聚合酶Ⅰ和轉(zhuǎn)錄本釋放因子：一個具有脂質(zhì)代謝和免疫微環(huán)境重構(gòu)功能的全新膠質(zhì)瘤標(biāo)記物*

崔曉騰 康春生

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）為世界衛(wèi)生組織（WHO）4 級膠質(zhì)瘤，是發(fā)病率和死亡率最高的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，以腫瘤異質(zhì)性高、惡性進(jìn)展迅速、放化療不敏感為突出特點。外科手術(shù)切除輔以放化療是目前主要的治療手段，但患者預(yù)后仍不理想，中位生存期一般不超過1.5 年[1]。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和多種分子生物學(xué)研究手段的應(yīng)用，許多腫瘤標(biāo)志物相繼被鑒定出來，不僅可以作為膠質(zhì)瘤分子病理分級的關(guān)鍵指標(biāo)，還可在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展、放化療抵抗等多種腫瘤生物學(xué)行為中起到核心調(diào)節(jié)作用。如異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）蛋白，其R132H 是膠質(zhì)瘤最常見的原癌突變，但由于引起三羧酸循環(huán)受阻，能量生成不足，因此該陽性突變的原發(fā)膠質(zhì)瘤符合低級別膠質(zhì)瘤的特征[2]；又如O6甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因的啟動子甲基化狀態(tài)，可提示膠質(zhì)瘤患者對目前一線孤兒化療藥物替莫唑胺的敏感性[3]。

本文所探討的聚合酶Ⅰ和轉(zhuǎn)錄本釋放因子（polymerase-1 and transcript release factor，PTRF/Cavin-1）是Cavin 蛋白家族的成員之一，廣泛表達(dá)于各個組織細(xì)胞，在不同的物種中具有高度保守性。PTRF/Cavin-1 最初作為RNA 聚合酶Ⅰ的調(diào)節(jié)子被鑒定，可通過影響轉(zhuǎn)錄終止作用促進(jìn)rRNA 的生物合成[4]，后發(fā)現(xiàn)其可與細(xì)胞膜內(nèi)表面定位的小凹蛋白家族（caveolin，CAV）結(jié)合[5]，在細(xì)胞內(nèi)吞和外分泌、細(xì)胞增殖代謝等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。本文從結(jié)構(gòu)特征和分子互作的角度，系統(tǒng)梳理PTRF/Cavin-1 在膠質(zhì)瘤研究中的一系列研究成果，明確其在GBM 發(fā)生發(fā)展中的多面作用，有助于探索針對PTRF/Cavin-1 的膠質(zhì)瘤靶向干預(yù)策略。

1 PTRF/Cavin-1 的結(jié)構(gòu)和功能

蛋白質(zhì)構(gòu)象是其發(fā)揮生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。人類PTRF/Cavin-1 基因位于17 號染色體q21.2，編碼含有310 個氨基酸的蛋白質(zhì)。隨著蛋白三維構(gòu)象分析手段的進(jìn)步，PTRF/Cavin-1 蛋白結(jié)構(gòu)逐漸清晰。目前研究表明，PTRF/Cavin-1 含有3 個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、2 個核定位信號和1 個出核信號，為PTRF/Cavin-1與其他蛋白相互作用以及全細(xì)胞的分布特征奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本課題組[6]通過計算機(jī)同源建模獲得PTRF/Cavin-1 蛋白的高級結(jié)構(gòu)模型，二級結(jié)構(gòu)多為α 螺旋和環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且包含長鏈螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可促使PTRF/Cavin-1 形成三聚體，以及促進(jìn)其與Cavin 蛋白家族其他成員（Cavin-2 和Cavin-3 蛋白）的相互作用；殘基分析發(fā)現(xiàn)PTRF/Cavin-1 中含有大量親水性殘基，顯示出高親水性；對PTRF/Cavin-1 三聚體蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，3 個單體之間相互纏繞呈“擰麻花狀”，其N 端互作區(qū)域可形成一個帶負(fù)電的遠(yuǎn)螯腔，深度為25.5 ?，3 個爪顎之間的間隙寬度分別為60.0 ?、52.1 ?和35.0 ?。這種結(jié)構(gòu)使得小凹蛋白CAV1 蛋白帶正電的N 端可以完全嵌入PTRF/Cavin-1 三聚體遠(yuǎn)螯腔中，殘基相互形成強大氫鍵（長度為1.7～2.7 ?，鍵角范圍為96.4°～159.0°），靜電表面的完美匹配也穩(wěn)定了結(jié)合構(gòu)象；在PTRF/Cavin-1 蛋白N 端人為融合1 個TAT 短肽，即可改變其N 端構(gòu)象和帶電性，同樣影響三聚體N 端遠(yuǎn)螯腔的形成和深度，阻礙其與CAV1 蛋白的結(jié)合。綜上所述，正確折疊的PTRF/Cavin-1 蛋白對形成三聚體發(fā)揮正常蛋白功能十分關(guān)鍵。

