單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的應(yīng)用進展

沈品，謝芹，楊恩澤，程祥，孫毅

1 無錫市第二人民醫(yī)院急診科，江蘇 無錫 214000；2 昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究院；3 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院/云南省阜外心血管病醫(yī)院心外科

單個細胞是最小的功能性生物單位。在細胞動力學(xué)和獨特的細胞微環(huán)境共同作用下，即使相同基因型的細胞也可表現(xiàn)出不同的化學(xué)表型。異質(zhì)性是單個細胞的固有特征，普遍存在于細胞系統(tǒng)中，可在生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［1］。單細胞基因測序技術(shù)能直觀反映細胞基因間的差異性，但其仍無法具體闡述細胞在生物體復(fù)雜環(huán)境中的表型和功能。蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)所有功能的直接執(zhí)行者，可提供結(jié)構(gòu)支持、復(fù)制基因組信息、調(diào)節(jié)基因表達、控制信號傳導(dǎo)、催化代謝反應(yīng)并在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運分子等［2］。因此，對單細胞蛋白質(zhì)組的定性和定量分析，是揭示細胞類型及其狀態(tài)的重要工具，在腫瘤異質(zhì)性、干細胞分化、生殖細胞發(fā)育、循環(huán)腫瘤細胞等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)可通過研究單個細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能信息，揭示正常和受損發(fā)育中的細胞異質(zhì)性［3］。質(zhì)譜技術(shù)［4-6］是目前研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一種常規(guī)方法，其檢測蛋白質(zhì)的靈敏度較高［7-9］?；谫|(zhì)譜數(shù)據(jù)的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法能以無偏倚的方式量化單細胞蛋白質(zhì)并對其進行定性分析，其分析流程包括肽段識別和蛋白質(zhì)推斷、蛋白質(zhì)豐度定量、蛋白質(zhì)生物功能分析等。現(xiàn)將基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的應(yīng)用研究進展綜述如下。

1 肽段識別技術(shù)和單細胞蛋白質(zhì)推斷技術(shù)的應(yīng)用情況

肽段識別和蛋白質(zhì)鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)測序的基礎(chǔ)。從單細胞質(zhì)譜儀中獲取單細胞蛋白質(zhì)碎片譜數(shù)據(jù)后，第一個步驟是從單細胞蛋白質(zhì)裂解質(zhì)譜數(shù)據(jù)中確定肽段的序列［10］。肽段分析方法通過計算機檢索蛋白質(zhì)序列來建立單細胞蛋白質(zhì)的目標數(shù)據(jù)庫，從單細胞蛋白質(zhì)目標數(shù)據(jù)庫中為檢測得到的單細胞蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜圖和理論單細胞蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜圖信息計算一個肽譜匹配分數(shù)，最終識別出具有最高匹配分數(shù)的單細胞蛋白質(zhì)的肽段。

目前臨床常見的可用于肽段識別和蛋白質(zhì)推斷的單細胞質(zhì)譜分析工具主要有MASCOT 和Andromeda。MASCOT 軟件可將質(zhì)量測量與蛋白質(zhì)序列信息、來自蛋白質(zhì)消化的肽分子量以及串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，生成基于概率的蛋白質(zhì)鑒定評分，進行蛋白質(zhì)推斷［11］。SLAVOV 等［12］開發(fā)的基于質(zhì)譜的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析法中，他們在蛋白質(zhì)搜索鑒定流程中使用MASCOT 軟件來鑒定單個細胞中的數(shù)千種蛋白質(zhì)，并識別不同種類型的癌細胞，與常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法比較，在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用MASCOT鑒定蛋白質(zhì)的精度高。

Andromeda 是一種使用概率評分模型的新型肽搜索引擎，已廣泛應(yīng)用于單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中［13］。Andromeda 軟件根據(jù)可根據(jù)肽段的敏感度和特異度，判斷目標肽段與蛋白質(zhì)。同時，Andromeda的數(shù)據(jù)庫非常大，能以任意高的片段質(zhì)量精度，處理復(fù)雜的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，識別翻譯后修飾的復(fù)雜模式肽段，如高度磷酸化的肽段［14］。

