玻璃體內(nèi)細(xì)胞移植或細(xì)胞衍生物注入在視神經(jīng)損傷中的作用△

何雪俊 邢怡橋 楊 寧

中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后，其神經(jīng)元難以再生。視神經(jīng)也屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，近年來關(guān)于視神經(jīng)損傷和修復(fù)的研究成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)損傷后，玻璃體內(nèi)細(xì)胞移植或細(xì)胞衍生物注入可一定程度地保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)并促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生[3-4]。本文就玻璃體內(nèi)細(xì)胞移植或細(xì)胞衍生物注入在視神經(jīng)損傷中的作用展開綜述，以期為視神經(jīng)受損后再生的基礎(chǔ)研究提供方向，為視神經(jīng)損傷的臨床治療提供依據(jù)。

1 神經(jīng)受損后的病理改變

神經(jīng)受損后隨即出現(xiàn)一系列的病理改變，從最初軸突細(xì)胞骨架的機(jī)械斷裂，到軸索運(yùn)輸中斷、腫脹和蛋白水解等[5]。周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遠(yuǎn)端軸突迅速崩解，而后雪旺細(xì)胞快速去分化并與成纖維細(xì)胞共同分泌細(xì)胞因子促進(jìn)免疫細(xì)胞的聚集，同時(shí)神經(jīng)元胞體開始表達(dá)再生相關(guān)基因[6]。但是再生能力薄弱的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后血腦屏障遭到破壞，加之白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞入侵，引起炎癥反應(yīng)過度激活[7]，繼而發(fā)生細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)元功能喪失[8-10]。例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞具有與巨噬細(xì)胞相似的功能，可以產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子[11]。Horn等[12]研究證實(shí)，神經(jīng)受損后巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均會(huì)被激活，對(duì)斷裂的神經(jīng)軸突回縮產(chǎn)生明顯的影響。

2 視神經(jīng)再生的阻礙因素

2.1 RGCs損傷后大量死亡Fischer等[13]和Joachim等[14]研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)鉗夾后，caspase依賴性凋亡通路被激活，導(dǎo)致RGCs在兩周內(nèi)大量死亡。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠視神經(jīng)損傷后4～5 d RGCs的存活率基本不變，自第6天開始存活率下降了約20%，尚存活的RGCs表現(xiàn)出偏心核，損傷持續(xù)加重。至視神經(jīng)鉗夾后第14天，存活的RGCs所剩不足10%[15-16]。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，小鼠視網(wǎng)膜中不同亞型的RGCs對(duì)同一種損傷的反應(yīng)性差異很大[17]。同時(shí)，我們的研究結(jié)果證實(shí)，RGCs在視神經(jīng)鉗夾后第3天開始出現(xiàn)進(jìn)行性減少，而視神經(jīng)鉗夾30 d后，存活的RGCs數(shù)量無顯著變化[17]。大量研究證據(jù)表明，缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)、去神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)不良以及缺血再灌注損傷均可導(dǎo)致RGCs的不可逆性死亡[18-20]。因此深入探討RGCs死亡的機(jī)制和過程，最大限度地保護(hù)RGCs還需要我們付出很大的努力。

2.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的再生能力弱中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程復(fù)雜，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后周圍環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)大量的抑制性神經(jīng)生長(zhǎng)因子，這可能是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后再生能力薄弱所致。在胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，軸突首先從神經(jīng)元胞體發(fā)出，然后以“網(wǎng)絡(luò)化生長(zhǎng)”的方式向周圍延伸，隨著軸突不斷伸長(zhǎng)，末端連接到目標(biāo)，從而順利構(gòu)建功能回路。由于動(dòng)物在出生后和青春期階段體型的增加，可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)“網(wǎng)絡(luò)化生長(zhǎng)”的距離比最初所要經(jīng)過的距離要遠(yuǎn)[21]。此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損部位周圍存在的抑制軸突生長(zhǎng)分子，如少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白、髓磷脂相關(guān)糖蛋白等，被認(rèn)為是阻礙軸突再生的重要因素[22]，通過基因缺失或藥理抑制去除這些分子的影響，依然不能使軸突進(jìn)行長(zhǎng)距離再生[23]。