1998 年Jansa 等[4]首次克隆出PTRF/Cavin-1 蛋白，并證實其參與rRNA 的轉(zhuǎn)錄終止過程。RNA 聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄終止需要兩步，首先是轉(zhuǎn)錄復(fù)合物停止延伸，然后是rRNA 前體從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離釋放。PTRF/Cavin-1 可與RNA 聚合酶Ⅰ和轉(zhuǎn)錄終止因子TTF-1 結(jié)合，促進(jìn)停止延伸的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物發(fā)生解離。有報道提示，PTRF/Cavin-1 還與基因轉(zhuǎn)錄中RNA 聚合酶Ⅰ的再起始有關(guān)，調(diào)節(jié)rRNA 合成效率，且該過程中PTRF/Cavin-1 可能存在多個位點的磷酸化修飾[7]。

細(xì)胞小凹是細(xì)胞膜上內(nèi)陷的直徑為60～80 nm的凹點，與細(xì)胞內(nèi)吞、脂質(zhì)調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。小凹形成所需的核心組分包括小凹蛋白家族（主要是CAV1）和Cavin 蛋白家族（PTRF/Cavin-1 為必需組分）[8]。CAV1 蛋白經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成-高爾基體加工后定位在細(xì)胞膜內(nèi)表面，細(xì)胞質(zhì)中的PTRF/Cavin-1 蛋白形成三聚體與之結(jié)合并定位于細(xì)胞膜上，從而形成細(xì)胞小凹。Hill 等[5]通過蛋白質(zhì)組學(xué)手段探明PTRF/Cavin-1 僅可結(jié)合細(xì)胞膜上成熟的CAV1 蛋白。PTRF/Cavin-1 缺失可導(dǎo)致細(xì)胞小凹數(shù)量顯著減少，且膜上CAV1 呈現(xiàn)邊緣移動并加速溶酶體降解[9]。同年類似研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PTRF/Cavin-1 蛋白可引起細(xì)胞小凹增多[10]。

PTRF/Cavin-1 突變/缺失可引起一系列病理性改變，導(dǎo)致疾病發(fā)生。2009 年Hayashi 等[11]報道PTRF/Cavin-1 與先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良的關(guān)系。其發(fā)現(xiàn)5 例患者均具有PTRF/Cavin-1 基因突變[c.696_697 insC（p.K233fs），c.525delG（p.E176fs）]，臨床表現(xiàn)為肌肉過度增生、肌肉隆起、輕度代謝并發(fā)癥和血清肌酸激酶水平升高，骨骼肌活檢提示慢性營養(yǎng)不良。Rajab 等[12]對8 例患有先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PTRF/Cavin-1 存在純合突變（c.160delG，c.362dupT），臨床表現(xiàn)為長QT 綜合征、心動過緩、室上性心動過速和室性心動過速等病理特征，以及骨形成受損和骨質(zhì)疏松。建立基因敲除小鼠便于深入探究該蛋白的多種潛在功能。有研究對PTRF/Cavin-1 敲除鼠進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其展現(xiàn)出許多病理生理學(xué)變化和表現(xiàn)，包括骨骼肌等的細(xì)胞小凹水平顯著下降，游離脂肪酸、血清甘油三酯和胰島素水平升高，葡萄糖耐受不良，肺臟炎癥細(xì)胞浸潤增加等[13]。

綜上所述，PTRF/Cavin-1 表達(dá)與CAV1 在細(xì)胞膜上的正確定位對于細(xì)胞小凹的形成至關(guān)重要，提示PTRF/Cavin-1 與全身脂質(zhì)代謝有顯著關(guān)系。

