TET2 合并DNMT3A 突變及其他共存基因突變對急性髓系白血病患者預(yù)后的影響*

孔繁聰 齊凌 黃文鋒 喻敏 周玉蘭 李菲

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是造血干、祖細(xì)胞異?？寺⌒栽鲋硨?dǎo)致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)及預(yù)后具有高度異質(zhì)性?；蛲蛔兪菍?dǎo)致其異質(zhì)性的重要原因。超過70%的AML 患者中編碼參與表觀遺傳學(xué)調(diào)控蛋白質(zhì)的基因發(fā)生突變，這些基因突變影響造血細(xì)胞的自我更新和分化，促使其向髓系轉(zhuǎn)化，在AML 發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要組成部分，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）和甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）是AML 中最常見的調(diào)控DNA 甲基化的基因。TET2 基因位于染色體4q24，編碼的TET2 蛋白通過將5-甲基胞嘧啶（5-mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）參與DNA 去甲基化，下調(diào)DNA 甲基化水平[2]。TET2 發(fā)生功能缺失突變可促進(jìn)啟動子甲基化，從而導(dǎo)致造血干細(xì)胞異常增殖和分化，誘發(fā)髓系惡性腫瘤[3]。多種髓系腫瘤中均可檢測到TET2 突變，常與不良預(yù)后有關(guān)。關(guān)于TET2 突變在AML 患者中的預(yù)后意義尚無共識，部分學(xué)者認(rèn)為合并TET2 突變患者預(yù)后差[4]，另有部分學(xué)者則認(rèn)為TET2 突變不影響患者預(yù)后[5]。目前一致的觀點為在合并CEBPA 雙突變或NPM1 突變且FLT3 突變陰性的正常核型AML患者中，TET2 突變與不良預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)為無事件生存時間（event-free survival，EFS）、無病生存時間（disease-free survival，DFS)和總生存期（overall survival，OS）縮短[6-7]，提示單獨TET2 突變對AML 患者的預(yù)后價值有限，TET2 突變對預(yù)后的影響可能依賴與其共存的突變基因。DNMT3A 突變是TET2 突變常見的共存突變之一，該突變與高水平腫瘤負(fù)荷相關(guān)，是預(yù)后不良的分子標(biāo)志[8]。然而，TET2 和DNMT3A 兩種基因突變共存時對AML 患者預(yù)后的影響模式尚未明確。隨著二代測序技術(shù)（NGS）在AML 領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，越來越多的突變基因被發(fā)現(xiàn)，這些突變基因與TET2 突變?nèi)绾喂餐绊慉ML 患者預(yù)后值得進(jìn)一步探索。本研究將對初治并行血液腫瘤相關(guān)突變基因外顯子NGS 檢測的AML 患者進(jìn)行回顧性分析，探究TET2 合并DNMT3A 突變及其他共存基因突變對AML 患者預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2018 年1 月至2021 年9 月于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的初治且行血液腫瘤相關(guān)突變基因外顯子NGS 檢測的512 例成人AML（非M3 型）患者的臨床資料，納入64 例合并TET2 突變患者為研究對象，其中TET2 合并DNMT3A 突變患者27 例，同時納入同期46 例DNMT3A 單突變患者作為對照。