甲狀腺相關性眼病的診斷性生物標志物研究進展△

張 浩 趙 婧 葛小寧 董雅儒

甲狀腺相關性眼病(TAO)是Graves病(GD)最常見的甲狀腺外表現(xiàn)[1]。大約50%的GD患者在一年至數(shù)十年可發(fā)展為TAO，而在TAO患者中，大約80%的患者會在18個月內發(fā)展為甲狀腺功能亢進[1]。臨床上大約10%的TAO患者在診斷為甲狀腺功能障礙前，因嚴重的眼部癥狀就診于眼科門診[2]。TAO復雜的臨床表現(xiàn)(如單側眼球突出)及其相似疾病(如眼眶肌炎、重者肌無力以及IgG4相關免疫疾病)等加大了TAO的診斷難度[3-4]。

生物標志物可以是任何類型的特異性分子標記物、特定的臨床特征、影像學特征或臨床評分等，其有助于實現(xiàn)TAO早期診斷，評估其嚴重程度及預后。TAO的早期階段為自身免疫過程，其活躍性在13～24個月達到峰值[5]。若能對TAO實現(xiàn)早期診斷并給予相應干預，從而控制其進一步惡化，將明顯改善患者的生活質量[6]。

1 TAO危險因素及發(fā)病機制

TAO是由內源性和外源性因素共同導致的。前者包括年齡、性別和遺傳等因素。據報道，TAO在女性中的發(fā)病率約為男性的3.7倍，而重度TAO往往傾向于男性，且男性平均年齡大于女性[6]。目前在遺傳因素方面尚未取得重大進展，特別是區(qū)別患有或不患有TAO的GD患者[2,7-8]。此外，吸煙和放射性碘治療史為TAO惡化的外源性危險因素[9]。

TAO與GD在發(fā)病機制上存在緊密聯(lián)系，兩種疾病都與促甲狀腺激素受體(TSHR)的表達有關。該受體在甲狀腺細胞和眼眶組織的成纖維細胞中同時存在，B細胞識別作為抗原的TSHR產生相應抗體，從而導致自身免疫反應。此外，胰島素樣生長因子I(IGF-1)可促進眼眶脂肪干細胞的增殖分化和脂質堆積。值得注意的是，TSHR與IGF-1R之間存在交叉抗原，TSHR抗體能激活IGF-1R，促進IGF-1的產生，從而造成突眼[10]。另有研究表明，TSHR與IGF-1R可形成功能復合體，兩者發(fā)揮協(xié)同作用，可表達多種細胞因子并促進透明質酸累積，促使眼部炎癥發(fā)生，繼而肌腹增粗和脂肪組織擴張造成突眼[11-12]。

2 TAO的診斷局限性

TAO早期診斷重點在于評估其活動性。目前臨床常用臨床活動評分(CAS)評價，其通過眼瞼、結膜、淚阜紅腫、自發(fā)性眼球后疼痛及眼球轉動痛等指標來評估TAO活動性，從而決定是否給予激素治療。但對于CAS、NOSPECS、VISA以及EUGOGO等評分量表而言，其都存在明顯局限性，如主觀的量表評估多取決于評估的時機、患者對其臨床癥狀的主觀感受以及進行評估的醫(yī)師專業(yè)水平，同時評估的臨床信息類型不同，因此也大大降低了其解釋的準確性[13]。此外，TAO的眼部病變可發(fā)生于甲狀腺功能正常、亢進及減退時，故甲狀腺功能異常病史對TAO診斷僅有一定的參考意義[14]。

甲狀腺激素受體抗體(TRAb)是臨床上常用的TAO診斷生物標志物，但目前TRAb水平與TAO的關系仍存在爭議[15]。多項研究表明，TSHR刺激性免疫球蛋白(TSI)水平與TAO的發(fā)生率、嚴重性顯著相關[16]。但由于TSI的檢測過程較為繁瑣、耗時，目前其應用尚局限于專業(yè)實驗室，未能廣泛應用于臨床檢測。此外，CT和MRI在非典型TAO的初步診斷、手術方案設計以及與其他眼眶疾病的鑒別診斷中起著至關重要的作用，但目前尚未就在疾病發(fā)展過程中使用不同成像方式達成共識，有待進一步商榷[17]。

3 TAO生物標志物

生物標志物在疾病狀態(tài)下常常存在于各種體液，如尿液、血清、淚液、淋巴液等[18]。眼眶脂肪和眼外肌活檢是極具侵入性的樣本采集方式，雖不適合臨床早期診斷，但對TAO發(fā)病機制研究具有不可替代的作用。本文將根據樣本來源類型對近年來TAO診斷相關的分子生物標志物研究進展予以綜述。

