西藏地區(qū)藏族人群胃癌組織中H3K27me3表達(dá)水平及其臨床意義

羅含歡，師 杰，邊巴扎西，楊 旭，尼瑪卓瑪，王 倩，李 梅，王 寒，廖瑞倩，次仁曲珍

西藏自治區(qū)人民醫(yī)院 1病理科 3普外科，拉薩 850000 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 2病理科 4肝臟外科，北京 100730

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其在中國乃至全球均具有較高的發(fā)病率和疾病負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球胃癌發(fā)病率居所有癌癥第5位，死亡率居第4位；在中國，胃癌發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中均居前3位，嚴(yán)重威脅居民的生命健康[1]。胃癌在我國的流行情況存在明顯地域差異，調(diào)查顯示西藏自治區(qū)拉薩市社區(qū)人群胃癌發(fā)病率明顯高于全國平均水平[2]；作為西藏最大的三甲醫(yī)院，西藏自治區(qū)人民醫(yī)院病理科有存檔記錄的惡性腫瘤病理資料中，胃癌的占比最高，提示西藏為胃癌的高發(fā)區(qū)，腫瘤防治任務(wù)艱巨。

近年來，表觀遺傳學(xué)研究結(jié)果證實(shí)組蛋白修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3- 5]，針對組蛋白乙酰化酶抑制劑的療法在T細(xì)胞淋巴瘤[6- 7]、多發(fā)性骨髓瘤[8]治療，逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌耐藥性[9- 10]等方面表現(xiàn)出令人矚目的臨床療效，多種組蛋白修飾相關(guān)酶及蛋白已成為潛在的腫瘤治療新靶點(diǎn)。組蛋白H3的N末端賴氨酸殘基K27是最常見的甲基化修飾位點(diǎn)，經(jīng)三甲基化修飾后生成H3K27me3，能抑制下游靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)，參與多種腫瘤發(fā)生與發(fā)展，但其在不同瘤種中的表達(dá)水平及臨床意義不盡相同。研究者已針對H3K27me3與胃癌的相關(guān)性進(jìn)行了探索，多項(xiàng)研究顯示，H3K27me3在胃癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)[11- 12]，且其高表達(dá)與腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、pTNM分期等多種病理特征相關(guān)，可作為此類人群預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因子[13]。但既往研究主要針對漢族人群，西藏地區(qū)高寒、低壓、低氧的特殊環(huán)境，使得長期居住于此的藏族人群呈現(xiàn)出特異性生理特征和疾病譜，目前尚缺乏西藏地區(qū)藏族人群胃癌組織中H3K27me3表達(dá)情況及其臨床意義的研究。本研究收集了西藏自治區(qū)人民醫(yī)院連續(xù)3年胃癌患者的臨床與病理資料，針對上述問題進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為回顧性分析。研究對象為2019年8月至2021年8月西藏自治區(qū)人民醫(yī)院診治的胃癌患者及同期確診的非胃癌患者。胃癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均行手術(shù)切除，組織病理證實(shí)為原發(fā)性胃癌；(2)藏族患者且長期生活在西藏地區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他系統(tǒng)腫瘤者；(2)術(shù)前接受過化療者；(3)臨床與病理資料存在明顯缺失的患者。非胃癌患者為隨機(jī)選取同期行胃活檢檢查，證實(shí)為非胃癌的藏族居民。

本研究已通過西藏自治區(qū)人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號：ME-TBHP- 21-KJ- 054)，并豁免患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

收集胃癌患者的年齡、性別、診斷結(jié)果等基本資料，以及腫瘤最大徑、Lauren分型、分化程度、浸潤深度、TNM分期等病理特征。其中腫瘤分期、分化程度、分型等的判讀標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2019年第五版《世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類》[14]。

1.2.2 H3K27me3免疫組化檢測

取胃癌患者手術(shù)切除腫瘤組織、癌旁正常胃黏膜組織(距癌灶邊緣3～5 cm)及非胃癌患者正常胃黏膜組織活檢標(biāo)本，經(jīng)4%中性甲醛液固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，采用EnVision兩步法進(jìn)行H3K27me3免疫組化測定。采用二甲苯對石蠟切片進(jìn)行脫蠟至水，PBS洗滌3次，每次2 min；加入3%雙氧水，室溫下孵育15 min，PBS洗滌3次，每次2 min；將切片置于含檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中熱修復(fù)15 min，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次2 min；滴加H3K27me3單克隆抗體(克隆號：RM175)，37 ℃水浴45 min，滴加生物素化二抗工作液孵育25 min，PBS洗滌3次，每次2 min。去除PBS液，每張切片滴加1滴新配置的DAB顯色液，5 min后用蒸餾水清洗，終止顯色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染2 min，依次進(jìn)行1%鹽酸酒精分化、氨水反藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 結(jié)果判讀

