鹽水。結果顯示實驗組通過降低半影區(qū)基質金屬蛋白酶9蛋白的表達，提高claudin-5蛋白的表達水平，減輕半影區(qū)血腦脊液屏障損傷。Xu等[39]采用無標記定量蛋白組學分析方法研究調節(jié)蛋白對大鼠腦IRI的影響，結果發(fā)現(xiàn)HSYA對抗腦IRI的關鍵樞紐蛋白是Eftud2、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、Rab11、Ppp2r5e。

2.4抗氧化作用 IRI情況下，化學性質活潑的自由基產(chǎn)生過多，在體內(nèi)可破壞蛋白質和核酸的結構與功能、引起脂質過氧化，造成機體損傷。Sun等[40]將SD大鼠大腦中動脈堵塞60 min，再灌注24 h建立腦IRI模型，給予不同劑量的HSYA后發(fā)現(xiàn)，12/15-脂氧合酶的表達和活性降低，免疫球蛋白G漏出和腦組織水的含量減少，提示HSYA減弱了腦蛋白的氧化和硝基化修飾，并呈劑量依賴效應，提高了血腦屏障的滲透性，減少了腦水腫發(fā)生。Wei等[41]將成年雄性Wistar大鼠大腦中動脈堵塞2 h，再灌注24 h建立腦IRI模型，給予不同劑量的HSYA后觀察丙二醛、超氧化物歧化酶、總抗氧化能力等的情況發(fā)現(xiàn)，HSYA可通過抗氧化作用對抗腦IRI引起的神經(jīng)元損壞。

2.5抑制線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放 mPTP在IRI時的細胞存活和死亡中扮演重要角色。在不同刺激因素誘導的凋亡中，mPTP被打開，線粒體跨膜電位下降，細胞色素C、Ca2+及某些胱天蛋白酶原釋放至胞質中，最終導致細胞凋亡[42]。Ramagiri和Taliyan[43]發(fā)現(xiàn)，HSYA治療可明顯改善IRI大腦的腦神經(jīng)損傷嚴重程度、旋轉實驗、Y迷宮等的評分，降低腫瘤壞死因子-α水平和腦梗死率，但在治療前20 min用mPTP開放劑羧基蒼術苷處理后，HSYA的保護作用減弱，提示HSYA的保護作用可能是通過抑制mPTP開放實現(xiàn)。Huang等[44]的研究探討了HSYA影響缺血再灌注時腦微血管內(nèi)皮細胞線粒體的機制，用U0126抑制胞外信號調節(jié)激酶，用CypD(Cyclophilin D)干擾小RNA轉染，以反向驗證HSYA的保護作用是否通過調節(jié)促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節(jié)激酶/CypD通路發(fā)揮作用。結果顯示，HSYA預處理顯著提高了微血管內(nèi)皮細胞的活力，減少了缺氧缺糖復氧后活性氧的產(chǎn)生、mPTP的開放和細胞色素C的易位。提示HSYA對缺血再灌注的保護作用可能是通過抑制促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節(jié)激酶/CypD通路mPTP的開放，減少線粒體細胞色素C的輸出實現(xiàn)。

2.6抑制Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4通路介導的信號反應 TLR是機體重要的免疫系統(tǒng)識別受體，參與調控與維持免疫反應的平衡。適度活化的TLR可刺激免疫應答、清除病原體保護機體，但如持續(xù)活化，則會損傷機體[45]。TLR4通路與感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等的發(fā)生密切相關。Lv等[46]制備大腦中動脈缺血再灌注小鼠模型后，用HSYA處理發(fā)現(xiàn)TLR4的表達下降，凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，腦梗死和炎性神經(jīng)元損傷得到顯著緩解，提示HSYA可能是通過抑制TLR4通路介導的信號反應發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和抗炎功能。

2.7其他機制 盛雨辰等[47]的研究提示，HSYA對腦IRI的保護作用可能與抑制誘導型一氧化氮合酶過表達有關。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠大腦的IRI中苯丙氨酸顯著增加，而HSYA可抑制IRI后苯丙氨酸的合成，增強線粒體功能，起到神經(jīng)保護作用。Yu等[48]發(fā)現(xiàn)，HSYA具有保護腦IRI認知功能和突觸可塑性的作用，認為HSYA可能是腦缺血損傷后認知功能恢復的良好選擇。Xu等[39]的研究提示，缺氧誘導因子1信號通路是HSYA抗腦IRI的關鍵通路。

