一株金霉素降解新菌株的分離鑒定及降解條件優(yōu)化

趙慈，張茹，李思琦，李文進(jìn)，宋哲華，王曉慧，沈鵬*

1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院

2.北京化工大學(xué)水處理環(huán)保材料工程技術(shù)研究中心

3.北京京環(huán)新能環(huán)境科技有限公司

抗生素是抗菌藥物的一種。由于其抑菌效果佳、使用方法簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉被廣泛應(yīng)用[1]。在世界范圍內(nèi)，中國(guó)對(duì)于抗生素類藥物的生產(chǎn)和消費(fèi)尤為廣泛[2]?？股刂饕譃樗沫h(huán)素類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類以及大環(huán)內(nèi)酯類等，而四環(huán)素類抗生素是常使用的抗生素之一，其消耗量接近抗生素總消耗量的1/2[3-6]。四環(huán)素類抗生素主要有金霉素(CTC)、土霉素(OTC)和四環(huán)素(TC)等，它們是一類廣譜抗生素[7]，其中金霉素能夠抑制許多立克次體屬、支原體屬、衣原體屬等病原體。進(jìn)入生物體的抗生素并不能被生物體完全利用，約80%的抗生素會(huì)作為抗生素原藥或者中間代謝物，以動(dòng)物體排泄物的形式進(jìn)入環(huán)境中[8-9]。同時(shí)，環(huán)境中殘留的抗生素將通過(guò)食物鏈富集，再次進(jìn)入到生物體中，會(huì)以不同的方式對(duì)人類和動(dòng)物體產(chǎn)生危害[10-11]。因此，環(huán)境中的抗生素污染問題亟待解決[12]。

目前，對(duì)于被四環(huán)素等抗生素污染的廢水的處理方法主要分為物化法和生物法兩大類。物化法主要包括吸附法[13-14]、光催化法[15-17]、臭氧氧化法[18-19]、電解法[20-21]及膜分離法[22]等。大多數(shù)物化法存在處理效率低、成本高昂、管理復(fù)雜的缺點(diǎn)，故生物法處理抗生素廢水成為研究熱點(diǎn)。生物法主要是依靠微生物的生理活動(dòng)處理抗生素殘留，其憑借安全、高效、成本低廉、無(wú)二次污染等特點(diǎn)成為日前最具發(fā)展?jié)摿斑h(yuǎn)景的處理手段[23-24]。王梓竹等[25]以養(yǎng)殖場(chǎng)新鮮糞便為選菌材料，分離出一株解淀粉芽孢桿菌N2-13，在最優(yōu)降解條件下對(duì)四環(huán)素的降解率達(dá)97.27%；陶美等[26]從活性污泥中分離出克雷伯氏菌TTC-1，在最佳降解條件下對(duì)四環(huán)素的降解率達(dá)94.26%；趙永斌[27]以長(zhǎng)時(shí)間被四環(huán)素類抗生素污染的土壤為原料，分離出木糖氧化無(wú)色桿菌和枯草芽孢桿菌，2 株菌對(duì)四環(huán)素均具有高效降解能力；鄭茂佳[28]以四環(huán)素作為唯一碳源，多次分離純化得到3 株四環(huán)素降解菌，分別命名為TC1、TC2、TC3，在最優(yōu)降解條件下，菌株TC2 對(duì)四環(huán)素降解率達(dá)86.30%。整體而言，即使已經(jīng)分離得到降解能力較強(qiáng)的金霉素降解菌，這些降解菌也存在一些明顯的缺陷。如菌株生長(zhǎng)條件苛刻，難以擴(kuò)大生產(chǎn)利用等，所以進(jìn)一步尋找降解性能好的菌株并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化顯得尤為必要。目前，響應(yīng)面優(yōu)化作為有效的優(yōu)化方法之一，其中的Box-Behnken 方法應(yīng)用較為廣泛，能夠綜合考慮各因素及其相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，近年來(lái)已廣泛用于試驗(yàn)條件及生產(chǎn)過(guò)程等的優(yōu)化[29-30]。

筆者從長(zhǎng)期生產(chǎn)金霉素飼料的河南駐馬店華中正大有限公司的污泥中篩選出若干株能夠降解金霉素的菌株，選擇其中降解效果最好的菌株對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，研究其對(duì)金霉素的降解能力及環(huán)境因素對(duì)降解效果的影響，并對(duì)降解條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，以期為該菌株處理含金霉素廢水提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

樣品污泥取自長(zhǎng)期生產(chǎn)金霉素飼料的河南駐馬店華中正大有限公司污水處理站的好氧池。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨，10.0 g/L；酵母浸粉，5.0 g/L；NaCl，5.0 g/L。

篩選培養(yǎng)基：Na2HPO4，0.5 g/L；NaH2PO4，0.5 g/L；MgSO4，0.2 g/L；NaCl，0.5 g/L；NH4Cl，1.0 g/L；胰蛋白胨，10.0 g/L；金霉素適量。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4，0.4 g/L；NaH2PO4，0.6 g/L；MgSO4，0.2 g/L；NaCl，0.5g/L；NH4Cl，1.0 g/L；CH3COONa，10.0 g/L；金霉素適量。