3.1 血液中TAO生物標志物的研究進展

3.1.1 TSHR刺激性免疫球蛋白TRAb在自身免疫性甲狀腺病患者體內特異性存在。根據TRAb對TSHR的不同作用，可分為TSI、TSHR抑制性免疫球蛋白(TBI)和中性抗體。研究發(fā)現(xiàn)，TSI和TRAb水平均與TAO的嚴重程度和臨床活動性呈正相關，但TSI是更敏感的血清學評估指標，更能反映TAO的眼部表現(xiàn)[19-20]。此外，在75例輕度和33例中重度TAO患者中，TSI的檢測陽性率均高達94%以上，而TRAb僅為84%和73%[21]。Diana等[22]的多中心研究顯示，患有TAO的GD兒童的TSI水平顯著高于僅患有GD的兒童,兩組兒童之間的TRAb水平無顯著差異；經過3年治療期后，GD兒童的TSI水平降低了69%，而患有TAO的GD兒童降低了20%，證實了血清TSI也是兒童TAO的診斷生物標志物。此外，血清TSI水平與新近發(fā)病的甲狀腺功能障礙性視神經病變顯著相關，可識別新近發(fā)病需要緊急治療的患者[23]。然而，TSI測定可重復性差且需要多個步驟顯示出其敏感性和特異性，故目前臨床開展難度較大，仍需進一步探究[24]。

3.1.2 硒硒(Se)是甲狀腺激素合成和代謝的重要物質之一，它在TAO的發(fā)生發(fā)展中有著重要的意義[25-26]。流行病學研究表明，TAO的患病率增加與飲食中硒的低攝入量有關,硒缺乏(≤93 μg·L-1)是發(fā)生重度TAO的潛在危險因素[27-28]。研究表明，硒對甲狀腺完整性的局部保護作用與減少促炎細胞因子的釋放有關，適當補硒可降低甲狀腺自身抗體水平[29-30]。最近研究發(fā)現(xiàn)，血漿硒水平降低不僅可反映TAO的臨床活動性，而且與CAS顯著相關。故微量元素硒可為TAO的早期診斷和活動性評估提供一定依據，值得進一步探究[31]。

3.1.3 細胞因子細胞因子是具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，具有調控免疫應答、細胞生長和分化的作用。炎癥細胞與細胞因子作為炎癥級聯(lián)反應中重要一環(huán)可促進TAO進展為活動期。大部分炎癥細胞和細胞因子通過旁分泌或自分泌方式，誘導局部炎癥的加劇與擴散，進而引發(fā)眼部特征性的解剖學、組織學改變[32]。近年來研究已確定的活動期TAO生物標志物有IL-1β、IL-6、IL-17 、IL-15、IL-23、IL-29、CXCL10、CCL2[31,33]。值得注意的是，CCL2是診斷活動期TAO的獨立預測因子，且其與CAS結果顯著相關[31]。此外，IL-10、IL-8和CCL20水平在TAO患者血液中顯著升高，提示這些細胞因子有作為TAO生物標志物的潛力[34-37]。

3.1.4 IgG4IgG包括4種不同的亞類，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其中IgG4在免疫性疾病中具有重要作用[38]。研究發(fā)現(xiàn)，IgG4水平是TAO發(fā)生的獨立相關因素，在TAO患者中，隨著CAS的增加，IgG4水平和IgG4/IgG比值均明顯升高。與IgG4水平正常組相比，高IgG4水平組患者具有較高的自身免疫性甲狀腺疾病家族史發(fā)生率、高水平的游離T4、TRAb和高IgG4/IgG比值，當IgG4水平≥1.35 g·L-1時，TAO患者眼部表現(xiàn)多呈雙側對稱性[39-40]。眾所周知，TSI和CAS為是否抗炎治療的重要參考指標。然而，TSI所需的生物測定非常難以在臨床進行，因此，臨床醫(yī)生仍采用NO SPECS、CAS和眼眶CT/MRI表現(xiàn)來決定激素沖擊時機，這種評估方法有時會導致治療延遲。研究表明，IgG4可誘導TAO患者眼眶成纖維細胞合成透明質酸[39]，還可促進眼眶組織中TRAb的生成[41]，這些結果都提示IgG4水平有助于TAO的監(jiān)測和診斷新的TAO亞型，并且血清IgG4水平可能是區(qū)分TAO急性炎癥早期的廉價和易獲得的敏感指標。