3 HSYA對其他器官IRI的保護機制

3.1HSYA對腎IRI的保護機制 核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是TLR4信號通路中的關鍵轉錄因子，活化的NF-κB可引起促炎性細胞因子釋放。Bai等[49]通過切除SD大鼠右腎，建立左腎IRI模型，以評價HSYA通過TLR4/NF-κB通路對缺血再灌注誘導的急性腎損傷在體內(nèi)外的保護作用。結果顯示：在體內(nèi)，HSYA治療可明顯降低血清肌酐和血尿素氮的水平，減少腎細胞凋亡，減輕腎組織形態(tài)學變化，減少IL-1β、腫瘤壞死因子-α、caspase-3釋放；在體外，HSYA能有效降低NF-κB/p65和炎癥細胞因子(如IL-1β、腫瘤壞死因子-α和IL-6)的水平。提示HSYA對腎IRI具有保護作用，可能與阻斷TLR4/NF-κB通路導致炎癥反應有關[50]。用腎小管上皮細胞(HK-2細胞)制備冷缺氧-復氧模型，冷缺氧前30 min用HSYA預處理，以觀察HSYA對HK-2細胞損傷是否有保護作用。結果顯示，25 μmol/L HSYA預處理可有效提高細胞存活率，其保護機制可能與調節(jié)細胞自噬和線粒體功能以及直接抗氧化有關[50-51]。

3.2HSYA對肝IRI的保護機制 沉默信息調節(jié)因子1(silence information regulator 1，SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的蛋白去乙?；?，其性質穩(wěn)定、保守。SIRT1在細胞凋亡、分化及代謝的調節(jié)中具有重要作用，但其生物學功能需要叉頭框蛋白O、c-myc癌基因、NF-κB、人胰島素樣生長因子結合蛋白1、p300、p53等蛋白的參與。SIRT1可以調控叉頭框蛋白O1蛋白去乙?；?，參與細胞的應激、凋亡、衰老和代謝等過程，從而減輕IRI[52]。朱仁英等[19]發(fā)現(xiàn)，HSYA預處理可以緩解肝臟IRI，減少中性粒細胞浸潤，且肝組織中SIRT1和乙?；骖^框蛋白O1/叉頭框蛋白O1蛋白水平升高；而加入SIRT1抑制劑后，肝細胞壞死及中性粒細胞浸潤均較之前增加，且SIRT1和乙?；骖^框蛋白O1/叉頭框蛋白O1蛋白水平降低，提示HSYA預處理可激活SIRT1/叉頭框蛋白O1通路，通過緩解氧化應激，實現(xiàn)對肝IRI的保護作用。

3.3HSYA對脊髓IRI的保護機制 Shan等[53]通過閉塞主動脈建立成年新西蘭公兔脊髓缺血再灌注模型，其中HSYA治療組在缺血前30 min經(jīng)左耳靜脈給予10 mg/kg HSYA。術后48 h進行神經(jīng)功能評估、組織病理學檢查、生化分析以及細胞凋亡檢測，結果顯示：與缺血再灌注組相比，HSYA治療組脊髓壞死有所減輕，神經(jīng)功能有所改善，氧化應激得到緩解，提示HSYA可能通過減輕氧化應激和減少神經(jīng)元凋亡保護脊髓免受IRI。

4 小 結

目前關于HSYA在心肌、腦、肝臟、脊髓等IRI中作用的研究，針對的是正常體溫下熱IRI的保護作用及相關機制，對HSYA在器官移植的冷IRI中的保護作用研究較少。器官移植時離體器官需低溫保存以提高離體器官對IRI的耐受能力[54]。如HSYA在器官移植的冷IRI中有保護作用，將大大增加器官移植的成功率。目前，冷熱IRI中的給藥劑量、給藥方式及給藥時間各有不同，需進一步研究。HSYA對IRI的保護作用與多種機制有關，如激活PI3K/Akt信號通路、抑制JAK2/STAT1信號通路、激活SIRT1/叉頭框蛋白O1通路、抑制炎癥介質釋放，降低自由基反應、抗氧化、減輕鈣超載、抑制mPTP的開放等，各機制之間是否存在關聯(lián)尚不十分清楚，且大多機制探討還處于推測階段，需進一步驗證。HSYA在體內(nèi)的代謝過程直接影響其藥效發(fā)揮，機體的健康狀態(tài)也影響藥物的代謝。深入研究HSYA對IRI的作用機制，可為臨床安全、合理使用藥物預防提供理論基礎。