微量元素溶液：MnCl2·4H2O，0.1 g/L；MgSO4·7H2O，0.5 g/L；ZnSO4·7H2O，0.2 g/L；CuSO4·5H2O，0.5 g/L；FeSO4·7H2O，0.5 g/L；CoCl2·6H2O，0.2 g/L；EDTA，1.0 g/L。

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

本研究所用試驗(yàn)儀器如表1 所示。

表1 試驗(yàn)儀器Table 1 Experimental apparatus

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金霉素降解菌的富集、分離、純化及保存

將5 mL 污泥樣品溶解在95 mL 無(wú)菌水中，置于200 mL 錐形瓶中，于搖床中以150 r/min 的速度攪拌30 min，并用無(wú)菌水梯度稀釋10?7～10?1倍7 個(gè)濃度梯度。將10?7倍的稀釋樣品均勻涂在含50 mg/L金霉素的固體篩選培養(yǎng)基上，設(shè)置3 個(gè)平行樣，在30 ℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，直到菌落長(zhǎng)勢(shì)良好。挑取單個(gè)菌落，在固體篩選培養(yǎng)基中純化5 次，分離出能夠耐受50 mg/L 金霉素的初篩菌株，在富集培養(yǎng)基中接種，并于150 r/min、30 ℃搖床中暗培養(yǎng)，富集純菌株備用。將富集菌株接種于含金霉素的液體培養(yǎng)基，測(cè)定金霉素降解率并篩選出降解效果較好的菌株。將純化所得菌株接種于斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于4 ℃冰箱可保存1 個(gè)月。

1.2.2 金霉素降解菌的鑒定

選取降解率最高的菌株進(jìn)行下一步研究。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行16S rDNA 同源性比對(duì)。PCR 擴(kuò)增細(xì)菌上游引物為(27F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物(1429R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。將測(cè)序結(jié)果提交至BLAST 網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，利用Neighbor Joining tree 方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以金霉素降解率為目標(biāo)進(jìn)行該菌株降解條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)。選擇碳源、溫度、pH、金霉素初始濃度和接種量（體積比，全文同）5 個(gè)常見環(huán)境因素，探討不同環(huán)境因素對(duì)金霉素降解率的影響。設(shè)計(jì)5 因素5 水平試驗(yàn)，將菌體置于不同條件下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察金霉素降解情況，具體見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal test design

1.2.4 不同因素間的相互響應(yīng)

基于正交試驗(yàn)的結(jié)果，選出對(duì)降解金霉素影響最大的3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。利用Design-Expert 10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。為保證模型的準(zhǔn)確性及可利用性，依照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳降解條件設(shè)計(jì)2 組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 金霉素降解菌的篩選

從金霉素制藥廠活性污泥中經(jīng)反復(fù)分離純化，篩選出10 株純菌株。在金霉素初始濃度50 mg/L、30 ℃、150 r/min 的條件下暗培養(yǎng)3 d，測(cè)定各菌株對(duì)金霉素的降解效果（圖1），選擇其中降解率最高的菌株，命名為ZL-1，并作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

圖1 初篩降解菌株對(duì)金霉素的降解率Fig.1 Degradation efficiency map of primary screened strains

2.2 菌株ZL-1 的形態(tài)特征

肉眼觀察菌株ZL-1 的形態(tài)特征為無(wú)色透明，菌落形狀規(guī)則，邊緣光滑整齊，表面濕潤(rùn)易挑起。掃描電子顯微鏡（SEM）放大20 000 倍，顯示菌體呈橢球形，菌體的大小約為1.3 μm×0.77 μm（圖2）。

圖2 菌株ZL-1 形態(tài)Fig.2 Morphological map of strain ZL-1

2.3 菌株ZL-1 的鑒定

革蘭氏染色試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株ZL-1 為革蘭氏陰性菌；通過(guò)16S rDNA 測(cè)序，獲得PCR 的擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為1 442 bp，將測(cè)序結(jié)果提交至BLAST 網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，表明菌株ZL-1 為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），相似度為99.1%，利用Neighbor Joining Tree 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株ZL-1 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ZL-1

2.4 菌株ZL-1 降解條件優(yōu)化

2.4.1 環(huán)境因素對(duì)金霉素降解影響的正交試驗(yàn)

不同環(huán)境因素對(duì)菌株ZL-1 降解金霉素的正交試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。從表3 可以看出，試驗(yàn)23 的降解效果最佳，即在pH 為9，溫度為30 ℃，金霉素初始濃度為50 mg/L，碳源為CH3COONa，接種量為8%時(shí)降解率最高，為74.02%。對(duì)表4 中的極差進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)因素變量的極差由大到小依次為溫度(10.312)、接種量(6.438)、金霉素初始濃度(4.816)、碳源種類(4.514)、pH(2.682)。說(shuō)明溫度、接種量和金霉素初始濃度對(duì)金霉素降解的影響較大，故取此3 個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

表4 各因素不同水平下降解率的均值及極差Table 4 Mean and extreme difference of degradation efficiency in different levels of factors

