革蘭陰性菌的耐藥特點(diǎn)及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

劉堅(jiān)齡（天津市津南區(qū)疾病預(yù)防控制中心,天津 300350）

目前，臨床上針對(duì)細(xì)菌的鑒別區(qū)分主要是通過(guò)革蘭氏染色實(shí)現(xiàn)，即對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，之后菌體呈紫色的即為“革蘭氏陽(yáng)性菌”，菌體呈伊紅色的即為“革蘭氏陰性菌”[1]。無(wú)論是哪類(lèi)細(xì)菌均有桿菌及球菌，其中葡萄球菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌屬于臨床最為常見(jiàn)的病原菌。其中革蘭陰性菌是臨床上分離率較高的一類(lèi)病原菌，其檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)革蘭陽(yáng)性菌，且隨著近年來(lái)抗生素以及免疫抑制劑等新治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在一定程度上促進(jìn)了革蘭陰性菌耐藥菌株的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的逐漸升高，最終促使細(xì)菌感染患者的臨床治療日益棘手[2]。相關(guān)研究報(bào)道顯示，隨著抗菌藥物的大量應(yīng)用，其所造成的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已成為當(dāng)下醫(yī)務(wù)人員所面臨的重大挑戰(zhàn)。隨著國(guó)內(nèi)外醫(yī)務(wù)人員的不懈努力，大量的細(xì)菌耐藥性相關(guān)研究層出不窮，為臨床研究提供了相對(duì)豐富的細(xì)菌耐藥性資料[3]。此外，有研究學(xué)者借助分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究，繼而促使多種新型耐藥基因被發(fā)現(xiàn)，有利于細(xì)菌耐藥研究資料的豐富，為細(xì)菌感染防治提供參考依據(jù)[4]。本文就革蘭陰性菌對(duì)臨床常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥研究進(jìn)展作一綜述，旨在為臨床治療提供數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)作以下報(bào)道。

1 革蘭陰性菌的耐藥特點(diǎn)

1.1 感染菌種分析 志賀氏菌以及沙門(mén)氏菌等致病性較強(qiáng)的菌種是既往導(dǎo)致感染發(fā)生的主要菌種，而當(dāng)下以腸桿菌科（如大腸埃希菌以及克雷伯菌屬等）以及非發(fā)酵菌群（如銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌等）為主，另有部分研究報(bào)道認(rèn)為嗜麥芽窄食單胞菌及洋蔥伯克霍爾德菌等細(xì)菌是主要的感染菌種。總而言之，耐藥革蘭陰性菌的檢出率正呈逐年攀升趨勢(shì)，尤其是多重耐藥菌株的檢出率與日俱增，泛耐藥菌株開(kāi)始在多個(gè)地區(qū)出現(xiàn)。一項(xiàng)關(guān)于針對(duì)2000-2004年某醫(yī)院住院及門(mén)診患者的研究表明[5]：主要致病菌按照占比從高到低的順序依次為大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、克雷伯菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌，其中約有70%的致病菌屬于革蘭陰性菌。另有耐藥相關(guān)的研究顯示，各類(lèi)革蘭陰性菌均對(duì)抗菌藥物存在一定的耐藥性，且耐藥率有逐年升高趨勢(shì)。如2000年的亞胺培南耐藥率為6.3%，時(shí)至2004年，其耐藥率高達(dá)24.4%。耐藥性最高當(dāng)屬氨芐西林，從2000年的85.1%升高至2004年的88.3%。第三代頭孢菌素中的頭孢他啶敏感性最高，從2000年的17.3%升高至2004年的32.4%，環(huán)丙沙星則由34.4%升高至48.0%，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉及拉西林他唑巴坦耐藥率分別從7.5%、18.5%升高至34.9%、30.1%。另有一項(xiàng)針對(duì)上海地區(qū)14所醫(yī)院的臨床分離株的耐藥情況分析研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌途虎鮑曼不動(dòng)桿菌等的泛耐藥株[6]?？偠灾?，革蘭陰性菌的耐藥問(wèn)題不容樂(lè)觀。