男性50 例，女性60 例，中位年齡54（15～79）歲。年齡＜60 歲患者74 例（67.3%），年齡≥60 歲患者36 例（32.7%）。原發(fā)AML 104 例（94.5%），繼發(fā)AML 6 例（5.5%），其中5 例繼發(fā)于骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS)，1 例繼發(fā)于慢性粒單核細(xì)胞白血?。╟hronic myelomonocytic leukemia,CMML）。根據(jù)中國急性髓系白血病診療指南[9]進(jìn)行危險度分層：低危34 例（30.9%），中危32 例（29.1%），高危44 例（40.0%）。所有入組患者治療前均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)確診[10]，另外抽取3 mL 骨髓（EDTA 抗凝管）送檢血液腫瘤相關(guān)基因外顯子NGS 檢測。本研究檢測的56 種血液系統(tǒng)腫瘤相關(guān)基因包括：ANKRD26、ASXL1、ASXL2、BCOR、BCORL1、CASP8、CBL、CCND1、CCDN2、CCDN3、CDC25C、CDKN1B、CEBPA、CSF3R、CUX1、DDX41、DNMT3A、ETV6、EZH2、FLT3、GATA1、GATA2、IDH1、IDH2、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KMT2A、KRAS、NF1、NPM1、NRAS、PHF6、PTEN、PTPN11、RAD21、RELN、RUNX1、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SMC1A、SMC3、SRP72、SRSF2、STAG2、TERT、TET2、TP53、U2AF1、WT1、ZBTB7A、ZRSR2。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)且患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液腫瘤相關(guān)基因外顯子NGS 檢測方法 提取送檢標(biāo)本中基因組DNA，分析上述基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的點突變和短片斷插入/缺失突變。檢測采用NGS 方法進(jìn)行。使用Illumina 測序平臺，靶向檢測與血液腫瘤密切相關(guān)的56 個基因的外顯子區(qū)，平均基因覆蓋率＞99%，平均檢測深度為2 000×，測序原始數(shù)據(jù)采用Torrent Suitev 3.0 軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 治療方案 誘導(dǎo)化療方案包括：標(biāo)準(zhǔn)劑量阿糖胞苷（Ara-C）聯(lián)合伊達(dá)比星（IDA）或柔紅霉素（DNR），IA 或DA 方案；去甲基化藥物單藥或聯(lián)合預(yù)激方案（包括Ara-C、粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合阿克拉霉素、依托泊苷或高三尖杉酯堿）。去甲基化藥物包括阿扎胞苷或地西他濱。姑息治療是以降低白細(xì)胞為目的，應(yīng)用小劑量Ara-C 或羥基脲的最佳支持治療。具體用藥劑量參考中國成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┰\療指南（2017 年版）[9]。接受誘導(dǎo)治療患者100 例（90.9%），其中IA/DA 方案77 例、去甲基化藥物單藥或聯(lián)合預(yù)激方案21 例、其他方案2 例，姑息治療10 例（9.1%）。