3.1.5 富含半胱氨酸的血管生成誘導劑61富含半胱氨酸的血管生成誘導劑61(CYR61)是一種分泌型細胞外基質相關信號蛋白，可調節(jié)各種細胞活動，包括細胞增殖、遷移、黏附和凋亡等[42]。通常CYR61在正常成年人體內維持較低水平，但在細菌和病毒感染等條件下，CYR61水平顯著升高，其通過提供炎癥細胞因子來維持炎癥微環(huán)境[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)，TAO患者的血清CYR61水平與血清TRAb水平顯著相關，并且TAO患者的CYR61 mRNA表達水平較正常組明顯升高[45]。此外，CYR61還參與眼眶炎癥和眶脂肪生成[46]。因此，CYR61作為活動期TAO的診斷生物標志物顯示出良好的潛力。

3.1.6 抗乙醛脫氫酶2抗體乙醛脫氫酶(ALDH)包括胞質ALDH1和線粒體ALDH2，是細胞內同工酶的一大家族，負責將細胞內的醛氧化為羧酸，參與多種細胞活動，如細胞增殖、分化以及細胞氧化應激反應等[47]。同時氧化應激也是TAO發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，目前有學者猜測ALDH2可能是TAO患者的自身抗原， ALDH2可能參與了TAO發(fā)展中的氧化應激過程[48]。由于ALDH2是一種細胞內蛋白，其作為自身抗原的作用可能是繼發(fā)于細胞損傷。Cheng等[49]研究發(fā)現(xiàn)，抗ALDH2抗體的滴度在TAO患者較正常對照組顯著升高，同時抗ALDH2抗體與TAO的臨床活動和嚴重程度呈顯著正相關[49]。這提示抗ALDH2抗體可作為TAO的新型生物標志物，并可在隨訪期間，通過測量抗ALDH2抗體滴度監(jiān)測TAO的臨床活動性。

3.2 尿液中TAO生物標志物的研究進展

3.2.1 脂質脂質水平的變化與各種代謝性疾病密切相關，在信號轉導、細胞增殖和凋亡方面起重要作用。Byeno等[50]通過對GD、TAO患者及健康人的尿液脂質進行定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)TAO和GD患者的整體脂質曲線基本相似，但是與健康對照組相比存在顯著差異；GD和TAO患者的尿溶血性磷脂酰膽堿顯著增加，尿磷脂酰膽堿則明顯減少，尿甘油三酯降低；與GD患者相比，在TAO患者的尿液樣本中1-磷酸鞘氨醇水平顯著增加。因此，1-磷酸鞘氨醇水平可以作為鑒別TAO和GD的有力候選指標。這些發(fā)現(xiàn)提示，可根據尿液脂質分析來區(qū)分GD和TAO患者的狀態(tài)，從而早期對TAO患者病情進行干預。

3.2.2 糖胺聚糖糖胺聚糖(GAG)作為生物體內重要的生物大分子，廣泛存在于細胞表面和細胞外基質中，參與細胞增殖、分化和免疫調節(jié)等重要的生物學過程。在TAO發(fā)展過程中，TRAb可與眼眶成纖維細胞上的TSHR結合，激活免疫級聯(lián)反應，促進包括透明質酸在內的GAG的局部合成，在強親水性透明質酸的積聚下導致結締組織和眼外肌局部積水和腫脹，進而惡化眼眶的靜脈和淋巴循環(huán)[51]。已有研究證實,非活動期TAO患者的尿GAG水平與正常人無明顯差異，而活動期TAO患者的尿GAG水平比非活動期TAO患者高2～3倍[52]。故若能合理地將CAS和尿GAG測定結果結合起來，可能在區(qū)分TAO臨床活動性和嚴重程度上非常有效，并有助于TAO患者的早期診斷。

3.3 淚液中TAO生物標志物的研究進展

3.3.1 8-羥基-2-脫氧鳥苷8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)由受損DNA氧化鳥嘌呤形成，它不僅是活性氧損傷的標志，而且其形成取決于活性氧水平和8-OHdG修復酶的功能，故可用于測量氧化應激中的DNA損傷[53]。有證據表明,TAO的代謝與活性氧緊密相關[1,32]。Tsai等[54]已證實，TAO患者尿液中的8-OHdG水平顯著升高,為正常人的1.9倍,這種升高在活動性TAO患者中更加顯著，為正常人的2.4倍。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在TAO患者的眼眶成纖維細胞中，8-OHdG水平顯著高于正常對照組，但在眼眶脂肪組織中，8-OHdG含量與正常對照組并無顯著差異[55]。然而Choi等[56]研究發(fā)現(xiàn)，在活動期TAO患者淚液中，8-OHdG水平顯著高于正常對照組及非活動期TAO組，另一方面，活動期TAO組患者的淚液8-OHdG水平與CAS顯著相關，而非活動期TAO患者淚液8-OHdG水平與CAS之間不相關，ROC曲線顯示，淚液8-OHdG預測活動期TAO的敏感性和特異性分別為95.2%和85.4%。此外，淚液8-OHdG水平與血清T3、T4、FT4之間的并無顯著相關性[56]。