1.2 醫(yī)院感染的背景 醫(yī)院感染屬于當(dāng)下臨床醫(yī)學(xué)工作過(guò)程中亟待解決的重點(diǎn)以及難點(diǎn)，對(duì)患者的醫(yī)療質(zhì)量產(chǎn)生極大程度的影響。盡管通過(guò)數(shù)十年的努力獲得了一定的醫(yī)院感染控制成果，但形勢(shì)仍較為嚴(yán)峻。2001年、2003年及2005年的全國(guó)醫(yī)院感染橫斷面調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院感染現(xiàn)患率分別為5.22%、4.81%、4.77%[7]。以泌尿系、胃腸道、呼吸道以及皮膚軟組織等部位感染較為常見(jiàn)。醫(yī)院感染的發(fā)生不僅會(huì)在極大程度上加重醫(yī)務(wù)工作者的工作量，同時(shí)還會(huì)增加患者的治療難度，增加患者及其家屬的精神、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1.3 致病菌的耐藥情況 眾所周知，不同的國(guó)家和地區(qū)、不同的醫(yī)療機(jī)構(gòu)、同一醫(yī)院的各個(gè)科室，不同菌種的耐藥性均有所差異，且自同一患者相同標(biāo)本中獲取的同種菌株于干預(yù)前后耐藥性亦會(huì)出現(xiàn)改變[8]。這充分說(shuō)明了菌株來(lái)源和其耐藥性存在密切關(guān)系。一項(xiàng)關(guān)于香港及北京兩地不同醫(yī)院的血液標(biāo)本中的革蘭陰性菌耐藥性對(duì)比發(fā)現(xiàn)[9]，北京協(xié)和醫(yī)院相關(guān)血液標(biāo)本所有菌株對(duì)氨基糖甙類(lèi)、β內(nèi)酰胺類(lèi)以及氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥性高出香港相同菌株的1倍；且北京相關(guān)醫(yī)院的大腸埃希菌及克雷伯菌屬的超廣譜β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性率超過(guò)香港地區(qū)的2倍。另有關(guān)于縣級(jí)醫(yī)院和三級(jí)醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MRSA、產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌及產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌陽(yáng)性率在縣級(jí)醫(yī)院中為5%、12%、15.18%，而在三級(jí)綜合醫(yī)院中為40.13%、20.1%、32.13%。另有一項(xiàng)關(guān)于中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥研究表明：8所綜合醫(yī)院的22774株分離病原菌中革蘭陰性菌占比66.9%，且ESBLs大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌檢出率分別為20%-57%、13%-70%。

1.4 多重耐藥或（和）泛耐藥菌 此類(lèi)菌種在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)均存在多克隆散在或單克隆暴發(fā)流行。國(guó)內(nèi)分子流行病學(xué)技術(shù)相關(guān)研究顯示，醫(yī)院存在不同程度的多重耐藥菌株散發(fā)以及暴發(fā)流行的情況。尤其是于ICU、燒傷科以及呼吸科等科室接受診治的老年患者存在較為嚴(yán)重的多重耐藥菌株流行情況。

2 革蘭陰性菌的耐藥機(jī)制

固有/獲得性耐藥屬于細(xì)菌耐藥的兩種類(lèi)型，前者和細(xì)菌細(xì)胞壁成分以及藥物作用機(jī)制有關(guān)。而后者的機(jī)制可能和下述幾個(gè)方面有關(guān)[10]：①藥物作用部位改變；②滅活酶產(chǎn)生；③主動(dòng)外排機(jī)制；④細(xì)胞膜通道蛋白異常改變；⑤生物膜形成。

2.1 β內(nèi)酰胺酶與革蘭陰性菌耐藥的關(guān)系 β內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是導(dǎo)致革蘭陰性菌對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥的主要原因，其中不同地區(qū)、醫(yī)院及科室的β內(nèi)酰胺酶類(lèi)型及其亞型分布不同。該菌種所產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶類(lèi)型以涵蓋廣譜酶、超廣譜酶、AmpC酶以及碳青霉烯酶為主。廣譜酶主要亞型由TEM-1、TEM-22、SHV-1以及苯唑西林酶家族。該類(lèi)酶可被或不被克拉維酸抑制[11]。超廣譜酶主要涵蓋TEM家族、SHV家族、PER家族、VEB家族、GES/IBC家族、CTX-M家族、OXA家族。該類(lèi)酶底物是廣譜酶底物、氧亞氨基頭孢菌素、單酰胺類(lèi)等。該類(lèi)酶僅OXA家族亞型不被克拉維酸抑制。AmpC酶包括染色體/質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，前者主要存在于腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌以及枸櫞酸桿菌等；后者按照來(lái)源可分作源自哈夫尼亞菌、摩根氏菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、齦溝腸桿菌以及未知來(lái)源的FOX、MOX共6個(gè)不同群[12-13]。該類(lèi)酶底物是超廣譜酶底物以及頭霉素，不被克拉維酸抑制。碳青霉烯酶涵蓋IMP家族、VIM家族、OXA型碳青霉烯酶等，其底物為超廣譜酶底物、頭霉素、碳青霉烯類(lèi)。

2.2 氨基糖甙類(lèi)修飾酶（AMEs）與革蘭陰性菌的關(guān)系 AMEs產(chǎn)生是導(dǎo)致革蘭陰性菌對(duì)氨基糖甙類(lèi)藥物敏感性較低的主要原因，同一修飾酶可對(duì)差異性底物發(fā)揮作用，且同一菌株可能攜帶多種修飾酶。臨床上將AMEs按照酶功能的差異分作乙酰轉(zhuǎn)移酶、肝轉(zhuǎn)移酶以及磷酸轉(zhuǎn)移酶3種。相關(guān)研究表明，革蘭陰性菌的AMEs攜帶率為30%-95%，且有多種基因型，其中約有40%的耐藥菌種攜帶≥2種AMEs基因[14]。