單細胞質(zhì)譜分析方法有三類，分別是基于毛細管電泳—質(zhì)譜方法、基于液相色譜—質(zhì)譜方法和無分離手段直接檢測方法。KELLY 等［15］采用液相色譜法來研究單細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)信息，采用Andromeda 引擎在UniProtKB 數(shù)據(jù)庫中搜索譜圖并選擇N 末端蛋白乙?；图琢虬彼嵫趸鳛榭勺冃揎?，肽和蛋白質(zhì)均以0.01 的最大錯誤發(fā)現(xiàn)率進行過濾，說明Andromeda 軟件在檢索高度磷酸化的肽段中準確度更高。ZHU 等［16］在采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)時實用Andromeda 用于數(shù)據(jù)庫搜索和無標記蛋白質(zhì)定量，最終運用單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示了毛細胞發(fā)育過程中表達的變化。肽段識別完成后將肽段序列構(gòu)建為原始蛋白質(zhì)，這個過程稱為蛋白質(zhì)推斷。肽段較短時構(gòu)建可靠蛋白質(zhì)具有一定難度，因為一些肽段可能由兩個或多個蛋白質(zhì)共享，因此蛋白質(zhì)推斷過程中常采用概率模型［17］。SCoPE-MS［12］是一種蛋白質(zhì)統(tǒng)計建?？蚣?，可通過定量單個細胞中的肽段來推斷蛋白質(zhì)，且肽段在單細胞通道中的檢測強度不受到其在載體細胞中的豐度影響。

2 單細胞蛋白質(zhì)豐度定量技術(shù)的應(yīng)用情況

測定單細胞蛋白質(zhì)豐度有助于后續(xù)研究蛋白質(zhì)功能及單個細胞動態(tài)變化的生長軌跡，探索疾病的發(fā)病機制。單細胞蛋白質(zhì)豐度定量可用于計算單細胞肽段及蛋白具體含量。目前多數(shù)單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究均使用有標定量法進行蛋白質(zhì)豐度定量。有標定量法是一種在樣本里混入同位素標記物，利用同位素標記物來定量單細胞蛋白質(zhì)組的方法。有標定量法的應(yīng)用成本較高，但其對低豐度蛋白質(zhì)的檢測效率和單細胞蛋白質(zhì)定量的準確性均較高。同時，有標定量法可以量化每個細胞中每個標簽標記肽段水平，同時從所有細胞中匯集的總肽量識別其序列。

基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定量蛋白質(zhì)分析軟件主要是MaxQuant。MaxQuant 采用MASCOT 作為搜索引擎，與主流的質(zhì)譜平臺結(jié)合使用［18］。MaxQuant 在Max-LFQ模式下的定量完整蛋白質(zhì)組和低豐度蛋白質(zhì)組的準確性和精密度均優(yōu)于其他方法［19］。BANEK等［20］在對卵裂期青蛙胚胎的各個胚胎細胞中的蛋白質(zhì)進行定量時，使用毛細管電泳電噴霧電離高分辨率質(zhì)譜技術(shù)后，使用MaxQuant來處理原始數(shù)據(jù)。

3 單細胞蛋白質(zhì)生物學(xué)功能分析技術(shù)的應(yīng)用情況

單細胞蛋白質(zhì)功能分析，需要首先進行蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，后進行蛋白質(zhì)功能富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)。

3.1 單細胞蛋白質(zhì)的定量 蛋白質(zhì)豐度數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)清理、過濾和標準化過程，就可以進行后續(xù)差異表達蛋白的統(tǒng)計分析。比較分析不同狀態(tài)下單細胞蛋白質(zhì)的差異性是單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵步驟，可運用不同的方法［21-24］尋找差異蛋白。Slavov 團隊開發(fā)了一個原則性的貝葉斯框架［21］，在確定肽序列時納入肽的保留時間信息，對數(shù)據(jù)驅(qū)動的保留時間比對以進行識別。數(shù)據(jù)驅(qū)動的識別保留時間比對可以用于多數(shù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，并且這個框架應(yīng)用于單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)時非常有效，它可以在錯誤發(fā)現(xiàn)率為1%的情況下將確信識別的多肽數(shù)量增加50%［22］。