2.4.2 不同環(huán)境因素之間的響應(yīng)

基于2.4.1 節(jié)正交試驗(yàn)結(jié)果，選取了3 個(gè)環(huán)境因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，取值如表5 所示，試驗(yàn)結(jié)果如表6 所示。利用Design-Expert 10 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差和最小擬二乘法分析，分析結(jié)果如表7 所示。分別以A、B、C為自變量，以降解率為響應(yīng)值，得出二次多項(xiàng)回歸模型為：

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平Table 5 Box-behnken test factors and levels

表6 菌株ZL-1 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 6 Response surface analysis result of strain ZL-1

式中：Y為金霉素降解率，%；A為溫度，℃；B為金霉素初始素濃度，mg/L；C為接種量，%。

表7 中測(cè)定的回歸系數(shù)（R2）為0.969 5，表明96.95%的響應(yīng)值符合該模型，經(jīng)校正后測(cè)定系數(shù)為0.930 4。該方程模型可用于分析和預(yù)測(cè)降解金霉素的最佳溫度、金霉素初始濃度、接種量和降解率。

表7 菌株ZL-1 降解金霉素的最小擬二乘法分析Table 7 Minimum quasi-multiplied method for degrading chlortetracycline of strain ZL-1

最小擬二乘法的檢驗(yàn)結(jié)果表明，回歸方程的一次項(xiàng)A為極顯著，B不顯著，C較顯著，二次項(xiàng)A2、B2和C2分別為極顯著、較顯著和顯著。結(jié)合響應(yīng)面分析得到的3D 圖形（圖4）可以看出各因素的相互作用，且3D 曲線的陡峭程度與試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響成正比，可知溫度和金霉素初始濃度相互作用顯著，且對(duì)金霉素的降解率影響較大。金霉素的降解率在中心點(diǎn)附近時(shí)達(dá)到最大值，即只有在適合的溫度、接種量和金霉素初始濃度下，菌株ZL-1 對(duì)金霉素的降解率才能達(dá)到最高。

從圖4(a)可以看出，隨著溫度的升高，金霉素的降解率基本呈上升趨勢(shì)，當(dāng)金霉素的降解率達(dá)到最高時(shí)，溫度為34.409 ℃。隨著金霉素初始濃度的增加，金霉素的降解率先增加后減小，當(dāng)金霉素初始濃度為134.864 mg/L 時(shí)，金霉素的降解率達(dá)到最高。

從圖4(b)可以看出，隨著溫度的升高，金霉素的降解率升高，當(dāng)金霉素的降解率最高時(shí)，溫度為34.409 ℃。隨著接種量的增加，金霉素降解率先增加后減小，當(dāng)接種量為5.223%時(shí)，降解率最高。

圖4 各因素及其交互作用的響應(yīng)面Fig.4 Factors and their interaction in response surface chart

從圖4(c)可以看出，隨著金霉素初始濃度的增加，金霉素的降解率先增加后減小。當(dāng)金霉素初始濃度為134.864 mg/L 時(shí)，金霉素的降解率最高。隨著接種量的增加，金霉素的降解率先增加后減小。當(dāng)接種量為5.223%時(shí)，金霉素的降解效率最高。

綜上，當(dāng)金霉素初始濃度為134.864 mg/L，反應(yīng)溫度為34.409 ℃,接種量為5.223%時(shí)，菌株ZL-1 對(duì)金霉素的降解率最高，為93.723%。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)確定的3 個(gè)因素及響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳降解條件，確定了菌株ZL-1 的最優(yōu)降解條件，即金霉素初始濃度為134.864 mg/L，反應(yīng)溫度為34.409 ℃,接種量為5.223%。在該降解條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到金霉素的實(shí)際降解率為93.70%，預(yù)測(cè)降解率為93.723%，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際的降解率比較貼合。

3 結(jié)論

（1）從長(zhǎng)期生產(chǎn)金霉素的制藥廠的污泥篩選得到1 株能夠高效降解金霉素的菌株ZL-1。對(duì)ZL-1進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色和16S rDNA 序列分析。結(jié)果表明該菌落無(wú)色透明，形狀規(guī)則，邊緣光滑整齊，表面濕潤(rùn)易挑起；菌株ZL-1 為革蘭氏陰性菌、不動(dòng)桿菌屬。

（2）通過(guò)正交試驗(yàn)研究了碳源、溫度、pH、金霉素初始濃度、接種量對(duì)金霉素降解率的影響，結(jié)果表明，溫度、接種量和金霉素初始濃度對(duì)該菌株降解金霉素的影響較大。溫度和金霉素初始濃度交互作用顯著，對(duì)金霉素的降解率影響最大。

（3）以正交試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)，采用響應(yīng)面優(yōu)化該菌對(duì)金霉素的降解條件并進(jìn)行驗(yàn)證，確定了降解金霉素的最佳條件，金霉素初始濃度為134.864 mg/L，溫度為34.409 ℃，接種量為5.223%，在此條件下，試驗(yàn)測(cè)得金霉素實(shí)際降解率為93.70%，與模型預(yù)測(cè)的降解率（93.723%）較為符合。