2.3 其他因素 革蘭陰性菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制涵蓋下述幾點(diǎn)：①氟喹諾酮類(lèi)藥物染色體靶酶基因的改變；②質(zhì)粒參與的qnr基因出現(xiàn)；③主動(dòng)外排機(jī)制；④DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA基因突變以及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ parC基因突變。相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[15]，質(zhì)粒參與的qnr基因總發(fā)生率為1.9%，包括肺炎克雷伯菌屬、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、枸櫞酸桿菌屬以及沙門(mén)菌屬。另有相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，質(zhì)粒參與的qnrA、qnrB、qnrS總發(fā)生率分別為3.88%、6.20%、2.33%[16]。細(xì)菌攜帶差異性耐藥基因會(huì)導(dǎo)致其對(duì)氟喹諾酮耐藥水平不同。

2.4 多重耐藥和細(xì)菌多種耐藥機(jī)制的關(guān)系 多重耐藥的革蘭陰性菌可同時(shí)攜帶數(shù)種β內(nèi)酰胺酶、氨基糖甙類(lèi)修飾酶以及qnr基因，提示了該菌種的多重耐藥可能是多因素共同作用的結(jié)果[17]。亦可將其看作細(xì)菌在抗生素影響下的“優(yōu)勝劣汰，適者生存”結(jié)果。其中整合子更是在細(xì)菌獲得多種耐藥基因過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，多重耐藥菌株的整合酶檢出率超過(guò)97%。同類(lèi)整合子往往攜帶多種耐藥基因盒，而一種耐藥基因又可出現(xiàn)多種整合子。由此推測(cè)，整合子可能參與了耐藥基因于差異性菌株和菌群中的移動(dòng)，在細(xì)菌多重耐藥中起著極其重要的作用[18-19]。

2.5 粘菌素異質(zhì)性耐藥與革蘭陰性菌的關(guān)系 截止到目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的粘菌素異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象屬于腸桿菌科細(xì)菌，尤其是以肺炎克雷伯菌以及陰溝腸桿菌為主。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)大量的文獻(xiàn)也可以知道，在傷寒沙門(mén)菌以及大腸桿菌中，也存在一定程度的粘菌素異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象?？茖W(xué)人員通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明，在肺炎克雷伯菌的粘菌素異質(zhì)性耐藥的情況中，異質(zhì)性耐藥機(jī)制主要有兩個(gè)方面，第一個(gè)是粘菌素耐藥亞群中，有小菌落發(fā)生變異，導(dǎo)致其生物膜在形成的時(shí)候能力變強(qiáng)；第二個(gè)則是在粘菌素耐藥亞群中，發(fā)現(xiàn)了粘菌素耐藥相關(guān)的一些基因，正是因?yàn)檫@些突變基因的出現(xiàn)，導(dǎo)致其發(fā)生了變化。除此之外，科學(xué)人員通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)以及研究，還在陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了同樣的變化。陰溝腸桿菌的粘菌素異質(zhì)性耐藥機(jī)制與細(xì)菌和宿主中溶菌酶發(fā)生了耐藥性?？茖W(xué)研究人員利用實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，陰溝腸桿菌中可以通過(guò)突變的基因進(jìn)入到其脂質(zhì)中，通過(guò)這樣的方式對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行重新的修飾，這就是粘菌素異質(zhì)性耐藥出現(xiàn)的原因。在陰溝腸桿菌中也有一個(gè)突變的基因，通過(guò)編碼蛋白質(zhì)導(dǎo)致出現(xiàn)粘菌素異質(zhì)性耐藥。粘菌素異質(zhì)性耐藥在臨床上的研究還不是特別的完善，還是需要在大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行反復(fù)探究。

2.6 碳青霉烯異質(zhì)性耐藥與革蘭陰性菌的關(guān)系 在腸桿菌科細(xì)菌中，碳青霉烯異質(zhì)性耐藥主要出現(xiàn)在肺炎克雷伯菌和大腸桿菌中，其中有些文獻(xiàn)也通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在陰溝腸桿菌以及產(chǎn)氣腸桿菌中也出現(xiàn)了碳青霉烯異質(zhì)性耐藥情況?？茖W(xué)研究人員通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的研究和分析，在肺炎克雷伯菌的碳青霉烯異質(zhì)性耐藥中發(fā)現(xiàn)了一些酶。與此同時(shí)，科學(xué)研究人員通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明，正是由于一些基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致其基因表達(dá)過(guò)量，使得其編碼合成的蛋白質(zhì)發(fā)生異常，進(jìn)而在肺炎克雷伯菌中出現(xiàn)了碳青霉烯異質(zhì)性耐藥。但是大腸桿菌與肺炎克雷伯菌是存在一定差異的，其碳青霉烯異質(zhì)性耐藥是存在一定局限的，主要包括了流行性等方面和角度，這也給研究提供了另外一個(gè)角度。

3 結(jié)論

革蘭陰性菌耐藥性形勢(shì)不容樂(lè)觀，且耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，尤其是多重耐藥菌株增加了抗菌藥物治療失敗的幾率，甚至?xí)?dǎo)致二重感染及死亡的風(fēng)險(xiǎn)有所升高。故此，如何有效降低革蘭陰性菌耐藥是廣大醫(yī)務(wù)人員亟待解決的難點(diǎn)、重點(diǎn)問(wèn)題，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。