為優(yōu)化單細胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)，HUFFMAN 等［25］基于質(zhì)譜交互式可視化和分析開發(fā)得到數(shù)據(jù)驅(qū)動質(zhì)譜優(yōu)化平臺（DO-MS），可用于單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的檢索和分析，后續(xù)還將進一步分析并量化哺乳動物中的單細胞蛋白質(zhì)及其所有修飾［26］。

3.2 單細胞蛋白質(zhì)的功能富集分析 基因本體論（Gene Ontology，GO）富集是富集分析中使用最廣泛的一個技術(shù)［27］。GO有三個主要類別，即：生物過程、分子功能、細胞成分。GO富集分析的常用數(shù)據(jù)庫有Amigo 、DAVID［28］、STRING［29］。LI 等［30］新開發(fā)了一個基于質(zhì)譜的單細胞蛋白分析軟件，可用于分析單細胞生物的各種細胞，監(jiān)測響應(yīng)受擾動的細胞培養(yǎng)條件的代謝變化，利用萊茵衣藻來研究植物特異性生物過程，如植物光合作用及在極端條件下生物的生長過程。

京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析方法可用于分析各種生物通路［31］。生物通路用來描述生物過程中的細胞內(nèi)分子之間的生物作用和化學(xué)反應(yīng)。蛋白質(zhì)集富集分析（Protein Set Enrichment Analysis，PSEA）源自基因集富集分析（Gene Set Enrichment，GSEA）。在PSEA 中，富集分數(shù)是根據(jù)加權(quán)運行總和統(tǒng)計計算的，而豐度沒有顯著變化的蛋白質(zhì)可能會對富集分數(shù)產(chǎn)生負面影響。PSEA-Quant 是專門為蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)開發(fā)的，可以為單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)提供更方便和更可靠的分析流程。Slavov［12］課題組為比較單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法與單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法在不同功能的基因之間的一致性，對找出的單細胞蛋白進行KEGG 富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋白水解和發(fā)育中起作用的基因在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的一致性顯著低于所有基因，這種差異可能反映了不同基因組的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或測量噪點的差異。才能提高功能富集分析的準確性。

3.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 當前，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)主要有兩個類別：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)和信號網(wǎng)絡(luò)。PPI 網(wǎng)絡(luò)描述了兩種蛋白質(zhì)之間的直接相互作用。 許多生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫如STRING、HPRD［32］、MINT［33］，BioGRID［34］和PIPs 等為PPI 數(shù)據(jù)庫，信號通路數(shù)據(jù)庫有KEGG、Reactome［35］、Pathway Commons［36］。Perseus 用于分析和可視化基于質(zhì)譜定量的MaxQuant 數(shù)據(jù)［24］，可進行蛋白質(zhì)差異表達矩陣、結(jié)果圖、各種質(zhì)量控制圖以及通路-基因本體富集分析。

綜上所述，基于質(zhì)譜的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法主要有肽段識別和蛋白質(zhì)推斷、單細胞蛋白質(zhì)豐度定量、單細胞蛋白質(zhì)生物功能分析等。肽段與蛋白質(zhì)識別主要采用MASCOT 和Andromeda 等軟件，可從質(zhì)譜儀獲取的單細胞蛋白裂解質(zhì)譜數(shù)據(jù)中鑒定肽段序列。MaxQuant 等蛋白質(zhì)豐度定量軟件可計算出細胞中的肽段及蛋白的具體含量；生物信息學(xué)分析中主要應(yīng)用Perseus 等軟件進行蛋白質(zhì)功能富集分析及蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。目前單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的研究正處于新興階段，更多研究方法正在深入開發(fā)。