2.3 神經(jīng)生長(zhǎng)因子的缺乏神經(jīng)生長(zhǎng)因子在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活具有重要的調(diào)節(jié)功能[24]。研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子與其受體，在外側(cè)膝狀體和視皮層以及視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中均廣泛表達(dá)[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，通過套管-微型泵系統(tǒng)將神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射到腦室內(nèi)，具有調(diào)節(jié)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜發(fā)育和分化的作用，并可促進(jìn)RGCs的存活和軸突再生[27-28]。同時(shí)，也有研究證實(shí)，RGCs中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺失，可以導(dǎo)致RGCs凋亡并阻礙其再生[29]。因此，我們可以認(rèn)為神經(jīng)生長(zhǎng)因子的缺乏是導(dǎo)致視神經(jīng)難以再生的一個(gè)重要因素。

2.4 瘢痕組織的形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，炎癥反應(yīng)發(fā)生并過度激活，伴隨多種細(xì)胞信號(hào)通路活化，受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)周圍會(huì)形成兩種類型的瘢痕組織，一類是由成纖維細(xì)胞形成的纖維化瘢痕，另一類是由活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等形成的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕[7,30]。其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌一類以硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)為代表的蛋白聚糖分子[31]，CSPG由蛋白質(zhì)核心和硫酸軟骨素側(cè)鏈組成[32]。生理情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CSPG可以發(fā)揮神經(jīng)突觸抑制作用，通過抑制神經(jīng)元進(jìn)入不適當(dāng)?shù)膮^(qū)域從而指導(dǎo)軸突的生長(zhǎng)方向[33]。研究表明，CSPG主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的瘢痕和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)外膜區(qū)域，是神經(jīng)系統(tǒng)受損后神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的主要抑制劑[34-35]。除了CSPG外，蛋白信號(hào)素3也被發(fā)現(xiàn)具有延緩膠質(zhì)瘢痕生長(zhǎng)的作用[7]。我們可以認(rèn)為，活化的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了吞噬并分解神經(jīng)元碎片、釋放某些遞質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)因子以及修復(fù)血腦屏障的功能，然而瘢痕組織的形成又能將受損部位與周圍組織隔絕，即使軸突再生往往也難以跨越瘢痕組織。因此，視神經(jīng)損傷后，膠質(zhì)瘢痕的形成也是導(dǎo)致視神經(jīng)再生障礙的重要因素[36-37]。

3 玻璃體內(nèi)細(xì)胞移植或細(xì)胞衍生物注入對(duì)受損視神經(jīng)的作用

3.1 雪旺細(xì)胞大多數(shù)哺乳動(dòng)物周圍神經(jīng)系統(tǒng)遭到破壞后具備一定的自愈能力，其結(jié)構(gòu)和功能往往可以得到很大程度的恢復(fù)和保存，周圍神經(jīng)系統(tǒng)的這一特性與周圍神經(jīng)的兩種主要組成成分雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞密不可分。Li等[38]把從新生坐骨神經(jīng)分離純化的雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞移植入成年大鼠玻璃體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這兩類細(xì)胞均可在短期內(nèi)降低RGCs的死亡率，在視神經(jīng)損傷的一段時(shí)間內(nèi)，玻璃體內(nèi)移植大量的雪旺細(xì)胞后視盤周圍RGCs存活率更高，軸突分支也更多。近期，Ahmed等[39]通過研究也證實(shí)，將含有雪旺細(xì)胞的坐骨神經(jīng)移植物注入玻璃體內(nèi)可顯著促進(jìn)RGCs的存活和視神經(jīng)軸突再生，在聯(lián)合視神經(jīng)斷端與坐骨神經(jīng)移植物吻合后，這種保護(hù)作用更為明顯。雪旺細(xì)胞可分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；同時(shí)，雪旺細(xì)胞衍生因子可能調(diào)節(jié)了基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，從而促進(jìn)CSPG降解[40]，使瘢痕組織溶解，減輕視神經(jīng)損傷后對(duì)軸突再生的抑制，這些都可能是雪旺細(xì)胞對(duì)受損視神經(jīng)具有保護(hù)作用的潛在機(jī)制。

3.2 脂肪干細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后干細(xì)胞移植的作用在多種疾病模型的研究中都得到了肯定[41]。金海等[42]將由大鼠脂肪組織中獲取的脂肪干細(xì)胞注入視神經(jīng)鉗夾后的大鼠玻璃體內(nèi)，觀察到自神經(jīng)損傷第7天開始，玻璃體內(nèi)移植脂肪干細(xì)胞的大鼠RGCs密度較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組高。并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，雖然RGCs依舊減少，但實(shí)驗(yàn)組RGCs存活的優(yōu)勢(shì)更加明顯；同時(shí)，在距離視神經(jīng)損傷相同的位置，移植了脂肪干細(xì)胞的大鼠軸突數(shù)均明顯多于對(duì)照組。由此可見，脂肪干細(xì)胞移植能促進(jìn)視神經(jīng)損傷后RGCs的存活和軸突的再生。Di Summa等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞可顯著減輕神經(jīng)損傷后纖維化組織的形成，在預(yù)防瘢痕組織的形成方面具有巨大的潛力，這為脂肪干細(xì)胞促進(jìn)RGCs存活和軸突再生提供了依據(jù)。