2 PTRF/Cavin-1 在膠質(zhì)瘤預(yù)后評判中的作用

根據(jù)2021 年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，低級別膠質(zhì)瘤主要包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤等，伴有IDH 突變、1p19q 聯(lián)合缺失等基因組特征；高級別膠質(zhì)瘤即GBM，其IDH 為野生型，多伴有TERT啟動子突變、7 號染色體擴(kuò)增聯(lián)合10 號染色體缺失等[14]。基于染色體和基因表達(dá)差異，GBM 可分為經(jīng)典型、間質(zhì)細(xì)胞型、前神經(jīng)元型等不同亞型，其中以間質(zhì)細(xì)胞型的惡性程度最高，患者預(yù)后最差。

多項研究表明，PTRF/Cavin-1 的表達(dá)水平可提示患者膠質(zhì)瘤級別。Huang 等[15]通過比較CGGA、TCGA數(shù)據(jù)庫中收錄的膠質(zhì)瘤患者測序數(shù)據(jù)和膠質(zhì)瘤組織芯片染色，發(fā)現(xiàn)PTRF/Cavin-1 的mRNA 和蛋白水平隨著膠質(zhì)瘤WHO 級別上升而升高，在GBM 間質(zhì)細(xì)胞型中表達(dá)最高，高表達(dá)PTRF/Cavin-1 提示膠質(zhì)瘤患者生存期顯著縮短；又通過實驗證實PTRF/Cavin-1受EGFRvⅢ-PI3K-AKT 通路調(diào)控，其表達(dá)水平與外泌體標(biāo)志基因CD63 的表達(dá)呈顯著相關(guān)，腫瘤樣本和血清外泌體中的二者比值可作為膠質(zhì)瘤患者診斷和評判預(yù)后的生物標(biāo)記物，高級別膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織和血清中的比值均顯著高于低級別膠質(zhì)瘤。隨后，有研究支持并補充上述結(jié)論，不僅確定了PTRF/Cavin-1在預(yù)測GBM 患者預(yù)后的臨床價值，還發(fā)現(xiàn)接受放療的患者中PTRF/Cavin-1 低表達(dá)與生存期延長有關(guān)，并確定了PTRF/Cavin-1 可促進(jìn)GBM 血管生成和腫瘤免疫紊亂[16]。

3 PTRF/Cavin-1 促進(jìn)GBM 增殖和免疫微環(huán)境重塑的分子機(jī)制

腫瘤生長在一個復(fù)雜的環(huán)境中，包括原發(fā)組織的細(xì)胞、代謝、免疫等均與腫瘤發(fā)生相互影響。膠質(zhì)瘤處于人體為數(shù)不多的免疫豁免器官，其微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞與顱內(nèi)固有免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞、浸潤的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞組分和細(xì)胞外基質(zhì)、趨化因子等物質(zhì)交互調(diào)控形成的高度免疫抑制的環(huán)境[17]。腫瘤細(xì)胞會“教育”周圍其他細(xì)胞，使之形成更加利于生長和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。Wang 等[6]發(fā)現(xiàn)GBM 中PTRF/Cavin-1 與CAV1結(jié)合，增強GBM 細(xì)胞外囊泡的合成分泌和攝取，促進(jìn)GBM 增殖；同時發(fā)現(xiàn)PTRF/Cavin-1 驅(qū)使的旺盛外分泌可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化和募集。GBM 的高侵襲性是其預(yù)后不良的一個關(guān)鍵因素，有研究報道GBM中PTRF/Cavin-1 和CAV1 的表達(dá)水平均較正常組織顯著升高，且與尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinasetype plasminogen activator，uPA）和明膠酶的表達(dá)呈正相關(guān)；并發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PTRF/Cavin-1 和CAV1 的GBM細(xì)胞（即細(xì)胞小凹形成旺盛的腫瘤細(xì)胞）可表達(dá)更多uPA、基質(zhì)金屬蛋白酶2 和基質(zhì)金屬蛋白酶9，且較PTRF/Cavin-1 和CAV1 相對低表達(dá)的GBM 細(xì)胞（即細(xì)胞小凹形成缺陷的腫瘤細(xì)胞）更具侵襲性[18]。隨后深入研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PTRF/Cavin-1 的GBM 細(xì)胞在滲透壓作用下可增強基質(zhì)蛋白酶等的表達(dá)分泌，增加GBM 侵襲能力以對抗?jié)B透壓力[19]。上述結(jié)果表明，PTRF/Cavin-1 可通過細(xì)胞小凹促進(jìn)GBM 惡性行為，重塑GBM 微環(huán)境。