1.2.3 療效評價 治療間歇期（化療間歇第14 天）、恢復(fù)期（化療間歇第28 天）行骨髓穿刺評估化療效果。療效評估標(biāo)準(zhǔn)參照張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[11]。包括：完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、未緩解（non-response，NR）。

1.2.4 隨訪 隨訪方式以住院病歷、門診病歷及電話為主。隨訪日期截至2021 年11 月或患者死亡日期，失訪患者截至失訪日期。中位隨訪時間19.9（16.4～23.4）個月，失訪患者2 例（1.8%）。OS 定義為自診斷日期至患者死亡或隨訪截止日期。無復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）時間定義為患者達(dá)血液學(xué)CR 日期至患者死亡、首次復(fù)發(fā)或隨訪截止日期。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以中位數(shù)（median，M）范圍進(jìn)行連續(xù)性變量描述，百分比（%）描述分類資料。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。使用GraphPad Prism 8.0 繪制OS、RFS 生存曲線以及基因突變發(fā)生率柱狀圖。對于影響OS 的因素，行單因素和Cox 比例風(fēng)險回歸模型多因素分析。均采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TET2 突變患者的基因特征分析

512 例AML 患者中共檢測到TET2 突變64 例，突變頻率為12.5%（64/512），每例TET2 突變患者突變基因譜概況見圖1（圖中僅顯示已知功能類基因，基因功能分類以文獻(xiàn)[12]為參考）?；蛲蛔償?shù)目為1、2、3 個及數(shù)目≥4 個的患者分別有1 例占1.6%（1/64）、6 例占9.4%（6/64）、8 例占12.5%（8/64）及49 例占76.5%（49/64），基因突變數(shù)目≥2 個的患者比例高達(dá)98.4（63/64），每例患者平均合并5.2 個突變基因。與TET2 共突變發(fā)生率最高的基因為NPM1 43.8%（28/64），其次為DNMT3A 42.2%（27/64）、FLT3-ITD/TKD 40.6%（26/64）、CEBPA 26.6%（17/64）、TTN 20.3%（13/64），K/NRAS、WT1 共突變率均為15.6%（10/64），KIT、TP53 共突變率分別為14.1%（9/64）和12.5%（8/64），IDH1/2、ASXL1 和MUC16A 共突變率均為10.9%（7/64），共突變發(fā)生率≥5%的基因見圖2。

圖1 64 例TET2 突變AML 患者突變基因譜概況

圖2 TET2 共存突變基因發(fā)生率

2.2 TET2 及DNMT3A 突變對患者療效及生存的影響

為排除不同治療方案對預(yù)后的影響，本研究將接受IA/DA 方案誘導(dǎo)化療且進(jìn)行完整療效評估、年齡≤65 歲的70 例原發(fā)AML 患者納入療效及生存分析。TET2 合并DNMT3A 突變患者初次誘導(dǎo)CR 率為46.2%，低于TET2 單突變患者的76.9%（P=0.077），與DNMT3A 單突變患者無顯著性差異（P=0.952）。生存分析顯示，TET2 合并DNMT3A 突變患者的中位總生存期（median overall survival，mOS）時間為9.5個月，2 年OS 率為21.4%（95%CI：0～46.7%），明顯低于TET2 單突變患者[mOS：N/A，P=0.002；2 年OS率：60.6%（95%CI：38.8%～82.4%），P＜0.05]，而與DNMT3A 單突變患者的mOS 及2 年OS 率均無顯著性差異[mOS：25.1 個月，P=0.414；2 年OS 率：50.5%（95%CI：31.7%～69.3%），P＞0.05）]，見圖3A。TET2 合并DNMT3A 突變患者的中位RFS（median RFS，mRFS）為10.5 個月，2 年RFS 率為34.3%（95%CI：31.4%～65.5%）；TET2 或DNMT3A 單突變患者的mRFS 均為N/A，2 年RFS 率分別為63.4%（95%CI ：41.1%～85.7%）和59.4%（95%CI：22.2%～96.6%），三者之間mRFS 及2 年RFS 率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，圖3B）。

圖3 患者的生存分析

2.3 TET2 與其他常見共存突變對患者療效及OS 的影響

TET2 突變背景下，其他常見共存突變對療效及OS 的影響見表1（受病例數(shù)限制，僅分析共存突變對OS 的影響）。伴K/NRAS 突變患者的CR 率為28.6%，明顯低于無K/NRAS 突變患者的75.0%（P=0.030），而是否合并NPM1、FLT3-ITD、CEBPA 雙等位基因突變（CEBPAdm）、TTN 或WT1 突變對CR 率均無顯著性差異（均P＞0.05）。在OS 方面，合并FLT3-ITD突變患者的OS 明顯短于無FLT3-ITD 突變患者（P=0.030），而是否合并NPM1、CEBPAdm、TTN、K/NRAS 或WT1 突變對OS 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 TET2 與其他基因突變對AML 患者療效及OS 的影響

2.4 影響TET2 突變AML 患者OS 的單因素及多因素分析

目前，已知初診時年齡、外周血白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平及某些基因突變對AML 患者預(yù)后有明確影響。前面已分析DNMT3A 和FLT3-ITD 突變對TET2 突變AML 患者的OS 有顯著影響。為研究影響TET2 突變AML 患者OS 的獨立預(yù)后影響因素，納入DNMT3A、FLT3-ITD、年齡、WBC、LDH、骨髓原始細(xì)胞比例、預(yù)后分層等進(jìn)行單因素分析，逐一篩選出有差異的影響因素。結(jié)果顯示年齡≥60 歲、合并DNMT3A 突變、合并FLT3-ITD 突變、初次誘導(dǎo)療效未達(dá)CR 是影響TET2 突變AML 患者OS 的預(yù)后不良因素（P＜0.05），而其他因素對OS 無顯著性影響（P＞0.05，表2）。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義者納入Cox 比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明年齡≥60 歲、合并FLT3-ITD 突變、初次誘導(dǎo)療效未達(dá)CR 為影響TET2 突變AML 患者OS 的獨立危險因素（表2）。