3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞可以從骨髓和其他組織(例如脂肪組織、神經(jīng)組織、臍帶血和真皮)獲取。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在視神經(jīng)鉗夾模型中具有較好的治療效果[43]。將骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞注入到大鼠玻璃體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它對(duì)視神經(jīng)損傷后的RGCs有保護(hù)作用，并能刺激軸突再生[44-45]。Mead等[46]也發(fā)現(xiàn)，牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞均可促進(jìn)RGCs存活和軸突再生，這兩種細(xì)胞在進(jìn)入玻璃體后，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等分泌都增加，植入牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子滴度更高，其對(duì)損傷的視神經(jīng)的保護(hù)作用和促進(jìn)軸突再生能力也相對(duì)更強(qiáng)。此外，Chung等[47]研究也證實(shí)，人絨毛膜板源性間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠視神經(jīng)擠壓傷后也可促進(jìn)軸突存活。神經(jīng)生長(zhǎng)因子與生長(zhǎng)相關(guān)蛋白在間充質(zhì)干細(xì)胞移植入玻璃體后水平升高[46]，極有可能是間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮視神經(jīng)保護(hù)作用的主要機(jī)制之一?；诖耍覀冋J(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞在視神經(jīng)受損時(shí)對(duì)RGCs及軸突有一定保護(hù)和促進(jìn)再生作用。

3.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)受損的視神經(jīng)有積極的保護(hù)作用后，人們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將由骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌而來的外泌體注入視神經(jīng)鉗夾后的大鼠玻璃體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGCs存活率、RGCs功能、視網(wǎng)膜厚度、軸突再生長(zhǎng)度均高于對(duì)照組[4]。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體注入玻璃體內(nèi)避免了將活細(xì)胞移植入玻璃體中可能出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生；不僅如此，作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮視神經(jīng)保護(hù)作用的潛在機(jī)制之一，外泌體的神經(jīng)保護(hù)作用也更為直接和高效。

4 討論及展望

綜上所述，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞移植物或其衍生物具有促進(jìn)RGCs存活和軸突再生的作用。本文主要對(duì)雪旺細(xì)胞和幾種間充質(zhì)干細(xì)胞的視神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了探討。目前，尚無有效證據(jù)表明再生的軸突已建立了有效的聯(lián)系，視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分，受損后如何重新建立解剖結(jié)構(gòu)再生和功能修復(fù)的問題，是亟待解決的難點(diǎn)。因此，探索視神經(jīng)病變后RGCs死亡和軸突再生的相關(guān)機(jī)制，提高RGCs存活及其軸突再生的概率并有效應(yīng)用于臨床對(duì)于醫(yī)學(xué)和科研工作者而言，任重而道遠(yuǎn)。

誠(chéng)然，某些玻璃體內(nèi)細(xì)胞移植或細(xì)胞衍生物注入在視神經(jīng)保護(hù)方面有著非常巨大的潛力，其中還有許多問題值得思考和解決：(1)移植的細(xì)胞進(jìn)入玻璃體后是否能夠存活，存活時(shí)間可以持續(xù)多久？(2)進(jìn)入玻璃體的細(xì)胞是直接發(fā)揮其視神經(jīng)保護(hù)作用還是分化為其他類型的細(xì)胞后發(fā)揮作用？(3)進(jìn)入玻璃體的細(xì)胞是直接產(chǎn)生作用還是通過分泌某些細(xì)胞因子繼而通過下游信號(hào)通路發(fā)揮作用？(4)視神經(jīng)損傷往往具有不可預(yù)測(cè)性，如何把握進(jìn)行治療干預(yù)的時(shí)機(jī)？目前的研究表明，部分移植的細(xì)胞在進(jìn)入玻璃體后神經(jīng)生長(zhǎng)因子的滴度會(huì)有所增加，在其分泌的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下，瘢痕組織的形成會(huì)受到抑制，細(xì)胞來源的衍生物在神經(jīng)保護(hù)方面也具有明顯的優(yōu)勢(shì)。這些都為我們探尋視神經(jīng)損傷后再生的阻礙因素，以及后續(xù)開展針對(duì)性的治療提供了思路。