本研究采用陽性細(xì)胞半定量分級法，即結(jié)合細(xì)胞核著色強(qiáng)度與著色細(xì)胞數(shù)量綜合判定H3K27me3表達(dá)情況[15]。(1)著色強(qiáng)度評分：細(xì)胞核未著色為0分，淡黃色顆粒狀著色為1分，棕黃色顆粒狀著色為2分，深褐色顆粒狀著色為3分；(2)著色細(xì)胞數(shù)量評分：靶組織中H3K27me3著色細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，≥50%為3分。將著色強(qiáng)度評分與著色細(xì)胞數(shù)量評分相乘，作為H3K27me3表達(dá)水平的判讀依據(jù)：0～2分為低表達(dá)，3～9分為高表達(dá)。

1.3 樣本量估計(jì)

本研究為病例對照試驗(yàn)，依據(jù)胃癌組織及正常胃黏膜組織中H3K27me3高表達(dá)率進(jìn)行樣本量估算。查閱文獻(xiàn)，H3K27me3在胃癌中高表達(dá)率為56.4%～80.3%，癌旁正常胃黏膜中為7.25%～25%[16- 17]。雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05，β=0.1，兩組樣本量比例為1∶1，經(jīng)計(jì)算兩組最低樣本量均為51例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料(年齡、腫瘤最大徑)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，H3K27me3表達(dá)情況及組織學(xué)分級、分化程度等計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)和/或百分?jǐn)?shù)表示。不同組織或不同病理特征之間H3K27me3高表達(dá)率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的藏族胃癌患者54例，藏族非胃癌患者55例。胃癌患者中，男性37例、女性17例；年齡(54.8±9.2)歲(范圍：27～70歲)；腫瘤最大徑(4.0±1.8)cm(范圍：0.9～9.2 cm)；早期胃癌10例(18.5%),中晚期胃癌44例(81.5%)；組織學(xué)分級：中-高分化腺癌23例(42.6%)，低分化腺癌/印戒細(xì)胞癌31例(57.4%)；Lauren分型：腸型21例(38.9%)，彌漫型18例(33.3%)，混合型15例(27.8%)；神經(jīng)侵犯34例(63.0%)；脈管侵犯23例(42.6%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性38例(70.4%)；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期26例(48.1%)，Ⅲ～Ⅳ期28例(51.9%)。

2.2 不同組織中H3K27me3表達(dá)水平比較

H3K27me3定位于細(xì)胞核,其陽性表達(dá)時(shí)細(xì)胞核呈棕黃色顆粒狀著色,細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)不著色(圖1～3)。免疫組化結(jié)果顯示，胃癌組織中H3K27me3低表達(dá)19例(35.2%,19/54),高表達(dá)35例(64.8%，35/54)；癌旁正常胃黏膜組織中，H3K27me3低表達(dá)38例(70.4%，38/54)，高表達(dá)16例(29.6%，16/54)；非胃癌患者正常胃黏膜組織中，H3K27me3低表達(dá)36例(65.5%，36/55)，高表達(dá)19例(34.5%，19/55)。

圖1 H3K27me3蛋白在胃癌組織中表達(dá)的免疫組化圖(EnVision,×200)

卡方檢驗(yàn)顯示，胃癌組織中H3K27me3高表達(dá)率高于癌旁正常胃黏膜組織(P<0.001)和非胃癌患者正常胃黏膜組織(P=0.002)，H3K27me3高表達(dá)率在癌旁正常胃黏膜組織與非胃癌患者正常胃黏膜組織之間無顯著差異(P=0.683)。

2.3 H3K27me3表達(dá)水平與胃癌患者臨床與病理特征的相關(guān)性

H3K27me3表達(dá)水平在不同年齡、性別及Lauren分型、分化程度、浸潤深度胃癌患者之間均無顯著差異(P均>0.05),見表1。

表1 不同臨床與病理特征西藏地區(qū)藏族胃癌患者H3K27me3表達(dá)情況比較[n(%)]

圖2 H3K27me3蛋白在癌旁正常胃黏膜組織中表達(dá)的免疫組化圖(EnVision，×100)

圖3 H3K27me3蛋白在非胃癌患者正常胃黏膜組織中表達(dá)的免疫組化圖(EnVision，×100)

3 討論

作為一種組蛋白修飾因子，探索H3K27me3與腫瘤的關(guān)系可為該疾病的診治提供新思路。鑒于西藏為胃癌高發(fā)區(qū)，本研究對西藏地區(qū)藏族人群中H3K27me3表達(dá)水平及其與病理特征的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果顯示相較癌旁正常胃黏膜組織(29.6%)和非胃癌患者正常胃黏膜組織(34.5%)，藏族居民胃癌組織中H3K27me3高表達(dá)率(64.8%)顯著升高，但其表達(dá)水平與臨床及病理特征無明顯相關(guān)。