表2 影響TET2 突變AML 患者OS 的單因素及多因素分析

3 討論

成人AML 是一類具有高度異質(zhì)性的疾病，基于NGS 技術(shù)檢測突變基因并進(jìn)行危險度分層是實現(xiàn)精準(zhǔn)治療及改善預(yù)后的前提。隨著NGS 技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用，越來越多的表觀遺傳調(diào)控相關(guān)基因突變被發(fā)現(xiàn)，這些突變基因通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)癌基因異常激活和（或）抑癌基因失活，導(dǎo)致白血病細(xì)胞異常增殖和分化[13]。TET2 和DNMT3A 是常見的表觀遺傳調(diào)控基因，二者共同維持著DNA 甲基化與去甲基化的動態(tài)平衡。研究表明，TET2 和DNMT3A 突變均出現(xiàn)在白血病演變的前期[14]，且TET2 或DNMT3A突變的造血干細(xì)胞均表現(xiàn)出相似的分化缺陷[15]，這兩種基因突變可能是白血病發(fā)生的始動突變，二者在白血病的發(fā)生過程中具有協(xié)同作用。DNMT3A 突變在AML 患者中預(yù)后不良[8]，TET2 合并DNMT3A 突變是否影響AML 患者預(yù)后尚未明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TET2 伴DNMT3A 突變患者初次誘導(dǎo)CR 率（46.2%）低于TET2 單突變患者（76.9%），與DNMT3A 單突變患者（45.2%）無顯著性差異。生存分析表明，TET2 合并DNMT3A 突變患者的mOS 及2 年OS 率顯著低于TET2 單突變患者，而與DNMT3A 單突變患者無顯著性差異，提示AML 患者在TET2 突變基礎(chǔ)上合并DNMT3A 突變影響患者預(yù)后。劉潔等[16]研究發(fā)現(xiàn)，8 例TET2 合并DNMT3A 突變和33 例DNMT3A 單突變患者的初次誘導(dǎo)CR 率分別為83.3%和61.3%，高于本研究結(jié)果；Aslanyan 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與DNMT3A單突變者（18 例）比較，TET2 合并DNMT3A 突變者（9 例）的OS 有降低趨勢（P=0.066）。上述研究與本研究結(jié)果有差異，可能與這兩個研究中兩組患者誘導(dǎo)化療方案不同及樣本量偏少有關(guān)；本研究中部分患者在完成誘導(dǎo)化療后未接受后續(xù)治療，亦會影響預(yù)后。上述研究表明，消除年齡及誘導(dǎo)方案等混雜因素后，TET2 突變在AML 患者中的預(yù)后可能更多地依賴與其相伴隨的共存突變。