3.3.2 丙二醛丙二醛(MDA)是DNA氧化和脂質過氧化最常見的副產物之一[57]。與8-OHdG類似，在TAO患者眼眶成纖維細胞中，MDA水平明顯高于正常對照組[55]。此外，活動期TAO患者淚膜中MDA水平明顯升高，并且其水平與CAS呈正相關，可良好反映疾病的臨床活動性和嚴重程度。值得注意的是，TAO患者淚液中8-OHdG水平與MDA水平存在顯著相關性[56]。

3.3.3 鈣結合蛋白A4S100鈣結合蛋白參與調節(jié)許多重要的細胞活動，如鈣穩(wěn)態(tài)、細胞骨架組織、應激反應、細胞運動、細胞增殖和分化等，鈣結合蛋白A4(S100A4)為S100鈣結合蛋白家族的一員。Ma等[57]證明了S100鈣結合蛋白家族(包括S100A4)在健康角膜的角膜緣上皮隱窩的細胞質中高表達，而在發(fā)炎的角膜緣中表達顯著降低，因此S100A4水平一定程度上代表角膜緣的正常性[58]。在Kadrmas等[59]的早期研究中，角膜緣上皮隱窩被認為與甲狀腺功能障礙有關，是嚴重GD的預后指標。近年來通過定量蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，隨著TAO嚴重程度的增加，S100A4蛋白變化呈明顯下降趨勢，盡管S100A4蛋白的表達也不是角膜緣所獨有的，但TAO自身免疫過程導致的角膜緣炎癥增加可能會在淚液中觀察到S100A4蛋白的下降趨勢，從而反映其疾病的嚴重程度和活動性，并且S100A4蛋白在輕度和中重度TAO中均下調，這為GD患者是否具有TAO發(fā)生傾向提供了一個良好監(jiān)測指標[60]。

3.3.4 催乳素誘導蛋白催乳素誘導蛋白(PIP)通常在幾種外分泌組織中表達，如淚腺、唾液腺和汗腺，其主要作用與宿主防御和免疫調節(jié)有關，是CD4+T細胞受體介導凋亡的特異性抑制劑[61]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PIP在圓錐角膜患者中表達下調，而在TAO患者中顯著上調。同時PIP可以間接反映重度TAO患者免疫耐受的破壞和纖維化進程，其表達上調可能意味著患者即將進展為重度TAO，故PIP淚液蛋白可作為監(jiān)測TAO進展的早期生物標志物[61]。

3.3.5 外泌體蛋白外泌體是30～150 nm大小的胞外囊泡，存在于許多體液中，如血漿、尿液、滑液、乳汁、唾液和淚液[62]。目前淚液外泌體蛋白作為疾病活動生物標志物已在原發(fā)性干燥綜合征、原發(fā)性開角型青光眼和多發(fā)性硬化癥等中取得顯著研究進展[63-65]。在最近研究中，利用高靈敏度的蛋白質組細胞因子陣列試劑盒可以檢測淚液中23種外泌體蛋白，其中維生素D結合蛋白、C反應蛋白、基質金屬蛋白酶-9和血管黏附分子-1等蛋白在TAO患者外泌體中的表達水平顯著高于健康對照組[66]。外泌體數(shù)量的增加可能導致其功能的激活和更多炎癥細胞因子的釋放，從而促進眶內組織重塑和炎癥發(fā)生。綜上所述，淚液外泌體數(shù)量的增加和外泌體中特異蛋白的表達可能反映了TAO的病理過程和疾病的嚴重程度。