H3K27me3是一種與基因抑制密切相關(guān)的修飾蛋白，由多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)所產(chǎn)生。PRC2由果蠅Zeste 基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)、胚胎外胚層發(fā)育蛋白(embryonic ectoderm development，EED)及Zeste基因抑制子基因12(suppressor of zeste gene 12,Suz12)三部分核心亞基組成，任一組分改變(如EZH2過表達(dá)或功能改變，EED突變等)均可能導(dǎo)致H3K27me3表達(dá)失衡，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖和分化過程[18]，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展[19]。對文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)檢索后發(fā)現(xiàn)6篇胃癌組織中H3K27me3表達(dá)變化的報(bào)道[11- 13,16- 17,20]。Zhang等[11]通過染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合芯片技術(shù)檢測了胃癌患者不同基因中H3K27me3表達(dá)水平，結(jié)果顯示與正常胃黏膜比較，胃癌組織128種基因存在H3K27me3差異性表達(dá)，其中119種基因表達(dá)升高，9種基因表達(dá)降低；128種基因包括癌基因、腫瘤抑制基因、凋亡調(diào)節(jié)基因、蛋白轉(zhuǎn)錄和合成基因以及DNA修復(fù)基因等，認(rèn)為H3K27me3可作為基于表觀遺傳學(xué)機(jī)制胃癌治療的潛在生物標(biāo)志物或有前景的治療靶點(diǎn)。Huang等[12]整合了芯片技術(shù)與生物信息分析結(jié)果，以探索胃腺癌的發(fā)生機(jī)制，結(jié)果證實(shí)胃腺癌差異性表達(dá)基因主要由H3K27me3所調(diào)控，進(jìn)一步驗(yàn)證了該蛋白在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮的重要作用。He等[17]基于117例患者的資料比較了胃癌組織與癌旁組織中H3K27me3表達(dá)差異，結(jié)果顯示前者的H3K27me3陽性率顯著升高(56.4%比7.25%)。Li等[13]研究得到了類似結(jié)果，相較癌旁正常組織，胃癌組織中H3K27me3表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(7.338±0.228比6.034±0.234，P<0.001)。本研究免疫組化結(jié)果支持上述結(jié)論[13,16- 17,20]，再次驗(yàn)證H3K27me3高表達(dá)參與了胃癌發(fā)生的調(diào)控。

針對H3K27me3表達(dá)率與胃癌患者臨床及病理特征的相關(guān)性，研究者亦進(jìn)行了多方面探索。高福利等[16]對61例胃癌患者的臨床資料總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，H3K27me3陽性表達(dá)與腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、TNM分期等均具有相關(guān)性，而與分化程度無相關(guān)性。張寧等[20]則認(rèn)為，胃癌組織H3K27me3陽性表達(dá)率僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者性別、年齡等臨床資料及腫瘤直徑、浸潤深度、Lauren分型、分化程度、TNM分期等病理資料均無顯著相關(guān)性。He等[17]將免疫組化結(jié)果與臨床、病理資料相結(jié)合后發(fā)現(xiàn)，H3K27me3表達(dá)水平與腫瘤T分期及臨床分期均呈正相關(guān)，與分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無相關(guān)性；多因素Cox回歸分析顯示H3K27me3高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因子。根據(jù)上述多項(xiàng)研究報(bào)道可明確，胃癌組織中H3K27me3水平與多種病理特征相關(guān)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，不同研究之間結(jié)果不完全一致，可能與胃癌分期或H3K27me3測定方法不同有關(guān)。本研究暫未發(fā)現(xiàn)H3K27me3表達(dá)水平與胃癌患者臨床及病理特征具有相關(guān)性，可能與樣本量較小或H3K27me3表達(dá)譜存在民族、地域差異有關(guān)。

雖然本研究是目前在西藏地區(qū)藏族胃癌患者中檢測H3K27me3表達(dá)變化樣本量最大的研究，但亦存在局限性：(1)為回顧性研究，可能存在信息偏倚；(2)未進(jìn)行多因素分析，H3K27me3表達(dá)水平與胃癌患者病理特征的相關(guān)性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，西藏地區(qū)藏族人群胃癌組織中H3K27me3表達(dá)水平顯著增高，為胃癌分子機(jī)制的研究提供了新思路，并為以組蛋白修飾酶為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了客觀依據(jù)。H3K27me3表達(dá)水平與藏族胃癌患者病理特征的相關(guān)性仍有待多中心、前瞻性、大樣本研究進(jìn)一步闡明。

作者貢獻(xiàn)：羅含歡負(fù)責(zé)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、免疫組化結(jié)果判讀及論文撰寫；師杰負(fù)責(zé)免疫組化結(jié)果判讀和論文修訂；楊旭進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；邊巴扎西、尼瑪卓瑪、王倩、王寒、廖瑞倩、次仁曲珍、李梅負(fù)責(zé)臨床病理資料收集、免疫組化制片。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突