AML 患者常出現(xiàn)多個基因共存突變。Papaemmanuil 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，86%AML 患者攜帶至少2 個突變基因。李劍雄等[18]應(yīng)用高通量測序技術(shù)對93 例AML 患者行34 種血液腫瘤相關(guān)的基因檢測發(fā)現(xiàn)53.8%的AML 患者攜帶至少2 個突變基因。本研究對512 例AML 患者進(jìn)行基因突變檢測，共檢出64 例合并TET2 突變患者，突變頻率為12.5%，與Chen 等[19]報道結(jié)果相符。其中，98.4% 的TET2 突變AML 患者攜帶≥2 個突變基因，半數(shù)以上（76.5%）攜帶≥4 個突變基因，平均每例患者合并5.2 個突變基因。本研究共存突變基因發(fā)生率高于上述文獻(xiàn)報道，與本研究檢測的突變基因種類更多及分析隊列不同有關(guān)（針對TET2 突變患者），此外人種或生活環(huán)境的差異亦有影響。NPM1、DNMT3A、FLT3-ITD/TKD、CEBPA、TTN等突變?yōu)門ET2 常見的共存突變，與相關(guān)研究結(jié)果[20-21]報道一致。除共存突變外，AML 患者中亦可檢出互斥突變。也有研究發(fā)現(xiàn)，TET2 突變與IDH1 或IDH2為互斥突變，因為兩者在AML 中的部分作用相互重疊[22]。本研究觀察到TET2 突變與IDH1 或IDH2 突變共存，而未發(fā)現(xiàn)TET2 突變同時合并IDH1 和IDH2 突變，可能與IDH1 與IDH2 共突變率較低或TET2 突變背景下IDH1 與IDH2 突變相互排斥有關(guān)。上述研究結(jié)果表明，白血病的發(fā)生由多個突變基因綜合作用的結(jié)果，契合白血病“二次打擊”學(xué)說。

多種髓系腫瘤中存在TET2 突變，多與預(yù)后不良相關(guān)，而在CMML 患者中TET2 突變提示OS 較好[23]。在AML 患者中，TET2 單獨突變對預(yù)后的影響尚存爭議[5,24]。大部分研究認(rèn)為其在細(xì)胞遺傳學(xué)正常且ELN2017 危險度分層低?；颊咧刑崾静涣碱A(yù)后，這部分患者EFS 明顯縮短，而在ELN 中危患者中對預(yù)后無不良影響[7]。Liu 等[25]對8 項研究共2 552 例AML患者進(jìn)行Meta 分析，結(jié)果提示TET2 突變對細(xì)胞遺傳學(xué)正常和危險度分層為低危及中危的患者均有不良預(yù)后影響。提示大部分研究并未將年齡及誘導(dǎo)治療方案進(jìn)行分類分析，一定程度上影響了對結(jié)果的解讀。盡管如此，這些結(jié)果仍然提示單個TET2 突變對AML的預(yù)后價值有限?；诖?，有必要探索TET2 聯(lián)合其他基因突變在AML 患者中的預(yù)后意義。

本研究在TET2 突變基礎(chǔ)上聯(lián)合其他突變基因?qū)ML 患者進(jìn)行預(yù)后分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合并K/NRAS突變患者的CR 率明顯低于無K/NRAS 突變患者。目前，K/NRAS 突變對AML 患者療效及預(yù)后的影響尚未明確。Wang 等[26]對1 149 例初治AML 患者進(jìn)行NGS 檢測，NRAS 突變合并U2AF1 突變患者誘導(dǎo)緩解率低、預(yù)后差，證實了多基因聯(lián)合突變在AML 預(yù)后評估中的價值。本研究未發(fā)現(xiàn)K/NRAS 突變對OS 具有不利影響，且因病例數(shù)少，未將KRAS 和NRAS 突變分開比較，可能是導(dǎo)致與文獻(xiàn)報道結(jié)果差異的原因，后續(xù)可擴(kuò)大樣本量及延長隨訪時間進(jìn)一步分析。FLT3/ITD 高頻突變AML 患者CR 率低、OS 短、易復(fù)發(fā)[9]，F(xiàn)LT3/ITD 突變合并其他基因突變亦提示預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)TET2 突變合并FLT3-ITD 突變患者的OS 明顯短于TET2 突變不合并FLT3-ITD 突變患者，但CR 率無顯著性差異，可能與納入的FLT3-ITD 突變患者中63.6%（7/11）為低頻突變有關(guān)。

綜上所述，TET2 突變常合并多種共存突變，共存突變影響患者療效及預(yù)后。鑒于本研究納入病例數(shù)及隨訪時間有限，結(jié)果存在一定局限性，未來可進(jìn)行更大樣本量的前瞻性研究進(jìn)一步明確TET2 突變及其共存突變在AML 患者中的預(yù)后價值。