3.3.6 溶菌酶CTAO患者淚液中，絕大部分淚液蛋白表達下調，只有少部分淚液蛋白表現(xiàn)為上調，例如溶菌酶C(LYZ)和乳鐵蛋白。其中LYZ是人類淚液蛋白的重要組成部分，具有抗菌、抗感染、抗病毒的特性，并在免疫防御中起著相當重要的作用。Aass等[67]研究顯示，LYZ不僅在鑒別中重度TAO的GD患者和單純GD患者中具有意義，對于癥狀不典型的輕度TAO患者也有顯著的鑒別能力，在排除年齡、吸煙和性別干擾因素后，這種相關性仍然顯著。值得注意的是，該研究發(fā)現(xiàn)，中重度TAO患者淚液中LYZ水平的增加與TRAb水平顯著相關，而在輕度TAO患者中不具有統(tǒng)計學意義。此外，在該項研究中，催淚蛋白(lacritin)和鋅-α-2糖蛋白(AZGP1)在區(qū)分中重度患有TAO的GD患者與單純GD患者中存在意義。聯(lián)合應用LYZ、LACRT和AZGP1可形成一個強大的淚液蛋白組合，能夠區(qū)分GD患者是否伴有TAO，其準確率可高達93%,這有助于TAO的診斷以及其活動性的評估[67]。

3.4 糞便中TAO生物標志物的研究進展

3.4.1 擬桿菌門研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群與TAO相關性狀及血清TRAb水平之間存在相關性[68]。TAO患者腸道菌群的組成與TRAb之間的潛在關系可能為TAO相關免疫反應提供新認知。人類腸道主要是厚壁菌門和擬桿菌門寄居，后者多以擬桿菌屬和普雷沃菌屬為主。多位學者報道普雷沃菌與慢性炎癥狀態(tài)有關，這可能提示與活動性眼眶炎癥有關[69]。近年來發(fā)現(xiàn)，普雷沃菌屬中的Prevotella.copri菌和擬桿菌屬與TRAb水平顯著相關[69]。這提示了TAO患者擬桿菌門與TRAb之間存在潛在緊密關系。

3.4.2Deinococcus-ThermusDeinococcus-Thermus細菌具有抗氧化、耐干燥和耐高溫的特性。在控制平均甲狀腺激素水平下，特定的細菌在是否患有TAO的疾病組之間顯示出差異性，其中Deinococcus-Thermus細菌尤為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激促進TAO的發(fā)生，而Deinococcus-Thermus細菌能夠合成大量類胡蘿卜素，類胡蘿卜素可以通過中斷自由基的傳播來減少氧化應激[70-71]。因而，Deinococcus-Thermus細菌及其代謝產物可能在TAO的診斷中具有一定意義。

3.5 眼眶脂肪中TAO生物標志物的研究進展MicroRNA是一類長度為18～24 nt的非編碼RNA分子,它在細胞增殖、分化和凋亡等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[72]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TAO患者的眼眶脂肪中的MicroRNA-130a表達顯著升高，尤其是在脂質過度積累的TAO患者中，MicroRNA-130a可通過抑制信號通路中的AMPK，參與眼眶內脂肪組織積聚、過度形成及眼眶纖維化過程[72-73]。同時MicroRNA-130a高表達在一定程度上提示了患者進展為重度TAO的可能性[74]。此外，研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧可上調MicroRNA-130a的水平，而吸煙也會使TAO的發(fā)病率增加約7倍[75-76]。故吸煙是否會增加TAO的MicroRNA-130a水平有待進一步研究。

4 展望

目前TAO的發(fā)病機制和生物標志物方面研究已取得一定進展，但鑒于疾病的復雜性以及檢測手段的局限性，在臨床中開展應用仍然受到限制。用于TAO診斷的高效生物標志物仍有待進一步發(fā)現(xiàn)，為了能更大規(guī)模地應用到臨床，良好的生物標志物來源應該考慮到樣本采集的可行性和TAO疾病特征相關性，例如眼眶脂肪或肌肉雖具有高度特異性，但其采集過程是一種侵入性方法，只能待炎癥穩(wěn)定消退后或在眼眶減壓手術中收集，這也就意味著這些樣本即不能用于基本診斷，也不能用作監(jiān)測預防。相比之下，常見的生物樣本(如血液、尿液、淚液、糞便等)似乎更適合生物標志物研究。然而，截至目前，這些發(fā)現(xiàn)轉化為臨床應用時仍收效甚微。此外，隨著高通量技術的持續(xù)進步，唾液成為新型生物標志物來源，基于唾液樣本的檢測有望為TAO的診斷開辟光明的前景。值得注意的是，面對如此復雜的疾病，單一生物標志物并非最佳的候選者，通過不同類型的生物標志物組合或將生物標志物與臨床表現(xiàn)和放射學參數(shù)相結合的方式可有效提高診斷和監(jiān)測預后的準確性，從而及時評估病情并給予患者相應個性化治療及干預方案。