代謝重編程為腫瘤提供了充足的能量，以支持其惡性生長以及重塑免疫微環(huán)境。作為細(xì)胞磷脂代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，PTRF/Cavin-1 在GBM 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[20]。機(jī)制方面，PTRF/Cavin-1 可通過降低胞質(zhì)磷脂酶A2（cytoplasmic phospholipase A2，cPLA2）泛素化進(jìn)而穩(wěn)定其蛋白水平和酶活性，促進(jìn)磷脂酰膽堿水解為溶血磷脂酰膽堿以增加胞內(nèi)游離脂肪酸水平，促進(jìn)線粒體β 氧化和ATP 生成；同時PTRF/Cavin-1-cPLA2 導(dǎo)致的細(xì)胞脂質(zhì)重塑可增加細(xì)胞膜流動性，提高GBM 細(xì)胞內(nèi)吞能力；ATP 不僅可以為GBM 增殖提供能量，還可釋放到腫瘤間隙，通過CD73 和CD39 水解為腺苷以抑制CD8+T 細(xì)胞的腫瘤殺傷能力，促進(jìn)GBM 生長和免疫逃逸[20]。

RNA 結(jié)合蛋白通過與靶RNA 相互作用在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Wang 等[21]分析TCGA、CGGA等數(shù)據(jù)庫中GBM 樣本的RNA 測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，鑒定出8 個與GBM 患者預(yù)后相關(guān)的RNA 結(jié)合蛋白，并進(jìn)一步實驗證實2 個蛋白可作為GBM 預(yù)后標(biāo)志物，其中就包括PTRF/Cavin-1。隨后，本課題組研究證實PTRF/Cavin-1 的RNA 結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)其可結(jié)合并穩(wěn)定LncRNA NEAT1，通過激活NF-κB 信號通路來促進(jìn)GBM 細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)和蛋白膜定位，引起GBM 免疫逃逸[22]。

膠質(zhì)瘤處于顱內(nèi)，一般藥物難以透過血腦屏障到達(dá)瘤內(nèi)，目前臨床一線化療藥物僅有替莫唑胺[23]。有研究通過對比GBM 耐藥細(xì)胞株和敏感株的蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)PTRF/Cavin-1 在耐藥株中顯著高表達(dá)，敲低PTRF/Cavin-1 可增強耐藥株對包括替莫唑胺在內(nèi)的多種化療藥物的敏感性，并降低CAV1 的表達(dá)水平，提示PTRF/Cavin-1 與GBM 化療耐藥有關(guān)[24]。

4 結(jié)語與展望

從1998 年發(fā)現(xiàn)并開始首次克隆，針對PTRF/Cavin-1 蛋白的研究從未停止。多年的研究積累，使學(xué)者對PTRF/Cavin-1 的功能愈發(fā)了解。除本文綜述的PTRF/Cavin-1 在GBM 發(fā)生發(fā)展中的重要作用之外，其還與葡萄糖攝取、細(xì)胞膜修復(fù)、細(xì)胞衰老等多個生理病理過程有關(guān)[9]，在干細(xì)胞[25]和其他腫瘤中也多有報道[26-29]。在膠質(zhì)瘤中，PTRF/Cavin-1 不僅可作為提示預(yù)后的標(biāo)志物，還通過與CAV1 互相作用來促進(jìn)膠質(zhì)瘤內(nèi)吞和外分泌，上調(diào)外基質(zhì)蛋白表達(dá)以增加膠質(zhì)瘤侵襲性，調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤脂質(zhì)代謝和PD-L1 水平來促進(jìn)免疫逃逸，并與膠質(zhì)瘤化療耐藥相關(guān)。本研究有理由相信，PTRF/Cavin-1尚有很多未發(fā)現(xiàn)的功能，其在膠質(zhì)瘤中的作用也不止如此。因此，靶向PTRF/Cavin-1 有望通過阻斷多條通路，從腫瘤增殖、腫瘤代謝、腫瘤免疫、腫瘤耐藥等多角度抑制膠質(zhì)瘤惡性行為，增強替莫唑胺敏感性。